一种烟草苗期青枯病抗性鉴定的方法与流程

技术特征：
1.一种烟草苗期青枯病抗性鉴定的方法，其特征在于，包括小十字期移栽漂浮育苗、大十字期标准化根系微创后高浓度定株接种烟草青枯菌构建微病圃、高温高湿诱发病害、系统病害调查评价抗性等4个步骤，具体包括：(a)小十字期移栽漂浮育苗：将烟草种子撒播于装满湿润基质的容器，每个容器播1种品种或材料，在人工气候室培育，播种后每5-7d施入250-300倍可溶性育苗肥n:p2o5:k2o为20:20:20 1次，浅层湿润育苗至小十字期，挑选健壮、整齐一致的幼苗移栽至漂浮盘，漂浮于水深4-6cm的漂浮池，覆透明地膜保湿36-48h，设置透气孔；继续培养3-4d，揭膜，移栽后每7-10d施入100-150倍n:p2o5:k2o为20:20:20可溶性育苗肥1次，培育至大十字期，用于接种；(b)大十字期标准化根系微创后高浓度定株接种烟草青枯菌构建微病圃：步骤(a)培育至大十字期烟苗创伤前，漂浮盘沥水20-24h，微创低剂量加注高浓度青枯菌悬浮液至每株烟苗伤根处的四周；(c)高温高湿诱发病害：接种后诱发病害高温为30
±
2℃，光周期为12-16h光照/8-12h黑暗、光照度为2000-2600lx；高湿是通过降低漂浮池水位、幼苗最高处到漂浮池池顶的距离5-10cm、池水自然挥发保留于漂浮池内的幼苗茎叶，维持基质表面的润湿，根系的基质渗透吸水至饱和维持湿度；(d)系统病害调查评价抗性：继续以步骤(c)所述的温湿度和光照条件培育步骤(c)处理的烟苗，每10-15d施入200-300倍n:p2o5:k2o为20:20:20可溶性育苗肥1次；每3-10d按病害严重度调查记录病情，计算病情指数，30d病害调查共3-9次，以时间间隔与病情指数计算病害曲线下面积a
udpc
和病程相对抗性指数r
ricd
，基于不同抗性水平的对照品种数值范围划定抗性水平。2.根据权利要求1所述的烟草苗期青枯病抗性鉴定方法，其特征在于，步骤(a)所述的撒播的容器为花盆或筛筐；所述的漂浮盘为96-200孔商业化烟草漂浮育苗盘；所述的材料在抗性筛查时每品种或材料至少18株，复筛时每品种或材料至少18株；至少3次重复。3.根据权利要求1所述的烟草苗期青枯病抗性鉴定方法，其特征在于，步骤(b)所述的青枯菌悬浮液，采用保存的青枯菌在含有ttc的cpg培养基上28℃培养48h活化1-2次，挑取典型青枯单菌落用市售的青枯病检测试纸条测定为阳性后，再在无ttc的cpg培养基平板上高密度划线扩繁，将菌苔刮下，灭菌水调节青枯菌浓度，青枯菌浓度以od
600
快速计测、稀释涂布于无ttc的cpg培养基平板上计数验证。4.根据权利要求权1所述的烟草苗期青枯病抗性鉴定方法，其特征在于，步骤(d)所述的病害严重度，分级方法为：0级：全株无病；1级：病株1/2以下叶片凋萎；3级：病株1/2-2/3叶片凋萎；5级：病株2/3以上叶片凋萎；7级：病株叶片全部凋萎；9级：病株基本枯死；所述的病情指数(d
i
)，采用如下公式计算：
其中，i：病情级数(0-9)；x
i
：i级植株株数；所述的病情指数感病对照品种至少有1次调查时不低于60，烟草苗期青枯病抗性鉴定有效，否则为无效。5.根据权利要求1所述的烟草苗期青枯病抗性鉴定方法，其特征在于，步骤(d)所述的病害曲线下面积a
udpc
公式如下：其中，y
i
为第i次记载的病情指数，包括接种当天或前/后1天的初始病害调查，该次的病情指数为0，默认为第1次，接种后顺延，y
i 1
为第i 1次记载的病情指数，t
i 1
－t
i
为第i 1次与第i次记载的间隔时间d；病程相对抗性指数r
ricd
＝100
×
(a
udpcck
—a
udpct
)/a
udpcck
，式中a
udpcck
为感病对照品种病害曲线下面积，a
udpct
为测试品种病害曲线下面积；所述的基于不同抗性水平对照品种数值范围划定抗性水平，分为5个等级：免疫或高抗(i)：r
ricd 100；抗(r)：r
ricd 30.1-99.9；中抗(mr)：r
ricd 20.1-30.0；中感(ms)：r
ricd 10.1-20.0；感(s)：r
ricd 10.0及以下，含负数。6.根据权利要求5所述的烟草苗期青枯病抗性鉴定方法，其特征在于，所述的感病对照品种为长脖黄；所述的不同抗性水平的对照品种为多个不同单位多次文献报道、反复鉴定验证的抗、中抗、中感、感病品种；其中抗病品种d101可以作为抗性对照品种验证烟草苗期青枯病抗性鉴定结果的可靠性。7.根据权利要求1所述的烟草苗期青枯病抗性鉴定方法，其特征在于，步骤(a)所述的人工气候室培育为25
±
2℃、光周期为12-16h光照/8-12h黑暗、光照度1000-1600lx；覆透明地膜后在膜上均匀地戳100mm2透气孔、每漂浮盘等面积的膜上戳5-7个透气孔。8.根据权利要求1所述的烟草苗期青枯病抗性鉴定方法，其特征在于，步骤(a)所述的浅层湿润育苗为育苗容器下沉贴于水层底部，通过基质毛细管渗透吸水湿润基质至水饱和，通常出苗前水深为基质厚度的1/3-1/2，出苗后水深为基质厚度的1/6-1/4。9.根据权利要求1所述的烟草苗期青枯病抗性鉴定方法，其特征在于，步骤(b)所述的微创低剂量加注高浓度青枯菌悬浮液至每株烟苗伤根处的四周，具体为，创伤时采用1000μl或1250μl移液器配套枪头的尖端套牢200μl枪头以30-45
°
的角度距离烟茎3-5mm处对称戳2个深35-40mm的小坑伤根；配50ml枪头或100ml玻璃移液管的连续加样器2.0-2.5ml的低剂量加注1-3
×
109cfu/ml的高浓度青枯菌悬浮液至每株烟苗伤根处外2-3mm的四周。10.根据权利要求1所述的烟草苗期青枯病抗性鉴定方法，其特征在于，步骤(b)所述的cpg培养基组分为蛋白胨10g，葡萄糖10g，酪朊水解物1g，琼脂粉17g，水1 000ml，ph 7.0。

技术总结
本发明公开了一种烟草苗期青枯病抗性鉴定的方法，属于植物抗病性鉴定技术领域，包括小十字期移栽漂浮育苗、大十字期标准化根系微创后高浓度定株接种青枯菌构建微病圃、高温高湿诱发病害、系统病害调查评价抗性等4个步骤。本发明将青枯病抗性鉴定与漂浮育苗融合在一起具有操作程序化、降本、省空间、省工、选择效率高、烟草青枯病抗性表型鉴定准确、稳定、可比性强等优点，从播种到鉴定完成通常2个月就可结束，提高了烟草青枯病抗性鉴定的时效性和规模化，是值得推广的方法。是值得推广的方法。是值得推广的方法。


技术研发人员：方敦煌 卢灿华 肖炳光 任民 童治军 刘勇 曾建敏 吴兴富 白戈
受保护的技术使用者：云南省烟草农业科学研究院
技术研发日：2022.03.30
技术公布日：2022/7/8