一种含溶菌酶的清洁剂组合物的制作方法

1.本发明涉及日化领域，具体涉及一种假牙清洁剂。


背景技术：

2.假牙是目前牙列缺损和牙列缺失的主要修复方法之一，但假牙的使用使口腔原有的微生态平衡遭到破坏，假牙基托与承托区粘膜、基牙之间唾液流速减慢、流量减少、氧化还原电势值和供氧条件都发生改变，同时假牙基托又影响了口腔的生理性自洁作用。这些微环境的改变，使得基牙致龋病原菌、牙周病病原菌的粘附增多，龋及牙周病的发生机会增加。卫生状况差的假牙由于其表面腐质和菌斑的腐败分解作用，易产生口腔异味；承托区粘膜受假牙组织面长期的菌斑及其产物(毒素)的刺激，引起局部炎症性改变，严重者将发展为假牙性口炎和念珠菌病。因此，假牙清洁在杀灭病原体，预防局部炎症及系统性疾病方面有着重要的临床意义。
3.白色念珠菌是健康人口腔中常见的共生真菌，可以条件致病导致口腔念珠菌感染。口腔内白色念珠菌的检出受多方面因素的影响，其中主要包括假牙修复、宿主年龄等，宿主年龄因素表现为老年人口腔白色念珠菌检出率增高，而老年人是戴用活动假牙的主要人群。有学者研究健康老年人群中假牙修复对口腔念珠菌定植的影响，发现假牙修复的老年人口腔内白色念珠菌的检出率和检出强度较无假牙者均有显著增强。
4.白色念珠菌导致龋坏主要是由其产酸性引起的，产酸导致局部ph值的降低，引起牙或牙根表面的脱矿，同时，ph值的降低能活化念珠菌属的酸性蛋白酶、磷酯酶、胶原酶，促进组织破坏，从而引起念珠菌的侵入，并有助于其粘附。由白色念珠菌产生的胶原酶不仅能致龋，还能导致牙周组织中胶原的溶解，导致重度牙周炎。
5.常见的假牙清洁方法包括机械法、微波辐射法、化学法等，其中以化学法应用最为广泛。化学清洁剂根据其组成成分和作用机制不同，主要有次氯酸盐类、过氧化物类、酸和酶类。酶类清洁剂主要包括蛋白水解酶、酵母水解酶、脂肪酶、淀粉酶、葡聚糖酶等。其作用原理是利用酶分解菌斑内糖蛋白、粘蛋白和粘多糖，破坏菌斑和结石的形成。酶对假牙组成材料的劣化作用是最轻微的，但单一使用其清洁效果较为有限，故该类清洁剂多与其他成分组成复合剂型，以提高其清洁效果。
6.目前市面上用于浸泡假牙的清洁剂有些腐蚀性较强，有些抑菌效果不尽人意。因此，有必要研发一种来源天然、无毒副作用、抑菌效果显著的假牙清洁剂代替市售产品。
7.溶菌酶又称胞壁质酶或n-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与dna、rna、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，因溶菌酶能够专一的作用于目的微生物的细胞壁的盐基水解蛋白酶，被广泛的运用于食品、饲料、医药等行业。
8.山姜素的化学名称为(s)-7-羟基-5-甲氧基黄烷酮，是中药草豆蔻的主要活性成
分，广泛分布于姜科豆蔻属和杨柳科杨属等植物中。山姜素主要来源于草豆蔻植物的根部或者种子，例如草豆蔻、草果赤杨皮，蓼属植物和黄芩等。近年来随着对黄酮类化合物的深入研究，发现山姜素具有多种药理作用。山姜素对花生四烯酸、胶原，二磷酸腺苷和瑞斯托菌素引起的血小板聚集具有不同程度的抑制作用。体外抗病毒药效学实验表明，山姜素对呼吸道系统病毒、疱疹病毒、腺病毒，人类免疫缺陷病毒和肝炎病毒等具有良好的抗病毒作用，此外山姜素还具有抗氧化和抗风湿的作用。
9.杨梅素是一种天然的植物提取物，广泛存在于洋葱、草莓等果蔬中，在红酒中的含量占黄酮类总含量20％-50％，又名杨梅黄酮、杨梅酮。杨梅素具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗老化、降血糖、降脂、镇静、抑制血管异常、保护心血管等多种生物活性。近期的研究表明，杨梅素能通过提高胰岛素敏感性、改善糖原代谢、类胰岛素作用等降低血糖的作用。有实验证实杨梅素能通过提高胰岛素敏感性，从而改善胰岛素抵抗降低血糖。
10.目前，将溶菌酶与山姜素和杨梅素组合用于假牙清洁剂的应用尚未见报道。


技术实现要素：

11.本发明所要解决的技术问题是提供一种能有效清洁假牙，无毒副作用，抑菌效果佳，活性成分来源天然的假牙清洁剂。
12.本发明解决上述问题所采用的技术方案是，提供一种假牙清洁剂组合物，其中活性成分溶菌酶、山姜素和杨梅素的重量比为1：(1-3)：(1-3)。
13.优选的，所述清洁剂组合物中，溶菌酶、山姜素和杨梅素的重量比为1：(1-2)：(1-2)。
14.更优选的，所述清洁剂组合物中，溶菌酶、山姜素和杨梅素的重量比为1：2：1。
15.优选的，所述溶菌酶提取自鸡蛋清。
16.优选的，所述清洁剂组合物中进一步包括药学上可接受的辅料。
17.更优选的，所述药学上可接受的辅料选自酸性物质、碱性物质、填充剂、矫味剂、润滑剂中的一种或多种。
18.最优选的，所述酸性物质为酒石酸或柠檬酸；所述碱性物质为碳酸钠或碳酸氢钠；所述填充剂为乳糖、甘露醇或木糖醇；所述矫味剂为甜菜碱或阿斯巴甜；所述润滑剂为硬脂酸镁或二氧化硅。
19.优选的，所述清洁剂组合物的剂型为片剂、水溶液等，更优选为泡腾片。
20.本发明还提供一种上述清洁剂组合物在抑制假牙中真菌生成的应用。
21.优选的，所述真菌为白色念珠菌。
22.本发明具有积极有益的效果：令人惊奇的是，经过反复多次试验，本发明意外发现将溶菌酶与山姜素和杨梅素组合使用，对于抑制假牙上的真菌具有协同增效的效果。与市售制剂相比，本发明的假牙清洁剂制备方法简单，配伍合理，三种活性成分在发挥各自功效的同时，又能产生协同增效作用，显著抑制假牙上的各类细菌和真菌。另外，溶菌酶、山姜素和杨梅素来源天然，无毒副作用。
具体实施方式
23.下面结合实施例对本发明作更进一步的说明，但本发明的实施方式不限于此。下
述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例和试验例中使用的溶菌酶均为提取自鸡蛋清中的溶菌酶。
24.实施例1、含溶菌酶的泡腾片t1
25.将200g溶菌酶与120g酒石酸、120g碳酸氢钠、50g乳糖、5g阿斯巴甜混匀，用无水乙醇制粒，干燥后加入硬脂酸镁5g，压制成100片，每片泡腾片重量为5g。
26.实施例2、含山姜素的泡腾片t2
27.将200g山姜素与120g酒石酸、120g碳酸氢钠、50g乳糖、5g阿斯巴甜混匀，用无水乙醇制粒，干燥后加入硬脂酸镁5g，压制成100片，每片泡腾片重量为5g。
28.实施例3、含杨梅素的泡腾片t3
29.将200g杨梅素与120g酒石酸、120g碳酸氢钠、50g乳糖、5g阿斯巴甜混匀，用无水乙醇制粒，干燥后加入硬脂酸镁5g，压制成100片，每片泡腾片重量为5g。
30.实施例4、含溶菌酶、山姜素和杨梅素的泡腾片t4(溶菌酶：山姜素：杨梅素＝1:1:1)
31.将66.6g溶菌酶、66.6g山姜素、66.6g杨梅素与120g酒石酸、120g碳酸氢钠、50g乳糖、5g阿斯巴甜混匀，用无水乙醇制粒，干燥后加入硬脂酸镁5g，压制成100片，每片泡腾片重量为5g。
32.实施例5、含溶菌酶、山姜素和杨梅素的泡腾片t5(溶菌酶：山姜素：杨梅素＝1:1:2)
33.将50g溶菌酶、50g山姜素和100g杨梅素与120g酒石酸、120g碳酸氢钠、50g乳糖、5g阿斯巴甜混匀，用无水乙醇制粒，干燥后加入硬脂酸镁5g，压制成100片，每片泡腾片重量为5g。
34.实施例6、含溶菌酶、山姜素和杨梅素的泡腾片t6(溶菌酶：山姜素：杨梅素＝1:2:1)
35.将50g溶菌酶、100g山姜素和50g杨梅素与120g酒石酸、120g碳酸氢钠、50g乳糖、5g阿斯巴甜混匀，用无水乙醇制粒，干燥后加入硬脂酸镁5g，压制成100片，每片泡腾片重量为5g。
36.试验例1、本发明的假牙清洁剂对白色念珠菌生物膜的清洁效果
37.1.1白色念珠菌生物膜的培养
38.冻存的白色念珠菌菌株解冻接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基，37℃二氧化碳培养箱培养24h复苏。挑取单菌落转种于10ml酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中，置于30℃温控培养摇床中培养过夜。收集菌体，磷酸盐缓冲液离心洗涤2次，最后用改良型rpmi 1640培养基重悬，在倒置显微镜下采用血球计数板计数调整菌液浓度至每毫升1
×
106个菌体。取200μl上述浓度的菌液至96孔微量培养板的微孔中，置于37℃二氧化碳培养箱培养24h，从而形成白色念珠菌生物膜。
39.1.2假牙清洁剂的清洁处理
40.形成后的生物膜弃去培养基，每孔分别用200μl磷酸盐缓冲液清洗3次，以去除未粘附菌。取实施例1-6的泡腾片t1-t6，每片分别溶解于150ml 40℃无菌蒸馏水中，待泡腾片完全溶解后，取溶液200μl加入生物膜中。每种假牙清洁剂重复浸泡5个附着生物膜的孔，同时设置阳性对照组(生物膜用无菌蒸馏水浸泡)和阴性对照组(无生物膜)。各组假牙清洁剂
浸泡生物膜15min后弃去清洁剂，并用磷酸盐缓冲液洗涤3次，以去除残余的清洁剂。
41.1.3白色念珠菌生物膜活性的定量
42.采用甲基四氮盐(xtt)减低法测定生物膜的代谢活性的改变。取100μl改良型rpmi 1640培养基、50μl xtt-甲萘醌混合液至每孔中，包括阳性对照组和阴性对照组，37℃避光继续在二氧化碳培养箱培养2h，选择490nm波长在酶标仪上测定各孔吸光度值(a值)。
43.1.4白色念珠菌生物膜生物量的定量
44.采用结晶紫含量测定来定量生物膜的生物量。将每孔中培养基及xtt-甲萘醌混合液弃去，磷酸盐缓冲液清洗1次。生物膜用空气干燥后每孔加入100μl 0.5％(w/v)结晶紫溶液，作用5min。然后弃去结晶紫溶液，磷酸盐缓冲液洗涤3次，以除去多余的染料。染色后的生物膜每孔中加入100μl 95％的乙醇脱色，反复轻轻吹吸1min至完全溶解生物膜上的结晶紫，最后溶有结晶紫的乙醇转移至另一干净的96孔微量培养板中，选择570nm波长在酶标仪上测定各孔的吸光度值(a值)。
45.1.5统计分析
46.按以下公式计算假牙清洁剂浸泡后，白色念珠菌生物膜活性及生物量减少的百分率：减少率＝[1-(a
实验组-a
阴性对照组
)/(a
阳性对照组-a
阴性对照组
)]*100％。试验结果如表1所示。
[0047]
表1本发明泡腾片对白色念珠菌生物膜活性及生物量的影响
[0048][0049]
上述试验结果表明，使用各种配比的本发明假牙清洁剂后白色念珠菌生物膜活性及生物量均有不同程度的减少，证实本发明假牙清洁剂在抑制假牙真菌方面效果显著。特别是在活性成分总量保持不变的情况下，使用本发明含溶菌酶、山姜素和杨梅素的假牙清洁剂(t4-t6)较单独使用含溶菌酶、山姜素或杨梅素的假牙清洁剂(t1-t3)，白色念珠菌生物膜活性及生物量显著减少，证明溶菌酶和山姜素的组合使用产生了协同效果，减少了抑菌成分的使用量。其中溶菌酶、山姜素和杨梅素的重量比为1:2:1的假牙清洁剂效果最为突出，产生了难以预期的优异效果。