一种Fascaplysin衍生物及其制备方法与应用与流程

一种fascaplysin衍生物及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种fascaplysin衍生物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.海洋来源的物质具有区别于其他药物的特点,结构新颖、活性独特,是优良的药物宝库。目前全球发现的海洋天然产物超过3.5万个，成功上市的海洋创新药物有16个，其中5种药物活性成分来源于海绵。海绵是已知生物中最古老、最复杂的共生体无脊椎动物,体内富集了大量的微生物。海绵是活性天然产物的重要来源,几乎一半的海洋来源的活性化合物来自于海绵；已经从海绵中分离到近千种化合物,它们很多具有生物活性如抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、抗炎症等。海绵漫长的共生互作生存演化历程及其强大的化学防御机制必然导致活性物质的高识别性和高选择性,是新颖结构、新靶标原创药物的重要来源。
3.fascaplysin是从海洋海绵中分离得到的一种天然产物，表现出广泛的生物活性，包括抗细菌、抗真菌、抗病毒、hiv-1-rt、p56酪氨酸激酶、抗疟疾，抗癌活性等。研究报道fascaplysin显示出特异性细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-de-pendent kinase 4，cdk4)抑制活性，已被证明可能通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4(cdk4)阻止癌细胞生长，cdk4是一种在大多数癌症中被错误调节的早期细胞周期酶。因此，目前希望对fascaplysin的结构进行改造，找到有效的fascaplysin衍生物。


技术实现要素：

4.本发明第一方面的目的，在于提供一种fascaplysin衍生物。
5.本发明第二方面的目的，在于提供第一方面的fascaplysin衍生物的制备方法。
6.本发明第三方面的目的，在于第一方面的fascaplysin衍生物或其药学上可接受的盐的应用。
7.本发明第四方面的目的，在于提供一种产品。
8.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
9.本发明的第一个方面，提供一种式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐，
[0010][0011]
式(i)中，x-为常见阴离子，比如：cl-、f-、br-、i-、hco
3-、hso
4-、h2po
5-、(0.5)hpo
52-、(1/3)po
53-、(1/6)pf
6-、ch3co
2-、cf3co
2-、co2hco
2-、(0.5)co2co
22-、(0.5)co2(ch2)nco
22-、
phco
2-、ch3so
3-、phso
3-、cf3so
3-、(p)-me-phso
3-等，其中，n＝1～20；
[0012]
r1选自如下基团中的任意一种：
[0013][0014]
其中，n＝1～20。
[0015]
优选地，式(i)中，x-为cl-，r1为
[0016]
本发明的第二个方面，提供第一方面的式(i)所示的化合物的制备方法，其合成路线为：
[0017][0018]
包括如下步骤：
[0019]
(1)化合物s1与色胺混合，反应，得到化合物s2；
[0020]
(2)化合物s2与溴化试剂混合，反应，得到化合物s3；
[0021]
(3)化合物s3与r
1-b(oh)2混合，第一次反应，得到化合物s5，将化合物s5与耐高温油混合，第二次反应，得到s6-cl；
[0022]
(4)对s6-cl进行离子交换，得到式(i)所示的化合物。
[0023]
优选地，步骤(2)中所述溴化试剂为n-溴代丁二酰亚胺(nbs)、溴素中的至少一种。
[0024]
优选地，步骤(3)中所述耐高温油为矿物油、液体石蜡、十八烷烃和二甲基硅油中的至少一种；进一步为二甲基硅油。
[0025]
优选地，步骤(1)中所述化合物s1与色胺的摩尔比为1:(0.5～1.5)；进一步为1:1。
[0026]
优选地，步骤(1)中所述化合物s1与色胺混合前，还包括如下步骤：将化合物s1与i2混合，80～100℃下反应1～3h。
[0027]
优选地，所述化合物s1与i2的摩尔比为1:(0.6～1.4)；进一步为1:0.8。
[0028]
优选地，化合物s1与与i2混合前，所述化合物s1溶于dmso中。
[0029]
优选地，步骤(1)中所述反应的条件为80～100℃下反应3～5h。
[0030]
优选地，步骤(1)中所述反应后，还包括如下步骤：乙酸乙酯(ea)/水提取，nas2o3清洗、除去溶剂、分离纯化。
[0031]
优选地，所述分离纯化通过硅胶柱柱层析进行；进一步优选地，所述分离纯化以25～35v/v％的乙酸乙酯(ea)/石油醚(pe)作为洗脱剂，通过硅胶柱柱层析进行。
[0032]
优选地，步骤(2)中化合物s2与溴化试剂的摩尔比为1:(0.5～1.5)；进一步为1:1。
[0033]
优选地，步骤(2)中所述化合物s2与溴化试剂混合前，所述化合物s2溶于乙酸中。
[0034]
优选地，步骤(2)中所述反应的条件为室温下反应1～3h。
[0035]
优选地，步骤(2)中所述反应后，还包括如下步骤：ea/饱和nahco3提取，除去溶剂，分离纯化。
[0036]
优选地，所述分离纯化通过硅胶柱柱层析进行；进一步优选地，所述分离纯化以15～25v/v％的ea/pe作为洗脱剂，通过硅胶柱柱层析进行。
[0037]
优选地，步骤(3)中所述化合物s3与r
1-b(oh)2的摩尔比为1:(0.5～1.5)；进一步为1:1。
[0038]
优选地，步骤(3)中所述化合物s3与r
1-b(oh)2混合前，所述化合物s3溶于二氧六环和水中。
[0039]
优选地，步骤(3)中所述第一反应在氩气、na2co3和催化剂下进行。
[0040]
优选地，所述催化剂为pd2(dba)3、pd(dppf)cl2、pd(pph3)4中的至少一种；进一步为pd(pph3)4。
[0041]
优选地，步骤(3)中所述第一反应的条件为80～100℃下反应13～19h。
[0042]
优选地，步骤(3)中所述第一反应后还包括如下步骤：除去溶剂、分离纯化。
[0043]
优选地，所述分离纯化通过硅胶柱柱层析进行；进一步优选地，所述分离纯化以20～30v/v％的ea/pe作为洗脱剂，通过硅胶柱柱层析进行。
[0044]
优选地，步骤(3)中所述第二反应的条件为250～350℃下反应3～5h。
[0045]
优选地，步骤(3)中所述第二反应后还包括洗涤。
[0046]
优选地，当x-为cl-时，所述制备方法不包含步骤(4)。
[0047]
本发明的第三个方面，提供第一方面的式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐的应用。
[0048]
一、本发明第一方面的式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备铁死亡诱导剂中的应用。
[0049]
本发明第一方面的式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在诱导铁死亡中的应用。
[0050]
优选地，本发明第一方面的式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在体外非治疗目的地诱导铁死亡中的应用。
[0051]
优选地，所述诱导铁死亡为诱导细胞铁死亡。
[0052]
优选地，所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
[0053]
二、本发明第一方面的式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备铁积累诱导剂中的应用。
[0054]
优选地，所述铁积累诱导剂为铁离子蓄积诱导剂。
[0055]
优选地，所述铁积累诱导剂用于诱导细胞内铁离子浓度的增加。
[0056]
优选地，所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
[0057]
本发明第一方面的式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在诱导铁积累中的应用。
[0058]
优选地，本发明第一方面的式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在体外非治疗目的地诱导铁积累中的应用。
[0059]
优选地，所述诱导铁积累为诱导细胞内铁离子浓度的增加。
[0060]
优选地，所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
[0061]
三、本发明第一方面的式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备活性氧诱导剂中的应用。
[0062]
优选地，所述活性氧为细胞内活性氧。
[0063]
优选地，所述细胞内活性氧包括脂质活性氧和线粒体活性氧中的至少一种；进一
步为脂质活性氧。
[0064]
优选地，所述活性氧诱导剂为促进活性氧的产生及累积的诱导剂。
[0065]
本发明第一方面的式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在诱导活性氧增加中的应用。
[0066]
优选地，本发明第一方面的式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在体外非治疗目的地诱导活性氧增加中的应用。
[0067]
优选地，所述活性氧为细胞内活性氧。
[0068]
优选地，所述细胞内活性氧包括脂质活性氧和线粒体活性氧中的至少一种；进一步为脂质活性氧。
[0069]
四、本发明第一方面的式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备gpx4抑制剂中的应用。
[0070]
优选地，所述gpx4抑制剂为抑制gpx4蛋白表达的抑制剂。
[0071]
优选地，所述gpx4抑制剂用于抑制细胞内gpx4蛋白表达。
[0072]
优选地，所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
[0073]
本发明第一方面的式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在抑制gpx4表达中的应用。
[0074]
优选地，本发明第一方面的式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在体外非治疗目的地抑制gpx4表达中的应用。
[0075]
优选地，所述抑制gpx4表达为抑制细胞内gpx4蛋白表达。
[0076]
优选地，所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
[0077]
五、本发明第一方面的式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备slc7a11抑制剂中的应用。
[0078]
优选地，所述slc7a11抑制剂为抑制slc7a11蛋白表达的抑制剂。
[0079]
优选地，所述slc7a11抑制剂用于抑制细胞内slc7a11蛋白表达。
[0080]
优选地，所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
[0081]
本发明第一方面的式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在抑制slc7a11表达中的应用。
[0082]
优选地，本发明第一方面的式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在体外非治疗目的地抑制slc7a11表达中的应用。
[0083]
优选地，所述抑制slc7a11表达为抑制细胞内slc7a11蛋白表达。
[0084]
优选地，所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
[0085]
六、本发明第一方面的式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备fth1抑制剂中的应用。
[0086]
优选地，所述fth1抑制剂为抑制fth1蛋白表达的抑制剂。
[0087]
优选地，所述fth1抑制剂用于抑制细胞内fth1蛋白表达。
[0088]
优选地，所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
[0089]
本发明第一方面的式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在抑制fth1表达中的应用。
[0090]
优选地，本发明第一方面的式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在体外非
治疗目的地抑制fth1表达中的应用。
[0091]
优选地，所述抑制fth1表达为抑制细胞内fth1蛋白表达。
[0092]
优选地，所述细胞为非小细胞肺癌细胞。
[0093]
七、本发明第一方面的式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0094]
优选地，所述肿瘤为肺癌；进一步为非小细胞肺癌。
[0095]
本发明的第四个方面，提供一种产品，包含本发明第一方面的式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐。
[0096]
优选地，所述产品为药品和试剂中的至少一种。
[0097]
优选地，所述产品具有(w1)～(w7)中任一种功能：
[0098]
(w1)治疗肿瘤；
[0099]
(w2)诱导铁死亡；
[0100]
(w3)诱导铁积累；
[0101]
(w4)诱导活性氧增加；
[0102]
(w5)抑制gpx4表达；
[0103]
(w6)抑制slc7a11表达；
[0104]
(w7)抑制fth1表达。
[0105]
优选地，所述肿瘤为肺癌；进一步为非小细胞肺癌。
[0106]
本发明的有益效果是：
[0107]
本发明首次公开了一种fascaplysin衍生物，其化学结构式如式(i)所示，该fascaplysin衍生物可诱导铁死亡、诱导铁积累、诱导活性氧增加、抑制gpx4、slc7a11、fth1表达，有良好的铁死亡诱导作用，可作为铁死亡诱导剂，诱导肿瘤细胞铁死亡，用于治疗肿瘤。
[0108]
本发明还公开了fascaplysin衍生物的制备方法，其制备方法简便，反应条件温和，便于操作和控制，能耗小，产率高，成本低，可适合产业化生产，制备得到的化合物生物活性较高，具有广阔的市场前景。
附图说明
[0109]
图1是实施例1中fascaplysin衍生物(mar-5)的合成路线图。
[0110]
图2是实施例1中s2的核磁共振氢谱图。
[0111]
图3是实施例1中s2的质谱图。
[0112]
图4是实施例1中s2的质谱图的局部放大图。
[0113]
图5是实施例1中s3的核磁共振氢谱图。
[0114]
图6是实施例1中s3的质谱图。
[0115]
图7是实施例1中s3的质谱图的局部放大图。
[0116]
图8是实施例1中s6的核磁共振氢谱图。
[0117]
图9是实施例1中s6的质谱图。
[0118]
图10是实施例1中s6的质谱图的局部放大图。
[0119]
图11是mar-5对h358细胞的影响图。
[0120]
图12是mar-5对h358细胞中gpx4、slc7a11、fth1的影响图：其中，a是mar-5对h358细胞中gpx4、slc7a11、fth1的影响的westernblot结果图；b是mar-5对h358细胞中gpx4相对表达量影响的统计结果图；c是mar-5对h358细胞中slc7a11相对表达量影响的统计结果图；d是mar-5对h358细胞中fth1相对表达量影响的统计结果图；*表示p＜0.05；**表示p＜0.01。
[0121]
图13是mar-5对h358细胞中脂质活性氧含量的影响图：其中，a是mar-5对h358细胞中脂质活性氧含量影响的的流式细胞图；b是mar-5对h358细胞中脂质活性氧含量影响的统计结果图；*表示p＜0.05；**表示p＜0.01。
[0122]
图14是mar-5对h358细胞中铁浓度的影响图；比例尺为50μm。
具体实施方式
[0123]
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
[0124]
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0125]
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
[0126]
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。本实施例中的室温为23～30℃。
[0127]
实施例1 fascaplysin衍生物(mar-5)的制备
[0128]
fascaplysin衍生物(mar-5)的合成路线图如图1所示，具体步骤如下：
[0129]
(1)向含s1(1.55g，10mmol)的dmso溶液(50ml)中加入i2(2.03g，8mmol)，得到混合物a，将混合物a在90℃下加热2小时；然后向混合物a中加入色胺(1.6g，10mmol)，得到混合物b，将所得混合物b在90℃下加热4小时，用乙酸乙酯(ea)/水提取，用nas2o3(5wt％水溶液)清洗；除去溶剂，残留物通过硅胶柱柱层析分离(30v/v％乙酸乙酯(ea)/石油醚(pe))纯化，得到s2(220mg，收率72％)；s2的氢谱如图2所示：1h nmr(400mhz,dmso)δ12.19(s,1h),8.45(q,j＝4.9hz,2h),8.34(d,j＝7.8hz,1h),7.90
–
7.82(m,1h),7.63(dd,j＝13.1,7.6hz,2h),7.57(t,j＝5.6hz,2h),7.50(dd,j＝9.2,4.1hz,1h),7.34(t,j＝7.5hz,1h)；质谱如图3、4所示：hrms(esi)(m h)/z＝307.1。
[0130]
(2)取s2(154mg,0.5mmol)加入乙酸(acoh)溶液(5ml)中，在室温下向含s2的乙酸溶液中缓慢加入n-溴代丁二酰亚胺(nbs，154mg，0.5mmol)，得到混合物c；在室温下搅拌混合物c2小时，并通过ea(100ml)/饱和nahco3溶液(100ml)提取；除去溶剂，残留物通过硅胶柱柱层析分离(20v/v％ea/pe)纯化，得到s3(85mg，收率35％)；s3的氢谱如图5所示：1h nmr(400mhz,dmso)δ12.33(s,1h),8.63(d,j＝1.2hz,1h),8.52(d,j＝4.9hz,1h),8.48
–
8.44(m,1h),7.82
–
7.74(m,2h),7.63
–
7.60(m,1h),7.57(dd,j＝4.7,1.6hz,2h),7.52
–
7.48(m,1h)；质谱如图6、7所示：hrms(esi)(m h)/z＝385。
[0131]
(3)取s3(243mg，0.5mmol)加入二氧六环(15ml)和水(3ml)溶液中，在氩气下向含s3的二氧六环和水溶液中加入4-三氟甲基苯基硼酸(95mg，0.5mmol)、na2co3(106mg，1mmol)和pd(pph3)4(40mg)，得到混合物d，将混合物d在90℃下加热16小时，除去溶剂，残留物通过
硅胶柱柱层析分离(25v/v％ea/pe)纯化，得到s5(120mg粗品，收率大约70％)，取s5(100mg，0.13mmol)溶于二甲基硅油(15ml)中，将含s5的二甲基硅油溶液加热至300℃并保持3-5小时，用依次用pe、30％ea/pe洗涤混合物得到产物s6(60mg，收率约为60％)，s6的氢谱如图8所示：1h nmr(400mhz,dmso)δ13.63(s,1h),9.70(s,1h),9.23(s,1h),9.05(s,1h),8.49(d,j＝8.0hz,1h),8.30(s,1h),8.06(d,j＝8.0hz,4h),7.97
–
7.87(m,3h),7.76(d,j＝6.8hz,1h)，质谱如图9、10所示：hrms(esi)(m

)/z＝415.1。
[0132]
效果实施例
[0133]
将mar-5用dmso溶解，配制得到浓度为20mm的母液，以备实验待用。
[0134]
1.将h358细胞用h1640培养基(含10v/v％胎牛血清和1v/v％青霉素/链霉素)，于5％co2、37℃条件下的培养箱中培养；取h358细胞以1
×
105个/ml的密度铺板于12孔板中，培养24小时后，分3组，第一组为空白对照组(对照)，第二组加mar-5处理(终浓度为2μm，mar-05 2μm)、第三组加mar-5和铁死亡抑制剂fer-1(mar-5的终浓度为2μm，铁死亡抑制剂fer-1的终浓度为10um，mar-05 2μm fer-1 10um)共同处理，处理24h后，用倒置显微镜拍照观察。结果如图11所示：第二组(mar-05 2μm)的活细胞数明显少于第一组(对照)，而第三组(mar-05 2μm fer-1 10um)的活细胞数量较第二组(mar-05 2μm)活细胞数量明显多，表明mar-5可诱导h358细胞铁死亡。
[0135]
2.将h358细胞用h1640培养基(含10v/v％胎牛血清和1v/v％青霉素/链霉素)，于5％co2、37℃条件下的培养箱中培养；取h358细胞以1
×
105个/ml的密度铺板于12孔板中，培养24小时后，分别用mar-5以终浓度为0、0.5、1、2μm四个浓度梯度处理24小时，每种处理重复3次，胰酶消化收集细胞，3000r/min，离心5min后弃上清,随后用ripa裂解液于冰上裂解，收集细胞蛋白。将收集的蛋白样品进行sds-page电泳，置于转膜仪转膜。转膜后分别孵育一抗(1：1000)gpx4(cell signaling technology,#52455)、slc7a11(cel l signaling technology,#12691)、fth1(abclonal，a1144)、gapdh(上海生工，d110016-0100)，4℃孵育过夜；次日洗膜后加入稀释(1：5000)的二抗(anti-rabbit igg,hrp-l inked antibody，cst，7074s)，室温孵育1h；二抗孵育完成后，显影仪显影。结果如图12所示：mar-5处理后的h358细胞中铁死亡关键性蛋白gpx4、fth1、slc7a11表达下调，并且随着mar-5浓度的增加，下降越明显。
[0136]
3.流式细胞术检测细胞内脂质活性氧：选用生长对数期的h358细胞，以1
×
105个/ml的密度铺板于12孔板中，培养至24h后，用mar-5以终浓度为0、0.5、1、2μm四个浓度梯度处理24h，每种处理重复3次，至24h后，用无血清培养基洗涤细胞2次后，用终浓度为10μm的c11-bodipy 581/591于37℃、5％co2培养箱中孵育1小时。孵育结束后，用pbs清洗细胞两次以去除多余的染料；然后用胰蛋白酶消化细胞，将细胞重悬于含5％fbs的pbs中，最后通过流式细胞术检测荧光并分析。结果如图13所示：在mar-5刺激下，h358细胞内脂质活性氧含量随着mar-5浓度的增加，细胞内脂质活性氧含量上升，脂质活性氧堆积是诱发铁死亡的关键性标志，表明mar-5可有效诱导非小细胞肺癌细胞系细胞h358细胞发生铁死亡。
[0137]
4.铁浓度的测定：在12孔板中接种1x105个h358细胞，37℃、5％co2培养箱中培养24小时。设置三个实验组，其中第一组为空白对照组(空白对照)，第二组加入mar-5处理(终浓度为2μm，mar-5 2μm)，第三组加铁离子螯合剂dfom和mar-5(mar-5的终浓度为2μm，铁离子螯合剂dfom的终浓度为50um，mar-05 2μm dfom 50um)共同处理，培养至24h后，弃去培养
基，用无血清培养基洗涤2次，加入用无血清培养基配制好的10μm fe rrorang探针1ml，37℃、5％co2培养箱中孵育30min，用共聚焦显微镜拍照，结果如图14所示：加入mar-5后h358细胞中铁离子荧光强度明显比空白对照组强，而加入铁死亡螯合剂dfom后荧光强度强减弱，表明mar-5可以提高h358细胞中铁离子增加。
[0138]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。