纳米氧化铈在促进植物侧根发生中的应用

1.本发明属于肥料技术领域，尤其涉及纳米氧化铈在促进植物侧根发生中的应用。


背景技术：

2.在人口不断增加、耕地面积日趋减少的情况下，对作物产量及品质的要求越来越高。根系作为植物的主要器官之一，良好健壮的根系是作物快速生长，丰产丰收的基础。目前，促进根系生长的方式主要有：(1)施用生根剂及外用生长素类似物；(2)加强栽培管理措施；(3)遗传育种手段选育根系发达品种或基因工程改良作物。
3.然而这些措施存在吸收利用率低、资源浪费、环境不友好、时间长、改良困难等问题。近年来，纳米材料在作物生产中的应用受到越来越多的关注。它通过纳米农药的发展在植物保护领域发挥作用，而纳米肥料施用彻底改变了农业营养形式。多种纳米材料已被报道能够调控植物生长，提高营养质量和生长速度，但纳米材料在植物根系中的施用及对侧根发生的作用知之甚少。探究一种合适的纳米材料及施用方式促进根系生长显得尤为重要。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种纳米氧化铈在促进植物侧根发生中的应用，能够有效促进植物侧根发生，进而促进植物的生长。
5.本发明提供了一种纳米氧化铈在促进植物侧根发生的根系施用肥中的应用，所述纳米氧化铈为带负电的纳米氧化铈。
6.优选的，所述带负电的纳米氧化铈的粒度为1～10nm。
7.优选的，所述带负电的纳米氧化铈的制备方法，包括如下步骤：
8.将硝酸铈的水溶液和聚丙烯酸的水溶液混合，得到混合液；
9.将所述混合液与质量浓度为30％的氢氧化铵溶液混合进行反应，得到带负电的纳米氧化铈。
10.优选的，所述硝酸铈和聚丙烯酸的质量比为1～2:5～6。
11.优选的，所述硝酸铈和质量浓度为30％的氢氧化铵溶液的质量体积比为1～2g:12～18ml。
12.优选的，所述反应的时间为20～28h，温度为20～30℃。
13.优选的，所述带负电的纳米氧化铈的施用浓度为0.05～0.1mm。
14.与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
15.本发明提供的促进植物侧根发生的根系施用肥，该施用肥中的功效成分为纳米氧化铈，纳米氧化铈能够改变根系中的h2o2含量及o
2-的分布，进而使o
2-在成熟区的侧根原基发育早期(第1-4阶段)及侧根原基出现阶段累积，促进侧根的发生。
附图说明
16.图1为实施例1中的pnc、ceo2nps的tem图像；
17.图2为实施例1中采用紫外可见分光光度测定pnc、dil-pnc、anc的特征吸收峰；
18.图3为实施例1中pnc、anc和ceo2nps的粒径；
19.图4为实施例1中pnc、anc和ceo2nps的电位；
20.图5为实施例2中不同氧化铈纳米颗粒处理拟南芥幼苗根系的结果；其中图a为不同氧化铈纳米颗粒处理拟南芥幼苗根系7d表型图；b:不同氧化铈纳米颗粒处理拟南芥幼苗根系7d侧根数量；c:不同氧化铈纳米颗粒处理拟南芥幼苗根系7d干鲜重；
21.图6为实施例2中pnc处理拟南芥7d后根系中h2o2含量；其中a:dcf染色定量根系中的h2o2；b:dcf荧光值统计；c:拟南芥主根及侧根中的h2o2含量；
22.图7为实施例2中pnc处理拟南芥7d后根系中o
2-含量；其中a:dhe染色定量根系中的h2o2；b:dhe荧光值统计；c:拟南芥主根及侧根中的o
2-含量；
23.图8为实施例2中施用不同浓度pnc对拟南芥侧根发生的影响；其中:a:pnc处理拟南芥7d后的根长及侧根密度；b:pnc处理拟南芥7d后表型图；
24.图9为实施例2中dii-pnc在对拟南芥根系中的pnc定位图；
25.图10为实施例3中施用不同浓度pnc的水稻的表型图及侧根扫描图；
26.图11为4中施用不同浓度pnc的油菜的表型图及侧根扫描图。
具体实施方式
27.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.本发明提供了一种纳米氧化铈在促进植物侧根发生中的应用，所述纳米氧化铈为带负电的纳米氧化铈。
29.在本发明中，带负电的纳米氧化铈进入主根及侧根原基部位，清除根系内的h2o2含量并促使o
2-在成熟区的侧根原基中累积促进拟南芥侧根发生。
30.在本发明中，所述纳米氧化铈可以单独施加到作物上来促进植物侧根发生，也可与其他成分混合，制备成肥料、营养液等，来促进植物侧根发生。
31.在本发明中，所述带负电的纳米氧化铈的粒度为1～10nm。
32.在本发明中，所述带负电的纳米氧化铈的制备方法，优选包括如下步骤：
33.将硝酸铈的水溶液和聚丙烯酸的水溶液混合，得到混合液；
34.将所述混合液与质量浓度为30％的氢氧化铵溶液混合进行反应，得到带负电的纳米氧化铈。
35.本发明优选将硝酸铈的水溶液和聚丙烯酸的水溶液混合，得到混合液。本发明对所述硝酸铈的水溶液中硝酸铈的浓度及聚丙烯酸的水溶液中聚丙烯酸的浓度没有特殊限定，能够溶解硝酸铈和聚丙烯酸即可。在本发明中，所述硝酸铈和聚丙烯酸的质量比优选为1～2:5～6。
36.得到混合液后，本发明优选将所述混合液与质量浓度为30％的氢氧化铵溶液混合
进行反应，得到带负电的纳米氧化铈。在本发明中，所述硝酸铈和质量浓度为30％的氢氧化铵溶液的质量体积比优选为1～2g:12～18ml。在本发明中，所述反应的时间优选为20～28h，更优选为24h；所述反应的温度优选为20～30℃，更优选为23～28℃。
37.在本发明中，所述带负电的纳米氧化铈的施用浓度优选为0.05～0.1mm。
38.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
39.实施例1
40.1、制备带负电的聚丙烯酸包被的纳米氧化铈颗粒(pnc)
41.将1.08g硝酸铈(sigma-aldrich,99％)和4.5g聚丙烯酸(1800mw,sigma-aldrich)分别溶解在2.5ml(a液)和5.0ml(b液)去离子水中。使用涡旋仪以2000转/分的速度将a、b两种溶液充分混合15min，并将混合液逐滴添加到含有15毫升30％氢氧化铵溶液的50毫升烧杯中。混合物在室温下以500转/分搅拌24小时，接着将其分装至1.5ml离心管中以4000g/分离心1小时，吸取上清液弃掉离心管底部约100微升的液体。将上清吸至超滤管(mwco 30k,millipore inc.)中，超滤管以4500rpm的速度离心6个循环(每45分钟循环一次)。循环结束后利用分光光度计测定溶液吸收峰值，根据比尔-兰博特定律计算浓度，最后将其储存在4℃冰箱中以供使用。
42.2、制备带正电的氨基化的氧化铈纳米颗粒(anc)
43.将3.5ml的5mm pnc与1.5ml的超纯水在环境温度下以500rpm的转速混合2分钟。然后，再以500rpm连续搅拌期间，将306.8mg 1-乙基-3-(3二甲基氨基丙基)碳二亚胺(sigma-aldrich)(edc)溶于0.5ml mes缓冲液(100mm，ph 6.0)中，滴加到混合物中搅拌4分钟。然后再以500rpm连续搅拌下，将800mm(6ml)乙二胺(eda,99％,sigma-aldrich)(ph 6.8用hcl调节)逐滴添加到最终反应混合物中，在环境温度下再持续搅拌3小时。将得到的溶液转移到1.5ml离心管中，并以4500rpm的速度离心15分钟以去除任何碎屑和大团块。通过使用超滤管(mwco 30k，millipore inc.)在5个循环(每个循环15分钟)中以4500rpm(allegra x30，beckman)离心除去过量的eda和其他试剂，纯化上清液。循环结束后利用分光光度计测定溶液吸收峰值，根据比尔-兰博特定律计算浓度，最后将其储存在4℃冰箱中以供使用。
44.3、ceo2nps(sigma-aldrich)是购置于公司的商品化氧化铈纳米颗粒，其标注粒径《25nm，实际测量粒径约为60-70nm，微弱负电。
45.4、制备dii-pnc
46.用dii(1,1
′‑
dioctadecyl-3,3,3
′
,3
′
tetramethylindocarbocyanine，1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'四甲基吲哚羰花青，一种荧光基团)标记pnc。将4ml，0.5mm pnc和200μl、0.3mg/ml dii(溶解在dmso中)放在20ml玻璃小瓶中，以1000rpm混合1分钟。使用10kda过滤器(4500rpm，5分钟一次，至少五次)纯化所得混合物以去除游离化学物质。最终溶液标记为dii-pnc并储存在4℃的冰箱中以供进一步使用。
47.对上述制备得到的pnc、ceo2nps进行tem检测，具体结果如图1所示。由图1可以看出，电镜结果显示，pnc的粒径小于10nm且形状是规则的椭圆形，而ceo2nps粒径较大且形状各异。
48.分别采用紫外可见分光光度测定pnc、dil-pnc和anc的特征吸收峰，具体结果如图2所示。由图2可以看出，pnc特征吸收峰在271nm左右，anc的吸收峰为264nm，dil标记的pnc
除了具备pnc的特征峰以外，还在520nm、570nm显示了dil特征吸收峰。
49.分别采用激光粒度仪对pnc、anc和ceo2nps的粒径进行测定，具体结果如图3所示。由图3可以看出，pnc及anc的水合粒径都在10nm以下，ceo2nps的粒径约为87nm。
50.分别对pnc、anc和ceo2nps的电位进行测定，具体结果如图4所示。由图4可以看出，pnc显示为负电位约为-40mv，anc显示为正电约为 30mv，ceo2nps显示为弱的负电位约为-10mv。
51.实施例2
52.pnc对拟南芥侧根发生的测定
53.1.制备ms培养基
54.按照4.4g/l ms(coolaber，beijing,china)、10g/l蔗糖、4g/l phytagel(coolaber，beijing,china)的比例配置ms培养基，ph调至5.7-6.0之间，121℃，15min高温灭菌。灭菌后ms培养基冷却至60℃时，使用50ml离心管(同步灭菌)定容30ml的培养基。
55.将上述制备的ms培养基作为对照培养基，按照0.1mm的施用浓度分别向上述ms培养基中加入pnc、cecl3、anc和ceo2nps纳米材料作为实验组，混匀后倒入10cm*10cm的无菌方形培养皿中，冷却后使用。所有操作均在超净工作台中进行，严格进行无菌操作。
56.2.拟南芥种子消毒、播种及处理
57.本专利中所使用的拟南芥为col-0型。拟南芥种子用70％乙醇浸泡吸打混匀10s，无菌水冲洗2次，5％naclo浸泡上下轻晃10min，无菌水冲洗3次。用1ml枪头将种子均匀撒播至ms方形培养基中，吹干表面水分，封口膜封盖，4℃黑暗环境春化3天后放至光下(23℃，14/10h，200μmol m-2
s-1
)培养5天。拟南芥幼苗在光下生长5天后，挑选长势及根系长度均匀一致的拟南芥幼苗分别移至上述实验组培养基及对照组培养基上(每板放置6颗苗，对照组及处理组各4板)，光下竖直培养7天，统计对照组及处理组拟南芥幼苗根系表型图、侧根数量及干鲜重，具体结果如图5所示。由表5可以看出，带负电的氧化铈纳米颗粒pnc(-)能够促进拟南芥侧根发生。
58.3.拟南芥根系活性氧成像
59.使用激光共聚焦显微镜对拟南芥根系内活性氧进行成像。使用二氢乙锭(dhe)和2
′
,7
′‑
二氯二氢荧光素二乙酸酯(h2dcfda)分别作为o
2-和h2o2的荧光染料。取在ms、pnc(0.1mm) ms培养基上生长7d后的拟南芥根系浸泡于25μm h2dcfda或10μm dhe染料(用10mm tes稀释，ph＝7.5)中，黑暗条件下孵育30min。孵育结束后，用tes冲洗三次，并将其装入载玻片内(预先在载玻片上滴加一滴全氟萘胺(pfd)以增强荧光成像效果)，盖上盖玻片，并且确保没有气泡。激光共聚焦显微镜设置如下：40倍物镜，488nm激发光；pmt1：500nm-600nm；pmt2：700nm-800nm；作4-6次重复，使用image j软件计算h2dcfda和dhe荧光强度。具体结果如图6和图7所示。由图6可以看出，图6a为dhe(使o
2。-)染色图，6b为dhe在侧根原基处的荧光强度值，强度越高表明o
2。-的积累越多，表明dhe在pnc处理的侧根原基的1-4阶段及侧根出现阶段有较高的o
2。-积累，而在主根中的分布少于对照组；图6c是由试剂盒测定的根系内的o
2。-含量，表明pnc处理后的主根及成熟侧根中的o
2。-均是减少的。图7a、7b分别为dcf(h2o2)染色图及dcf荧光强度统计，图7c为试剂盒测定的根系内的h2o2含量，这些数据均表明pnc处理后的拟南芥根系中的h2o2被部分清除。
60.不同浓度pnc处理拟南芥
61.在ms培养基中分别添加0.05、0.07、0.1、0.15和0.2mm的pnc，并以空白的ms培养基作为对照组，将在光下生长5天的拟南芥幼苗(挑选长势及根系长度均匀一致的拟南芥幼苗)分别移至上述实验组培养基及对照组培养基上(每板放置6颗苗，对照组及处理组各4板)，光下竖直培养7天，统计对照组及处理组拟南芥幼苗根系表型图、根长及侧根密度，具体结果如图8所示。由图8可以看出，pnc能够促进拟南芥幼苗的侧根发生，且0.1mm的施用浓度最利于拟南芥侧根发生。
62.用连接荧光基团的dii-pnc在对拟南芥根系中的pnc进行定位(dii-pnc的处理方法与pnc加入方式相同)。dii-pnc由514nm激光激发，550-615nm接收，激光共聚焦下观察，具体结果如图9所示。dii-pnc处理拟南芥24h后，可以在根尖处观察到dii-pnc的绿色荧光，表明pnc进入拟南芥根尖；dii-pnc处理拟南芥48h后，可以在根系成熟区的侧根原基处观察到dii-pnc的绿色荧光，表明pnc进入侧根原基处。
63.实施例3
64.1、水稻种子消毒播种及处理
65.本实施例中水稻品种为荃优737。将水稻种子用质量浓度为0.3％的h2o2浸泡，以50转/min的速度摇床40分钟，随后清水冲洗5分钟，吸水纸上晾干后挑取颗粒饱满，均匀一致的种子放入发芽盒中(发芽盒为100孔规格的2ml离心管盒，内装满清水上铺一层纱布(水浸湿纱布为宜，便于根系生长)。盖上盖子，3天后揭盖，放在光下(25℃，14/10h，200μmol m-2
s-1
)再培养2天，得到5天大的水稻幼苗。采用pnc处理液对5天大的水稻幼苗进行处理，作为实验组。同时设置对照组(对照组除处理液中不添加pnc外，其他与实验组完全相同。)再将5天大的水稻幼苗移入离心管中，光下(25℃，14/10h，200μmol m-2
s-1
)培养，黑色定植棉进行定植，培养6天后取出对根系指标进行统计，具体结果如图11所示。由图11可以看出，pnc能够促进水稻幼苗的侧根发生，且0.05mm的施用浓度最利于侧根发生。
66.其中pnc处理液的制备方法具体为：使用15ml棕色离心管装入水稻营养液，并加入pnc使其达到相应的处理浓度，水稻的营业液配方如表1所示。
67.表1 水稻的营业液配方
[0068][0069]
实施例4
[0070]
1、油菜种子消毒播种及处理
[0071]
本实施例中油菜品种为扬油9号，将油菜种子用质量浓度为0.3％的h2o2浸泡，以50转/min的速度摇床40分钟，随后清水冲洗5分钟，吸水纸上晾干后挑取颗粒饱满，均匀一致的种子放入发芽盒中(发芽盒为100孔规格的2ml离心管盒，内装满清水上铺一层纱布(水浸湿纱布为宜，便于根系生长)。盖上盖子，3天后揭盖，放在光下(25℃，14/10h，200μmol m-2
s-1
)再培养2天，得到5天大的油菜幼苗。采用pnc处理液对5天大的油菜幼苗进行处理，作为实验组。同时设置对照组(对照组除处理液中不添加pnc外，其他与实验组完全相同。)再将5天大的油菜幼苗移入离心管中，光下(25℃，14/10h，200μmol m-2
s-1
)培养，黑色定植棉进行定植，培养6天后取出对根系指标进行统计，具体结果如图10所示。由图10可以看出，pnc能够促进油菜幼苗的侧根发生，且0.05mm/l的施用浓度最利于侧根发生。
[0072]
其中pnc处理液的制备方法具体为：使用15ml棕色离心管装入油菜营养液，并加入pnc使其达到相应的处理浓度，油菜的营业液配方如表2所示。
[0073]
表2 油菜的营业液配方
[0074][0075]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。