一种纳米酶及其制备方法与应用

1.本发明涉及生物医学材料技术领域，尤其涉及一种纳米酶及其制备方法与应用。


背景技术：

2.急性肾损伤是人类重要的健康问题，其具有较高的发病率和死亡率，据估计全球每年有170万人死于急性肾损伤问题。目前，辅助治疗和肾移植是最常见的急性肾损伤治疗方法。最近的研究表明，急性肾损伤的发病机理与细胞内过量的活性氧和活性氮物种相关。此前，一些小分子药物，例如：氨磷汀和乙酰半胱氨酸，已经被证明可以作为抗氧化剂，消除活性氧，以此来缓解急性肾损伤。然而，现有小分子药物不具备靶向性，因此利用率低，容易造成较大的毒副作用并且疗效有限，这些都阻碍了他们的临床应用。
3.因此，现有技术还有待于改进和发展。


技术实现要素：

4.鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种纳米酶及其制备方法与应用，旨在解决现有的小分子药物利用率低、副作用大，难以用于急性肾损伤治疗的技术问题。
5.本发明第一方面，提供一种纳米酶，其包括铑纳米颗粒和结合在所述铑纳米颗粒表面的丝氨酸。表面配体丝氨酸的存在使得铑纳米酶具有靶向受损肾脏的能力，并且它们都具有良好的水溶性和生物安全性，不易于血清内蛋白发生作用，有利于纳米颗粒在血液中的循环。
6.可选地，所述铑纳米颗粒和所述丝氨酸的质量比为1:(1-4)。
7.可选地，所述纳米酶为直径小于5.5nm的球形颗粒。
8.本发明第二方面，提供一种如上所述的纳米酶的制备方法，其中，包括步骤：将三水合氯化铑和甲氧基聚乙二醇巯基混合在水中，超声分散均匀后加入硼氢化钠，反应制得铑纳米颗粒溶液；对所述铑纳米颗粒溶液进行超滤洗涤后，再加入丝氨酸并进行搅拌，使丝氨酸结合在铑纳米颗粒表面，制得所述纳米酶。
9.可选地，所述三水合氯化铑和甲氧基聚乙二醇巯基质量比为3:(1
‑ꢀ
10)。
10.可选地，所述反应的时间为5-30分钟，所述反应的温度为室温。
11.可选地，所述三水合氯化铑与丝氨酸的质量比为1:(1-4)。
12.本发明第三方面，提供一种如上所述的纳米酶在制备靶向治疗急性肾损伤药物中的应用。
13.可选地，所述药物的剂型为胶囊剂、片剂、口服制剂、注射剂、栓剂、喷雾剂或软膏剂。
14.有益效果：本发明提供的纳米酶包括铑纳米颗粒和结合在所述铑纳米颗粒表面的丝氨酸。本发明的纳米酶(rh-ser)具有超小的尺寸，低于肾小管的过滤阈值，同时丝氨酸具有靶向受损肾小管表达的肾损伤分子-1 (kim-1)的能力，因此丝氨酸的修饰可以使得铑纳
米颗粒具备一定的肾靶向能力，使得铑纳米颗粒能够有效的富集于受损小鼠肾脏，清除肾小管内大量的活性氧或活性氮以缓解和治疗甘油诱导的急性肾损伤。另外，这些rh-ser具有良好的治疗效果，同时具有优异的生物相容性和生物安全性。
附图说明
15.图1为本发明具体的实施例中rh-ser的合成路线图；
16.图2为本发明具体的实施例中rh-ser的原子力显微镜（afm）图以及afm的高度图；
17.图3为本发明具体的实施例中rh-ser的高分辨透射电镜(hr-tem) 图；
18.图4为本发明具体的实施例中rh-ser的x射线衍射(xrd)图；
19.图5为本发明具体的实施例中rh-ser的羟基自由基清除率图；
20.图6为本发明具体的实施例中rh-ser的超氧阴离子清除率图；
21.图7为本发明具体的实施例中rh-ser的2，2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(abts)自由基清除率图；
22.图8为本发明具体的实施例中rh-ser的2，2-联苯基-1-苦基肼基 (dpph)氮自由基清除率图；
23.图9为本发明具体的实施例中rh-ser处理肾小管细胞(293t)和人肾小管上皮细胞(hk-2)存活率图；
24.图10为本发明具体的实施例中不同浓度rh-ser与h2o2刺激下的人肾小管上皮细胞(hk-2)孵育后的存活率图；
25.图11为本发明具体的实施例中rh-ser对比无修饰和苏氨酸修饰的铑纳米酶在不同处理下小鼠的肾脏光声成像图以及光声结果的半定量图；
26.图12为本发明具体的实施例中rh-ser在不同治疗组小鼠肾脏白介素
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6(il-6)和肿瘤坏死因子(tnf-α)水平图；
27.图13为本发明具体的实施例中rh-ser在不同治疗组小鼠血清中血尿素氮(bun)含量图；
28.图14为本发明具体的实施例中rh-ser在不同治疗组小鼠血清中血肌酐(crea)含量图；
29.图15为本发明具体的实施例中仅注射磷酸缓冲液的急性肾衰竭老鼠的体重随时间的变化图。
30.图16为本发明具体的实施例中注射rh-ser的急性肾衰竭老鼠的体重随时间的变化图。
具体实施方式
31.本发明提供一种纳米酶及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
32.发明人研究发现，相较于传统蛋白酶，纳米酶具有成本低、催化性质可调、可大规模制备等明显优势。同时，研究发现铑纳米酶具有广谱的活性氧和活性氮的清除能力。此外，纳米材料具有独特的物理化学性质，这使得它们可作为临床或预临床成像手段的造影
剂。更重要的是，超小的纳米颗粒可以通过肾脏进行代谢，这就为急性肾损伤的治疗提供了可能。研究证明丝氨酸具有靶向受损肾小管表达的肾损伤分子-1(kim-1)的能力，因此丝氨酸的修饰可以使得材料具备一定的受损肾脏靶向能力。
33.基于此，本发明实施例提供了一种纳米酶，其包括铑纳米颗粒和结合在所述铑纳米颗粒表面的丝氨酸。本实施例中的纳米酶可以简写为rh
‑ꢀ
ser。
34.本实施例提供的rh-ser具有超小的尺寸，低于肾小管滤过阈值；同时丝氨酸具有靶向受损肾小管表达的肾损伤分子-1(kim-1)的能力，因此丝氨酸的修饰可以使得铑纳米颗粒具备一定的肾靶向能力，使得铑纳米颗粒能够有效的富集于受损小鼠肾脏，清除肾小管内大量的活性氧或活性氮以缓解和治疗甘油诱导的急性肾损伤，并且具有优异的抗炎能力。另外，这些rh-ser具有良好的治疗效果，同时具有优异的生物相容性和生物安全性。
35.在本实施中，所述丝氨酸的修饰使得铑纳米酶具有一定的受损肾脏靶向能力，并且它们都具有良好的水溶性和生物安全性，不易与血清内蛋白发生作用，有利于铑纳米颗粒在血液中的循环。
36.在一种实施方式中，所述铑纳米颗粒和所述丝氨酸的质量比为1： (1-4)。
37.在一种实施方式中，所述rh-ser为直径小于5.5nm的球形颗粒，低于肾小管滤过阈值。由于丝氨酸的修饰使其能够有效的富集于受损小鼠肾脏，且超小的纳米颗粒有利于通过肾脏进行代谢。
38.本发明实施例提供一种如上所述rh-ser的制备方法，其中，包括步骤：将三水合氯化铑和甲氧基聚乙二醇巯基混合在水中，超声分散均匀后加入硼氢化钠，反应制得铑纳米颗粒溶液；对所述铑纳米颗粒溶液进行超滤洗涤后，再加入丝氨酸并进行搅拌，使丝氨酸结合在铑纳米颗粒表面，制得所述纳米酶。
39.在一些具体的实施方式中，将三水合氯化铑和甲氧基聚乙二醇巯基按照质量比为3:(1-10)的比例混合于水中，超声分散均匀并搅拌10-15分钟，随后滴加现配的硼氢化钠(2mg/ml)，在室温(18-35℃)下反应5
‑ꢀ
30分钟；将所得溶液超滤洗涤，加入丝氨酸搅拌过夜；在将所得溶液超滤洗涤，即得到所述rh-ser。
40.在一些实施方式中，还提供一种本发明实施例所述的rh-ser在制备靶向治疗急性肾损伤药物中的应用。
41.优选地，所述药物的剂型为胶囊剂、片剂、口服制剂、注射剂、栓剂、喷雾剂或软膏剂。
42.下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步地说明。
43.实施例1：合成rh-ser
44.rh-ser合成：将60mg rhcl3·
3h2o溶于50ml水中，随后在溶液中加入40mg甲氧基聚乙二醇巯基，并剧烈搅拌。0.5h后，迅速向混合物中滴加5ml nabh4水溶液(2mg/ml)。反应10分钟后，通过超滤离心将上述溶液纯化。然后将样品冷冻干燥得到固体产物。然后将干燥得到的固体产物分散在水中(2mg/ml，5ml)并与l-丝氨酸混合，搅拌过夜得到 rh-ser。通过超滤离心去除游离l-丝氨酸，将纯化过的溶液冷冻干燥以备随时取用。苏氨酸修饰的铑纳米酶则用苏氨酸替代丝氨酸，得到的样品被称为rh-thr。
45.图1为合成rh-ser的路线图，其中rhcl3·
3h2o代表三水合氯化铑， l-ser代表丝氨酸。所述rh-ser具有一定靶向受损肾小管的能力。
46.图2是合成的rh-ser的afm图；图3是合成的rh-ser的hr-tem 图；图2和图3表明rh-ser具有超小的尺寸。图4为rh-ser的xrd图，表明铑纳米酶为标准的四面体结构。
47.实施例2：rh-ser具有清除多种活性氧/氮的能力。
48.不同浓度rh-ser(0-100μg/ml)清除羟基自由基的效率是通过羟基自由基抗氧化能力(horac)试剂盒(cell biolabs，usa)测定的。测试是按照制造商提供的方案进行的。
49.如图5所示，rh-ser能够有效的清除羟基自由基，并且具有浓度依赖的特性。
50.不同浓度rh-ser(0-5μg/ml)清除超氧阴离子的效率是通过超氧化物歧化酶(sod)检测试剂盒(sigma-aldrich，usa)测定的。测试是按照制造商提供的方案进行的。
51.如图6所示，rh-ser能够有效的清除超氧阴离子，并且具有浓度依赖的特性。
52.rh-ser清除2，2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐 (abts)自由基的测试
53.用abts自由基阳离子脱色法测定了rh-ser的自由基清除能力。abts (7mm)溶于水，加入2.45mm过硫酸钾反应半小时，可产生abts自由基阳离子(
·
abts

)。然后在734nm处测定纯
·
abts

溶液(ab)和不同浓度(0-10μg/ml)rh-ser与
·
abts

混合溶液的吸光度值。abts清除效率的计算公式为[(ab-ap)/ab]*100。所有的测量都是一式三次。
[0054]
如图7所示，rh-ser能够有效的清除abts自由基，并且具有浓度依赖的特性。
[0055]
rh-ser清除氮自由基2，2-联苯基-1-苦基肼基(dpph)
[0056]
采用dpph评价rh-ser对活性氮清除活性。将不同浓度的rh-ser(0
‑ꢀ
100μg/ml)与100μm dpph混合反应2h后，测量混合液在550nm处的吸光度(a
样
)和dpph在550nm处的吸光度(a
对
)。dpph清除效率的计算公式为[(a
对-a
样
)/a
对
]*100。所有的测量都是一式三次。
[0057]
如图8所示，rh-ser能够有效的清除活性氮dpph，并且具有浓度依赖的特性。
[0058]
实施例3：rh-ser细胞毒性和通过清除各种活性氧/活性氮保护肾细胞采用标准的mtt法，评价rh-ser对293t肾胚胎细胞和人肾小管上皮细胞(hk-2)存活率的影响。
[0059]
293t细胞或hk-2细胞以每孔1
×
104密度接种到96孔板中，并置于 37摄氏度、5％co2条件下培育12h。接着，吸出96孔板中的旧培养基，分别加入含有不同浓度rh-ser的培养基溶液。继续培养20或44h后，吸出96孔板中的旧培养基，在每个孔中加入100μl mtt的培养基溶液 (0.8mg/ml)，继续培养4h。吸出96孔板中的残余培养基，在每个孔中加入150μl dmso溶液，轻轻摇晃后，在synergy h1型酶标仪上检测每孔的od值(检测波长为570nm)，用如下公式计算细胞存活率。细胞存活率(cell viability)(％)＝(样品的od
570
值/空白od
570
值)
×ꢀ
100％。
[0060]
如图9所示，合成的rh-ser对293t肾胚胎细胞和人肾小管上皮细胞 (hk-2)的细胞存活率，在浓度达到最大使用浓度200μg/ml时，细胞依然保持80％以上的存活率。表明本发明的rh-ser具有较低的细胞毒性。
[0061]
如图10所示，293t细胞提前4小时处理rh-ser(0-200μg/ml) 后，加入含0.5mm过氧化氢的培养基培养20小时再用上述mtt法测定细胞存活率。细胞存活率随着rh-ser浓度升高而升高，表明rh-ser对h2o2刺激下的人肾小管上皮细胞(hk-2)具有浓度依赖的保护作用。
[0062]
实施例4：rh-ser的肾脏靶向，其中光声成像所有的实验操作均按照临床中心动物保健和使用委员会通过的动物使用和保健制度。雌性无胸腺小白鼠(六周，20-25g)，在小白鼠后腿肌肉注射8ml/kg 50％的甘油溶液建立老鼠急性肾衰竭模型(rm-aki)。2小时后，尾
静脉注射rh-ser 或没修饰的铑纳米颗粒rh-nps，苏氨酸修饰的铑纳米颗粒rh-thr。
[0063]
分别在不同的时间点取出小鼠肾脏，使用光声成像仪对小鼠肾脏进行成像。如图11所示，注射rh-ser组的小鼠肾脏光声信号明显增强，在4 小时信号强度到达顶峰，远高于其他组，这表明rh-ser具有优异的受损肾脏靶向能力。
[0064]
实施例5：rh-ser治疗急性肾损伤和生物安全性评价
[0065]
所有的实验操作均按照临床中心动物保健和使用委员会通过的动物使用和保健制度。雌性无胸腺小白鼠(六周，20-25g)，在小白鼠后腿肌肉注射8ml/kg 50％的甘油溶液建立老鼠急性肾衰竭模型。2小时后，尾静脉注射小分子药物乙酰半胱氨酸或者rh-ser。
[0066]
小鼠随机分为5组：(1)健康小鼠注射磷酸缓冲液；(2)健康小鼠注射rh-ser；(3)甘油诱导的急性肾衰竭小鼠注射磷酸缓冲液；(4)甘油诱导的急性肾衰竭小鼠注射rh-ser等量的乙酰半胱氨酸；(5)甘油诱导的急性肾衰竭小鼠注射rh-ser。其中注射使用磷酸缓冲液体积为100 μl，rh-ser注射剂量为5mg/kg，乙酰半胱氨酸注射剂量为5mg/kg。在 24小时后将健康小鼠和甘油诱导的急性肾衰竭小鼠安乐死，取小鼠血液离心获得血清，并采集小鼠肾脏。
[0067]
将小鼠的肾脏称重并在4ml磷酸缓冲液中匀浆，5000rpm离心3分钟后取上清，按照说明书使用il-6和tnf-α(abbkine scientificcompany，usa)elisa试剂盒测定小鼠肾脏匀浆液中的促炎因子肿瘤坏死因子-α(tnf-α)和白细胞介素-6(il-6)的水平。如图12所示， rh-ser治疗的急性肾衰竭小鼠il-6和tnf-α水平均能降低到正常值，表明rh-ser具有优异的抗炎治疗效果。
[0068]
如图13-14所示，测量肌酐和血尿素氮含量。健康小鼠注射rh-ser 的肌酐和血尿素氮含量没有明显变化。而注射rh-ser的急性肾衰竭小鼠肌酐和血尿素氮含量明显低于只注射磷酸缓冲液的小鼠，并接近健康小鼠的水平。而同等剂量的乙酰半胱氨酸并不能有效的降低两个指标。这表明 rh-ser能够有效的缓解和治疗急性肾衰竭，并比临床使用的小分子药物乙酰半胱氨酸具有更好的治疗效果。
[0069]
此外，使用急性肾衰竭小鼠注射磷酸缓冲液和rh-ser，记录小鼠十五天内的体重变化情况。如图15(磷酸缓冲液组)和图16(rh-ser组)所示，与对照组相比，注射rh-ser的小鼠体重在降低之后逐渐恢复，表明 rh-ser具有良好的治疗效果。
[0070]
综上所述，本发明的rh-ser通过简单的合成方法，可大量制备出超小纳米颗粒，能够有效的清除各类活性氧/活性氮物种，具有广谱的活性氧/活性氮清除能力。并且对293t肾细胞和人肾小管上皮细胞(hk-2)的毒副作用较低，与细胞共培养24小时后细胞存活率均达到80％以上；同时它们可以通过清除细胞内多余的活性氧/活性氮来保护细胞免受过氧化氢刺激。由于丝氨酸的修饰，rh-ser具有靶向肾脏的能力，借助光声成像仪证实rh-ser优异的肾靶向能力。此外，rh-ser在甘油诱导的急性肾衰竭小鼠显示出良好的治疗效果和优异的抗炎能力。更重要的是，rh-ser具有良好的生物相容性和生物安全性。
[0071]
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。