使用核酸提取用细胞裂解组合物的分子检测方法与流程

使用核酸提取用细胞裂解组合物的分子检测方法
1.相关申请的交叉引用
2.本发明要求2020年12月28日在韩国知识产权局递交的韩国专利申请10-2020-0184288号的申请日权益，其全部内容包含在本发明中。
技术领域
3.本发明涉及使用核酸提取用细胞裂解组合物的分子检测方法，特别是如下的使用核酸提取用细胞裂解组合物的分子检测方法，其可以通过对同时含有作为核酸提取用组分的tween 20和进行聚合酶链式反应所必需的pcr缓冲剂的混合物进行聚合酶链式反应而最大限度地减少分子检测的时间，而无需单独的核酸提取过程，并且可以通过最大限度地减少提取中专用设备和消耗品的使用而减少分子检测的成本。


背景技术：

4.由于基于近来的人类基因组研究结果在遗传学水平上分析了疾病的原因，出于治疗或预防人类疾病的目的，对生物样品的操作和生化分析的需求逐渐增加。另外，除了疾病诊断之外，在诸如新药开发、病毒或细菌感染的预测试和法医学等各个领域中，需要从生物样品或含细胞的样品中提取和分析核酸的技术。
5.同时，出于分子检测，通常从感染了病毒或细菌的人的唾液或血液中提取核酸(其为含有基因信息的dna或rna)，扩增所提取的核酸，并确认该人是否已感染该疾病。
6.图1是示出常规技术的聚合酶链式反应的示意图。在常规技术中，为了从样品中提取含有基因信息的核酸，进行样品分配，然后从样品中提取核酸。提取核酸的过程需要约60分钟。接下来，收集核酸，混合并分配pcr试剂，然后进行pcr。通常通过pcr扩增核酸并分析核酸扩增的结果。为了提取核酸，需要裂解、纯化和洗脱过程。然而，在为核酸提取进行的裂解、纯化和洗脱过程中，需要用于执行这些过程的专用提取设备以及提取所消耗的物品(由塑料制成的工具、磁珠或溶液)。
7.当使用上述的常规技术提取核酸时，可以提取高纯度核酸，但出现的问题是提取过程需要较长时间，因此常规技术不适合在紧急情况下或急诊室中进行检测或医学检查。另外，当常规技术应用于由于病毒的迅速传播而需要对病毒进行国家隔离的情况时，有必要连续使用专用设备和消耗品进行提取，因此出现的问题是检测产生的高成本。
8.因此，为了解决上述问题，迫切需要开发通过使用特定的组合物能够在聚合酶链式反应中同时进行核酸提取和扩增而无需单独的核酸提取过程的技术。


技术实现要素：

9.本发明的目的是提供使用核酸提取用细胞裂解组合物的分子检测方法，其可以通过对同时含有用于从细胞中提取核酸的细胞裂解组合物和聚合酶链式反应所必需的溶液的混合物进行聚合酶链式反应而省略单独的核酸提取过程，并且在聚合酶链式反应中实现核酸提取和扩增。
10.然而，本发明的目的不限于上述目的，并且根据以下描述，本领域技术人员将清楚地理解本文中未提及的其他目的。
11.本发明的一个实施方式提供了一种分子检测方法，其包括以下步骤：制备混合物，所述混合物含有：含有tween 20和蒸馏水的核酸提取用细胞裂解组合物；含核酸的样品；预混物；和含有引物和探针的溶液；和通过对所述混合物进行聚合酶链式反应来提取和扩增核酸。
附图说明
12.图1是示出常规技术的聚合酶链式反应的示意图。
13.图2是示出本发明的一个实施方式的使用核酸提取用细胞裂解组合物的分子检测方法的流程图。
14.图3是示出实验例1至6的荧光值与聚合酶链式反应中的循环次数的关系的图表。
具体实施方式
15.在整个本说明书中，应理解，当将任何部分称为“包括”或“含有”任何组分时，除非另外指明，否则其不排除其他组分，而是可以进一步包括其他组分。
16.下文中，将更详细地描述本发明。
17.本发明的一个实施方式提供了一种分子检测方法，其包括以下步骤：制备混合物，所述混合物含有：含有tween 20和蒸馏水的核酸提取用细胞裂解组合物；含核酸的样品；预混物；和含有引物和探针的溶液；和通过对所述混合物进行聚合酶链式反应来提取和扩增核酸。
18.本发明的一个实施方式的使用核酸提取用细胞裂解组合物的分子检测方法可以通过省略单独的核酸提取过程和对上述混合物进行聚合酶链式反应而最大限度地减少分子检测过程所需的时间，并且通过最大限度地减少提取中专用设备和消耗品的使用而减少分子检测的成本。
19.参照图1，在常规技术的分子检测方法中，进行裂解、纯化和洗脱过程以便从细胞中提取核酸，例如dna或rna，并对洗脱的溶液中添加额外的pcr缓冲剂，然后进行聚合酶链式反应(pcr)。然后，由pcr扩增的核酸一般用于检测。然而，上述方法的问题在于需要用于裂解、纯化和洗脱过程的专用设备，并且针对这些过程应连续使用各种消耗品，例如溶液或塑料线。
20.图2是示出本发明的一个实施方式的使用核酸提取用细胞裂解组合物的分子检测方法的流程图。参见图2，根据本发明，可以使用如下进行的简单方法同时实现核酸提取和扩增：进行制备含有细胞裂解组合物、含核酸的样品、预混物和含引物和探针的溶液的混合物的步骤(s11)，然后进行通过对混合物进行聚合酶链式反应而提取并扩增核酸的步骤(s13)。具体地，根据本发明，在细胞壁裂解过程中使用的溶液限于特定类型的溶液，并且常规技术中通常使用的试剂不添加到溶液中。然而，使用仅含有tween 20作为核酸提取成分的细胞裂解组合物，并将用于进行pcr的pcr缓冲剂，即，预混物、引物和探针额外加入细胞裂解组合物中，并使用所得混合物进行pcr。因此，在无需单独的核酸提取过程的情况下通过进行pcr，能够提取和扩增核酸，并进行分子检测。
21.根据本发明的一个实施方式，核酸提取用细胞裂解组合物可以是仅含tween 20和蒸馏水的混合物。更具体地，核酸提取用细胞裂解组合物可由tween 20(聚山梨醇酯20)和蒸馏水构成。当核酸提取用细胞裂解组合物的组分被如上所述控制时，通过省略核酸提取过程并同时实现pcr中的核酸提取和扩增，能够简化分子检测并缩短分子检测所需的时间。
22.根据本发明的一个实施方式，分子检测方法包括制备含有以下成分的混合物的步骤：含有tween 20和蒸馏水的核酸提取用细胞裂解组合物；含核酸的样品；预混物；和含有引物和探针的溶液。具体地，核酸提取用细胞裂解组合物可以仅含tween 20和蒸馏水，并且预混物和含有引物和探针的溶液可以是pcr缓冲剂。当分子检测方法包括制备如上所述的混合物的步骤时，在无需单独的核酸提取过程的情况下可以通过进行pcr同时实现核酸提取和扩增，从而减少分子检测所需的时间。
23.根据本发明的一个实施方式，分子检测方法包括通过对混合物进行聚合酶链式反应而提取和扩增核酸的步骤。当通过对混合物进行聚合酶链式反应而提取和扩增核酸时，可以确保用于分子检测的核酸并最大限度地减少分子检测所需的时间。
24.根据本发明的一个实施方式，分子检测方法不包括从含核酸的样品中提取核酸的单独步骤。当分子检测方法不包括提取核酸的单独步骤时，由于不使用核酸提取的专用设备和消耗品，因此能够减少分子检测所需的时间并减少成本。
25.根据本发明的一个实施方式，细胞裂解组合物中的tween 20的浓度可以为2.0vol/vol％以上且小于16.0vol/vol％。具体地，tween 20的浓度可以为2.2vol/vol％至15.8vol/vol％、2.4vol/vol％至15.6vol/vol％、2.6vol/vol％至15.4vol/vol％、2.8vol/vol％至15.2vol/vol％、3.0vol/vol％至15.0vol/vol％、3.2vol/vol％至14.8vol/vol％、3.4vol/vol％至14.6vol/vol％、3.6vol/vol％至14.4vol/vol％、3.8vol/vol％至14.2vol/vol％、4.0vol/vol％至14.0vol/vol％、4.2vol/vol％至13.8vol/vol％、6.0vol/vol％至12.0vol/vol％、7.0vol/vol％至11.0vol/vol％、8.0vol/vol％至10.0vol/vol％或8.0vol/vol％至9.0vol/vol％。通过在上述范围内调节tween 20的浓度，可以提高细胞裂解的效果，并且通过在无需单独的额外过程的情况下通过pcr提取和扩增核酸能够缩短分子检测所需的时间。
26.根据本发明的一个实施方式，当将用于核酸分析的样品，即含核酸的样品加入核酸提取用细胞裂解组合物中时，含该样品的混合物中的去垢剂的浓度可以变化。具体地，当核酸提取用细胞裂解组合物和样品以相同体积混合时，含该样品的混合物中的去垢剂的浓度可以降至上述核酸提取用细胞裂解组合物的浓度的一半。在本说明书的全部内容中，术语“含核酸的样品”可以指样品中含有核酸的样品，例如含有细胞中dna或rna核酸的样品，或者含有洗脱的细胞中核酸的样品。
27.根据本发明的一个实施方式，样品和细胞裂解组合物之间的体积比可以为1:0.5至1:2.0。当将样品和细胞裂解组合物之间的体积比控制在上述范围内时，通过控制tween 20的浓度，能够在短时间内从细胞中提取核酸。
28.根据本发明的一个实施方式，预混物和含有引物和探针的溶液之间的体积比可以为1:1至1:10。当将预混物和含有引物和探针的溶液之间的体积比控制在上述范围内时，通过最大程度地提高提取和扩增核酸的效果，能够减少分子检测所需的时间。
29.根据本发明的一个实施方式，含有核酸提取物的混合物和预混物之间的体积比可
以为1:0.5至1:2.0。当将含有核酸提取物的混合物和预混物之间的体积比控制在上述范围内时，通过最大程度地提高提取和扩增核酸的效果，能够减少分子检测所需的时间。
30.根据本发明的一个实施方式，提取和扩增核酸的步骤可以在高于60℃且不高于100℃的温度下进行。具体地，提取和扩增核酸的步骤可以在61℃至99℃、62℃至98℃、63℃至97℃、64℃至96℃、65℃至95℃、66℃至94℃、67℃至93℃、68℃至92℃、69℃至91℃或70℃至90℃的温度下进行。更具体地，提取和扩增核酸的步骤优选在50℃至100℃的温度下进行。当将提取和扩增核酸的步骤的温度控制在上述范围内时，通过在无需单独的核酸提取过程的情况下以pcr扩增核酸，可以提高细胞裂解的效果并减少分子检测所需的时间。
31.根据本发明的一个实施方式，分子检测方法还可包括在制备混合物的步骤之后将混合物保持在温育器中的步骤。当如上所述的在制备混合物的步骤之后将混合物保持在温育器中时，能够提高核酸的提取效果。如说明书中所用的术语“温育器”是指形成空间并且其温度、湿度和压力可控的设备。此设备不限于上述名称。
32.根据本发明的一个实施方式，将混合物保持在温育器中的步骤可以进行1分钟至10分钟。当将混合物保持在温育器中的持续时间控制在上述范围内时，能够提高细胞的裂解效果。
33.根据本发明的一个实施方式，分子检测方法还包括在通过对混合物进行聚合酶链式反应来提取和扩增核酸的步骤之后，分析含有所提取和扩增的核酸的溶液的步骤。当如上所述还包括分析含有所提取和扩增的核酸的溶液的步骤时，能够最大程度地减少基于核酸扩增的分子检测所需的时间，并且通过最大程度地减少核酸提取中的专用设备和消耗品的使用来减少分子检测的成本。
34.下文中，将参考实施例详细描述本发明。然而，根据本发明的实施例可以被修改为各种不同的形式，并且本发明的范围不被解释为限于以下描述的实施例。提供本说明书的实施例以向本领域技术人员更完整地解释本发明。
35.实验例1
36.为了扩增作为测试对象的大肠杆菌dh3的16s rrna(靶基因)，通过旋转柱提取法提取基因。具体地，在收集测试对象大肠杆菌dh3之后，通过使用常规的qiagen提取方法进行裂解过程、纯化过程和洗脱过程而从测试对象中提取16s rrna。
37.然后，将嵌插染料(ssofast pol.evagreen,green)添加到含有提取物的混合物中，并在95℃下进行2分钟的初步反应。然后，通过进行50个循环的pcr来扩增靶基因16s rrna，每个循环由在95℃持续10秒且然后在61℃持续10秒构成。在每个循环中测量荧光值，并在该过程中测量作为能够确定核酸扩增结果的最小阈值的阈值循环(ct)值。测量结果总结在下表1中。
38.实验例2
39.为了扩增作为测试对象的大肠杆菌dh3的16s rrna(靶基因)，通过e3提取法提取基因。更具体地，e3提取法是一种自动的核酸提取方法，大致可分为提取试剂(e3核酸(na)提取试剂盒)和提取系统。e3提取法是使用涂有氧化铁的磁珠从人类样品中提取核酸(dna/rna)的方法。试剂管有四个孔，并含有裂解缓冲剂、洗涤缓冲剂和洗脱缓冲剂。裂解缓冲剂和洗涤缓冲剂中所含的高浓度离液盐可破坏细胞膜并使核酸与蛋白质分离，在这种环境下，带负电荷的核酸吸附在磁珠上。吸附在磁珠上的核酸随后通过核酸提取装置(e3系统)
的磁棒依次移至试管的每一列，并经历几个洗涤步骤。最后，洗脱缓冲剂分离吸附在磁珠上的核酸，磁棒仅除去磁珠，在洗脱缓冲剂中仅留下纯核酸。通过上述方法提取16s rrna。
40.接下来，将嵌插染料(ssofast pol.evagreen,green)添加到含有提取物的混合物中，并在95℃下进行2分钟的初步反应。然后，通过进行50个循环的pcr来扩增靶基因16s rrna，每个循环由在95℃持续10秒且然后在61℃持续10秒构成。在每个循环中测量荧光值，并在该过程中测量作为能够确定核酸扩增结果的最小阈值的阈值循环(ct)值。另外，计算作为实验例2的ct与实验例1的ct的差的
△
ct。结果总结在下表1中。
41.实验例3
42.为了扩增作为测试对象的大肠杆菌dh3的16s rrna(靶基因)，制备含有tween20和蒸馏水的核酸提取用细胞裂解组合物，以具有10vol/vol％的tween 20浓度，并且将含有测试对象的样品加入组合物中，由此制备tween 20浓度控制在5vol/vol％的混合物。之后，将混合物在室温下于温育器中保持5分钟，然后使用离心机以15,000g离心15分钟。
43.接下来，将嵌插染料(ssofast pol.evagreen,green)添加到含有提取物的混合物中，并在95℃下进行2分钟的初步反应。然后，通过进行50个循环的pcr来扩增靶基因16s rrna，每个循环由在95℃持续10秒且然后在61℃持续10秒构成。在每个循环中测量荧光值，并在该过程中测量作为能够确定核酸扩增结果的最小阈值的阈值循环(ct)值。另外，计算作为实验例3的ct与实验例1的ct的差的
△
ct。结果总结在下表1中。
44.实验例4
45.以与实验例3相同的方式测量每个循环的荧光值和ct(阈值循环)值，不同之处在于将核酸提取用细胞裂解组合物中的tween 20浓度控制在20vol/vol％，将混合物中的tween 20浓度控制在10vol/vol％。另外，计算作为实验例4的ct与实验例1的ct的差的
△
ct。结果总结在下表1中。
46.实验例5
47.以与实验例3相同的方式测量每个循环的荧光值和ct(阈值循环)值，不同之处在于核酸提取用细胞裂解组合物含有triton x-100替代tween 20。另外，计算作为实验例5的ct与实验例1的ct的差的
△
ct。结果总结在下表1中。
48.实验例6
49.以与实验例4相同的方式测量每个循环的荧光值和ct(阈值循环)值，不同之处在于核酸提取用细胞裂解组合物含有triton x-100而不是tween 20。另外，计算作为实验例6的ct与实验例1的ct的差的
△
ct。结果总结在下表1中。
50.表1
[0051] ct(数目)
△
ct(数目)实验例117.5-实验例223.56.0实验例329.211.7实验例432.815.3实验例550.0以上32.5以上实验例644.426.9
[0052]
图3是示出实验例1至6的荧光值与聚合酶链式反应中的循环次数的关系的图表。
参见图3和上表1，确认了使用含有浓度为10vol/vol％的tween 20的核酸提取用细胞裂解组合物的实验例3中的荧光值和ct值与对应于常规核酸提取方法的实验例1和2相似。然而，确认了由于在实验例3的核酸提取过程中不进行纯化过程和洗脱过程，因此实验例3中的分子检测所需的时间比实验例1和2的短。
[0053]
相比之下，确认了在使用含有triton x-100的核酸提取用细胞裂解组合物的实验例5和6中，ct值在相同的荧光值(rfu)下增加，因为在相同时间内的细胞壁裂解被延迟。
[0054]
此外，确认了在使用浓度为20vol/vol％的tween 20的实验例4中，ct值与使用浓度为10vol/vol％的tween 20的实验例3相比增加，从而具有相同的荧光值(rfu)。
[0055]
通过实验例1至3，确认了tween 20适合作为用于从细胞中提取核酸的细胞裂解组合物的组分。
[0056]
在下述实施例中，将本发明的一个实施方式的分子检测方法的效果与常规分子检测方法的效果进行比较。
[0057]
比较例1
[0058]
为了扩增作为测试对象的结核分枝杆菌(m.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(m.avium)和胞内分枝杆菌(m.intracellulare)各自所含的基因，通过旋转柱提取法提取基因。具体地，收集测试对象结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌，然后通过使用常规的qiagen提取方法进行裂解过程、纯化过程和洗脱过程而从各测试对象中提取基因。
[0059]
接下来，将能够检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌(ntm)(包括鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌)的4μl引物/探针混合物和20μl taq聚合酶预混物(realhelix
tm qpcr kit,nanohelix,korea)添加到16μl含有提取物的混合物中，然后95℃下进行5分钟的初步反应。然后，通过进行40个循环的pcr来扩增靶基因，每个循环由在95℃持续10秒且然后在60℃持续10秒构成。在该过程中测量阈值循环(ct)值，其是能够确定基因扩增结果的最小阈值。测量结果总结在下表2中。
[0060]
比较例2
[0061]
为了扩增作为测试对象的结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌各自所含的基因，通过将测量体积的tween 20与测量体积的蒸馏水混合以使组合物中的tween20浓度为5.0vol/vol％来制备核酸提取用细胞裂解组合物。然后，将20μl含细胞的样品与20μl核酸提取用细胞裂解组合物混合，从而制备作为去垢剂的tween 20的浓度为2.5vol/vol％的含样品的混合物。然后，通过使细胞在90℃裂解5分钟来从细胞中提取核酸。
[0062]
接下来，将能够检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌(ntm)(包括鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌)的4μl引物/探针混合物和20μl taq聚合酶预混物(realhelix
tm qpcr kit,nanohelix,korea)添加到16μl含有提取物的混合物中，然后95℃下进行5分钟的初步反应。然后，通过进行40个循环的pcr来扩增靶基因is6110和its区域，每个循环由在95℃持续10秒且然后在60℃持续10秒构成。在每个循环中测量荧光值，并在该过程中测量阈值循环(ct)值，其是能够确定基因扩增结果的最小阈值。另外，计算作为比较例2的ct与比较例1的ct的差的
△
ct。测量结果总结在下表2中。
[0063]
实施例1
[0064]
为了扩增作为测试对象的结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌各自所含的基因，通过将测量体积的tween 20与测量体积的蒸馏水混合以使组合物中的tween20浓度
为12.5vol/vol％来制备核酸提取用细胞裂解组合物。然后，将20μl含细胞的样品与20μl核酸提取用细胞裂解组合物混合，从而制备作为去垢剂的tween 20的浓度为6.25vol/vol％的含样品的混合物(然后，控制tween 20的浓度以使总体积40μl的后续pcr反应溶液中的tween 20的最终浓度为2.5vol/vol％)。
[0065]
接下来，将20μl taq聚合酶预混物(realhelix
tm qpcr kit,nanohelix,korea)和能够检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌(ntm)(包括鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌)的4μl含引物/探针的溶液添加到16μl混合物中，然后95℃下进行5分钟的初步反应。然后，通过进行40个循环的pcr来扩增基因，每个循环由在95℃持续10秒且然后在60℃持续40秒构成。在该过程中测量阈值循环(ct)值，其是能够确定核酸扩增结果的最小阈值。测量结果总结在下表2中。
[0066]
表2
[0067]
测试对象比较例1[单位：ct]比较例2[单位：ct]实施例1[单位：ct]结核分枝杆菌32.1333.8932.53鸟分枝杆菌32.8332.0230.44胞内分枝杆菌29.9828.8730.40
[0068]
此外，对于上表2中示出的各测试对象，计算作为比较例1、比较例2和实施例1之间的ct的差的
△
ct，结果总结在下表3中。
[0069]
表3
[0070][0071]
参见上表2和3，确认了通过常规qiagen旋柱提取法提取并通过进行pcr来扩增核酸的比较例1和作为本发明的一个实施方式的实施例1之间的平均ct差为0.52。另外，确认了使用仅含tween 20的细胞裂解组合物提取然后通过进行pcr来扩增核酸的比较例2和作为本发明的一个实施方式的实施例1之间的平均ct差为0.47。
[0072]
总之，确认了本发明的一个实施方式的实施例1展现出了相似或低于对应于常规技术的比较例1和2的ct值，并且实施例1中的分子检测所需的时间与常规技术相比减少，因为实施例1中没有核酸提取过程。另外，确认了实施例1中的分子检测所需的成本减少，因为实施例1中没有使用消耗品。
[0073]
因此，通过对同时含有作为核酸提取的组分的tween 20和进行聚合酶链式反应所需的pcr缓冲剂的混合物进行聚合酶链式反应，使用本发明的一个实施方式的核酸提取用细胞裂解组合物的分子检测方法可省略单独的核酸提取过程并在聚合酶链式反应中实现核酸提取和扩增。
[0074]
如上所述，通过省略单独的核酸提取过程并对含有细胞裂解组合物的混合物进行聚合酶链式反应，使用本发明的一个实施方式的核酸提取用细胞裂解组合物的分子检测方
法可以最大程度地减少基于核酸扩增的分子检测过程的时间，并且通过最大程度地减少核酸提取中的专用设备和消耗品的使用而减少了分子检测的成本。
[0075]
本发明的效果不限于上述效果，并且本领域技术人员将从说明书和附图中的公开内容中清楚地理解本文未提及的效果。
[0076]
尽管上面已经参考有限的实施方式描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于这些实施方式，在不脱离本发明的技术思想并且在所附权利要求的等同范围内，本领域技术人员可以做出各种修改和变型。