人类静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒及工艺和应用的制作方法

1.本发明涉及多态性检测技术领域，具体为人类静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒及工艺和应用。


背景技术：

2.静脉血栓栓塞症是一种多因素疾病，遗传因素在vte的发病中具有非常重要的作用，部分研究显示，不同遗传因素在vte发病中的作用占比可能超过60％，超过50％的无诱因vte患者可检测出不同类型的遗传因素导致的易栓倾向。
3.pai-1蛋白是血浆中组织纤溶酶原激活物的主要抑制剂。pai-14g/5g(rs1799762)位点基因突变与个体发生vte的风险增加之间存在关联。pai-1基因4g等位基因能够通过上调pai-1基因表达从而引起血浆pai-1浓度升高，患者处于高凝状态，表现为血栓倾向。
4.thbd编码血栓调节蛋白，是蛋白c抗凝系统的重要成员。血栓调节蛋白的抗凝功能主要体现在协助凝血酶激活蛋白c方面，当血液凝固时，血浆蛋白c处于无活性状态，需要局部高浓度的凝血酶切割激活肽来激活蛋白c成为活化的蛋白c，这一单纯的凝血酶激活过程通常很缓慢，而在辅因子血栓调节蛋白的协助下，凝血酶激活蛋白c的速率提高1000倍，高效的产生足够的活化的蛋白c，后者灭活激活的fv和fviii，抑制血液继续凝固。当thbd发生突变时，会导致血栓调节蛋白的表达量减少，从而降低血栓调节蛋白对蛋白c的抗凝活性的激活。
5.proc基因编码蛋白c，蛋白c可被tm激活形成活化的蛋白c进而产生抗凝效应。目前世界范围已有416个相关致病变异被发现。
6.目前静脉血栓风险基因多态性检测方法有很多种，包括直接测序法、芯片法、限制性片段长度多态性法、高分辨率溶解曲线法、扩增阻滞突变法(arms法)、taqman荧光探针法。其中，测序法和芯片法虽然一次可对多基因多位点进行检测，但是操作繁琐，检测周期长，成本相对较高，不利于临床推广。限制性片段长度多肽法需要对扩增产物进行凝胶电泳，不仅操作繁琐，而且非封闭管理操作容易引起污染造成假阳性。高分辨率溶解曲线法虽然操作简便，但是特异性偏低，且对仪器设备要求较高。arms法和taqman荧光探针法，操作简便，灵敏度高，但是对单碱基突变，尤其是高gc含量基因中的单碱基突变的特异性较差，会导致非特异扩增，可能产生假阳性结果。
7.为此，我们提出人类静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒及工艺和应用。


技术实现要素：

8.鉴于上述和/或现有人类静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒及工艺和应用中存在的问题，提出了本发明。
9.因此，本发明的目的是提供人类静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒及工艺和应用，能够解决上述提出现有的问题。
10.为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：
11.人类静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒，包括同时检测pai-1 4g/5g、thbd c.-151g》t和proc 565c》t(rs146922325)和proc c.574_576del基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括试剂a、试剂b、阳性质控a、阳性质控品b和阴性对照；
12.所述试剂a包括pai-1 4g/5g野生型和thbd c.-151g》t野生型的特异性引物及普通探针和配对引物，proc 565c》t上下游引物、proc 565c》t野生型和突变型特异性探针，taq dna聚合酶、10xbuffer，dntp和bsa；
13.所述试剂b包括pai-1 4g/5g突变型和thbd c.-151g》t突变型的特异性引物及普通探针和配对引物，proc c.574_576del上下游引物、proc c.574_576del野生型和突变型特异性探针，taq dna聚合酶、10xbuffer，dntp和bsa；
14.所述阳性质控a包括pai-1 4g/5g野生型质粒1条，thbd c.-151g》t野生型质粒1条，proc 565c》t等位基因野生型和突变型质粒各1条制备成混合液；
15.所述阳性质控品b包括pai-1 4g/5g突变型质粒1条，thbd c.-151g》t突变型质粒1条，proc c.574_576del等位基因野生型和突变型质粒各1条制备成混合液；
16.所述阴性对照为无菌去离子水。
17.优选的，所述试剂盒中pcr混合液引物的浓度为0.20μm；探针的浓度为0.1μm，引物探针、taq dna聚合酶、dntp、10x buffer、bsa配制成20ul/反应，5ul模板/反应，共25ul反应体系。
18.优选的，所述试剂盒采用多重pcr-荧光探针法，在完全封闭的反应体系中进行核酸扩增与检测，pcr扩增反应体系为0.25ul的taq dna聚合酶、2.5ul的10x buffer、0.5ul的dntp、0.3ul的bsa、5ul模板dna，并用无菌去离子水补至25ul总体积，扩增程序为：95℃，2分钟，1个循环，95℃，10s，60℃，30s采集荧光，45个循环。
19.优选的，所述试剂盒可以检测的样品为人全血或外周血样本。
20.优选的，还包括同时检测pai-1 4g/5g、thbd c.-151g》t和proc565c》t(rs146922325)和proc c.574_576del位点基因多态性的引物和探针；
21.所述pai-1 4g/5g的引物探针：
22.pai-1 4g-f 5
’‑3’
:gagagtctggacacgtgtgga；
23.pai-1 5g-f 5
’‑3’
:agagtctggacacgtggtgga；
24.pai-1 4g/5g-r 5
’‑3’
:ggactcttggtctttccctcat；
25.pai-1 4g/5g-p 5
’‑3’
:fam-tcagccgtgtatcatcggaggcg-bhq1；
26.所述thbd c.-151g》t的引物探针：
27.thbd c.-151g》t-f 5
’‑3’
:accaggaccccaagcatgtta；
28.thbd c.-151g-r 5
’‑3’
:catgtcagaggctgcctcg；
29.thbd c.-151t-r 5
’‑3’
:catgtcagaggctgcctct；
30.thbd c.-151g》t-p 5
’‑3’
:hex-ctgcgcgcagcggcaagaag-bhq1；
31.所述proc 565c》t的引物探针：
32.proc 565c》t
–
f 5
’‑3’
:gcctacctcagtgaagttccc；
33.proc 565c》t
–
r 5
’‑3’
:cgcttgtcttctgtgtctcg；
34.proc 565c
–
p 5
’‑3’
:rox-tggaag cggatggagaag-bhq2；
35.proc 565t
–
p 5
’‑3’
:cy5-tggaag tggatggagaag-bhq2；
36.所述proc c.574_576del的引物探针：
37.proc c.574_576del
–
f 5
’‑3’
:gcctacctcagtgaagttccc；
38.proc c.574_576del
–
r 5
’‑3’
:cgcttgtcttctgtgtctcg；
39.proc c.574_576dup
–
p 5
’‑3’
:rox-ctgcgct tcttctccatc-bhq2；
40.proc c.574_576del
–
p 5
’‑3’
:cy5-gactgcgcttct ccatc-bhq2。
41.优选的，所述pai-1 4g/5g和所述thbd c.-151g》t基因多态性因为序列中gc含量高，特异性探针较难设计，所以采用突变扩增阻滞系统，当特异性引物3’末端碱基与突变位点处碱基互补时，开始扩增，并在taq dna聚合酶的作用将探针水解，释放出荧光报告基团，产生荧光信号，当特异性引物3’末端碱基与突变位点处碱基不完全互补，扩增受阻滞或以低于正常配对引物的速度延伸，因而不能水解探针，不能产生荧光信号；
42.所述pai-1 4g-f和所述pai-1 5g-f分别为pai-1 4g/5g 4g型和5g型的特异性arms引物，所述thbd c.-151g-r和所述thbd c.-151t-r分别为thbd c.-151g》t野生型和突变型的特异性arms引物；
43.所述pai-1 4g-f和所述pai-1 5g-f包含一个错配碱基修饰，序列中用小写字母表示，通过错配碱基的引入提高arms引物的特异性；
44.所述pai-1 4g-f引物距3’的第三个碱基引入一个错配碱基；
45.所述pai-1 5g-f引物距3’的第三个碱基引入一个错配碱基。
46.优选的，所述proc 565c
–
p、所述proc 565t
–
p、所述proc c.574_576dup
–
p和所述proc c.574_576del
–
p为特异性taqman探针，在延伸过程中，当taqman探针与模板完全匹配时taqman探针结合到dna模板，并被taq dna聚合酶水解释放出荧光报告基团，产生荧光信号，当taqman探针与模板不完全匹配时taqman，taqman探针不能与模板结合，或结合效率降低，从而不产生荧光信号或微弱的荧光信号，为了进一步提高探针的特异性在探针的snp位点进行lna修饰，lna是一种寡核苷酸衍生物，经过lna修饰可提高taqman探针的退火温度，减少taqman探针长度，提高taqman探针特异性，并增强识别snp的能力，序列中锁核酸修饰的碱基前面加“ ”；
47.所述proc 565c
–
p探针序列的第三个碱基进行lna修饰；
48.所述proc 565t
–
p探针序列的第四个碱基进行lna修饰；
49.所述proc c.574_576dup
–
p探针序列的第五个碱基进行lna修饰；
50.所述的proc c.574_576del
–
p探针序列的第十个碱基进行lna修饰。
51.优选的，上述的试剂盒在pai-1 4g/5g、thbd c.-151g》t和proc565c》t(rs146922325)和proc c.574_576del基因多态性的检测中应用。
52.人类静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒的制备方法，包括具体步骤如下：
53.s1，采用血液基因组dna提取试剂盒提取待测样本的dna作为模板；
54.s2，从试剂盒中取出试剂a、试剂b、阳性质控a、阳性质控品b和阴性对照，室温下避光解冻，涡旋振荡混匀后，离心，将试剂a、试剂b分别加到八连排中，每个反应体系20ul；
55.s3，取5ul模板加到s2中的pcr反应体系试剂a和试剂b管中，分别取5ul阳性质控品b、阴性对照加到对应pcr反应体系中，作为阳性对照和阴性对照，盖好管盖，混匀、离心；
56.s4，将离心好的八连排放入实时荧光pcr仪中，设置反应程序进行pcr扩增及荧光信号采集，pcr扩增反应程序为：95℃，2分钟，1个循环；95℃，10s，60℃，30s采集荧光，45个
循环；
57.s5，根据实验结果对样本的pai-1 4g/5g、thbd c.151g》t、proc 565c》t和proc c.574_576del基因型进行分析。
58.与现有技术相比：
59.1.本发明使用引入错配碱基的arms引物及锁核酸修饰的特异性探针，增强对碱基的识别能力，从而对基因多态性的检测具有极高的灵敏度和特异性；
60.2.本发明能够仅通过两个反应体系实现对人血液样本中pai-1 4g/5g、thbd c.151g》t、proc 565c》t和proc c.574_576del四个中国人群静脉血栓风险明显相关的基因多态性准确分型，特异性好，可对遗传性静脉血栓风险进行辅助诊断，指导临床医生精准预防和治疗静脉血栓的发生；
61.3.本发明使用pcr-荧光探针法，扩增反应及检测采用完全封闭的系统，避免产生气溶胶污染导致的假阳性，操作方法简单，检测周期短，检测成本低，灵敏度和特异性好。
附图说明
62.图1为本发明突变扩增示意图；
63.图2为本发明proc 565c
–
p、proc 565t
–
p、proc c.574_576dup
–
p和proc c.574_576del
–
p延伸示意图；
64.图3为本发明阳性质控a在试剂a中的扩增曲线图；
65.图4为本发明阳性质控品b在试剂b中的扩增曲线图；
66.图5为本发明pai-1 4g/5g位点杂合突变样本在试剂a和试剂b的扩增曲线图；
67.图6为本发明thbd c.151g》t位点纯合野生型样本在试剂a和试剂b的扩增曲线图；
68.图7为本发明proc 565c》t位点纯合野生型在试剂a中的扩增曲线图；
69.图8为本发明proc c.574_576del位点纯合野生型在试剂b中的扩增曲线图。
具体实施方式
70.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步地详细描述。
71.本发明提供人类静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒，请参阅图1-图8，包括同时检测pai-1 4g/5g、thbd c.-151g》t和proc 565c》t(rs146922325)和proc c.574_576del基因多态性的试剂盒，试剂盒包括试剂a、试剂b、阳性质控a、阳性质控品b和阴性对照；
72.试剂a包括pai-1 4g/5g野生型和thbd c.-151g》t野生型的特异性引物及普通探针和配对引物，proc 565c》t上下游引物、proc 565c》t野生型和突变型特异性探针，taq dna聚合酶、10xbuffer，dntp和bsa；
73.试剂b包括pai-1 4g/5g突变型和thbd c.-151g》t突变型的特异性引物及普通探针和配对引物，proc c.574_576del上下游引物、proc c.574_576del野生型和突变型特异性探针，taq dna聚合酶、10xbuffer，dntp和bsa；
74.阳性质控a包括pai-1 4g/5g野生型质粒1条，thbd c.-151g》t野生型质粒1条，proc 565c》t等位基因野生型和突变型质粒各1条制备成混合液；
75.阳性质控品b包括pai-1 4g/5g突变型质粒1条，thbd c.-151g》t突变型质粒1条，
proc c.574_576del等位基因野生型和突变型质粒各1条制备成混合液；
76.阴性对照为无菌去离子水。
77.试剂盒中pcr混合液引物的浓度为0.20μm；探针的浓度为0.1μm，引物探针、taq dna聚合酶、dntp、10x buffer、bsa配制成20ul/反应，5ul模板/反应，共25ul反应体系。
78.试剂盒采用多重pcr-荧光探针法，在完全封闭的反应体系中进行核酸扩增与检测，pcr扩增反应体系为0.25ul的taq dna聚合酶、2.5ul的10x buffer、0.5ul的dntp、0.3ul的bsa、5ul模板dna，并用无菌去离子水补至25ul总体积，扩增程序为：95℃，2分钟，1个循环，95℃，10s，60℃，30s(采集荧光)，45个循环。
79.试剂盒可以检测的样品为人全血或外周血样本。
80.还包括同时检测pai-1 4g/5g、thbd c.-151g》t和proc 565c》t(rs146922325)和proc c.574_576del位点基因多态性的引物和探针；
81.pai-1 4g/5g的引物探针：
82.pai-1 4g-f 5
’‑3’
:gagagtctggacacgtgtgga；
83.pai-1 5g-f 5
’‑3’
:agagtctggacacgtggtgga；
84.pai-1 4g/5g-r 5
’‑3’
:ggactcttggtctttccctcat；
85.pai-1 4g/5g-p 5
’‑3’
:fam-tcagccgtgtatcatcggaggcg-bhq1；
86.thbd c.-151g》t的引物探针：
87.thbd c.-151g》t-f 5
’‑3’
:accaggaccccaagcatgtta；
88.thbd c.-151g-r 5
’‑3’
:catgtcagaggctgcctcg；
89.thbd c.-151t-r 5
’‑3’
:catgtcagaggctgcctct；
90.thbd c.-151g》t-p 5
’‑3’
:hex-ctgcgcgcagcggcaagaag-bhq1；
91.proc 565c》t的引物探针：
92.proc 565c》t
–
f 5
’‑3’
:gcctacctcagtgaagttccc；
93.proc 565c》t
–
r 5
’‑3’
:cgcttgtcttctgtgtctcg；
94.proc 565c
–
p 5
’‑3’
:rox-tggaag cggatggagaag-bhq2；
95.proc 565t
–
p 5
’‑3’
:cy5-tggaag tggatggagaag-bhq2；
96.proc c.574_576del的引物探针：
97.proc c.574_576del
–
f 5
’‑3’
:gcctacctcagtgaagttccc；
98.proc c.574_576del
–
r 5
’‑3’
:cgcttgtcttctgtgtctcg；
99.proc c.574_576dup
–
p 5
’‑3’
:rox-ctgcgct tcttctccatc-bhq2；
100.proc c.574_576del
–
p 5
’‑3’
:cy5-gactgcgcttct ccatc-bhq2。
101.pai-1 4g/5g和thbd c.-151g》t基因多态性因为序列中gc含量高，特异性探针较难设计，所以采用突变扩增阻滞系统，如图1所示，当特异性引物3’末端碱基与突变位点处碱基互补时，开始扩增，并在taq dna聚合酶的作用将探针水解，释放出荧光报告基团，产生荧光信号，当特异性引物3’末端碱基与突变位点处碱基不完全互补，扩增受阻滞或以低于正常配对引物的速度延伸，因而不能水解探针，不能产生荧光信号；
102.pai-1 4g-f和pai-1 5g-f分别为pai-1 4g/5g 4g型和5g型的特异性arms引物，thbd c.-151g-r和thbd c.-151t-r分别为thbd c.-151g》t野生型和突变型的特异性arms引物；
103.pai-1 4g-f和pai-1 5g-f包含一个错配碱基修饰，序列中用小写字母表示，通过错配碱基的引入提高arms引物的特异性；
104.pai-1 4g-f引物距3’的第三个碱基引入一个错配碱基；
105.pai-1 5g-f引物距3’的第三个碱基引入一个错配碱基。
106.proc 565c
–
p、proc 565t
–
p、proc c.574_576dup
–
p和proc c.574_576del
–
p为特异性taqman探针，如图2所示，在延伸过程中，当taqman探针与模板完全匹配时taqman探针结合到dna模板，并被taq dna聚合酶水解释放出荧光报告基团，产生荧光信号，当taqman探针与模板不完全匹配时taqman，taqman探针不能与模板结合，或结合效率降低，从而不产生荧光信号或微弱的荧光信号，为了进一步提高探针的特异性在探针的snp位点进行lna修饰，lna是一种寡核苷酸衍生物，经过lna修饰可提高taqman探针的退火温度，减少taqman探针长度，提高taqman探针特异性，并增强识别snp的能力，序列中锁核酸修饰的碱基前面加“ ”；
107.proc 565c
–
p探针序列的第三个碱基进行lna修饰；
108.proc 565t
–
p探针序列的第四个碱基进行lna修饰；
109.proc c.574_576dup
–
p探针序列的第五个碱基进行lna修饰；
110.的proc c.574_576del
–
p探针序列的第十个碱基进行lna修饰。
111.上述的试剂盒在pai-1 4g/5g、thbd c.-151g》t和proc 565c》t(rs146922325)和proc c.574_576del基因多态性的检测中应用。
112.人类静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒的制备方法，包括具体步骤如下：
113.s1，采用血液基因组dna提取试剂盒提取待测样本的dna作为模板；
114.s2，从试剂盒中取出试剂a、试剂b、阳性质控a、阳性质控品b和阴性对照，室温下避光解冻，涡旋振荡混匀后，离心，将试剂a、试剂b分别加到八连排中，每个反应体系20ul；
115.s3，取5ul模板加到s2中的pcr反应体系试剂a和试剂b管中，分别取5ul阳性质控品b、阴性对照加到对应pcr反应体系中，作为阳性对照和阴性对照，盖好管盖，混匀、离心；
116.s4，将离心好的八连排放入实时荧光pcr仪中，设置反应程序进行pcr扩增及荧光信号采集，pcr扩增反应程序为：95℃，2分钟，1个循环；95℃，10s，60℃，30s(采集荧光)，45个循环；
117.s5，根据实验结果对样本的pai-1 4g/5g、thbd c.151g》t、proc 565c》t和proc c.574_576del基因型进行分析。
118.如图3所示：图中a为pai-1 4g/5g野生型质控品的扩增曲线，b为thbd c.151g》t野生型质控品扩增曲线，c为proc 565c》t野生型质控品扩增曲线，d为proc 565c》t突变型质控品扩增曲线。
119.如图4所示：图中a为pai-1 4g/5g突变型质控品的扩增曲线，b为thbd c.151g》t突变型质控品扩增曲线，c为proc c.574_576del野生型质控品扩增曲线，d为proc c.574_576del突变型质控品扩增曲线。
120.如图5所示：图中a为pai-1 4g/5g野生型在试剂a中的扩增曲线，b为pai-1 4g/5g突变型在试剂b中的扩增曲线，a和b同时有扩增曲线为杂合突变样本。
121.如图6所示：图中a为thbd c.151g》t野生型在试剂a中的扩增曲线，b为thbd c.151g》t突变型在试剂b中的扩增曲线，a有明显的扩增，b无扩增，为纯合野生型样本。
122.如图7所示：图中a为proc 565c》t野生型在试剂a中的扩增曲线，b为proc 565c》t突变型在试剂a中的扩增曲线，a有明显的扩增，b无扩增，为proc 565c》t野生纯合型。
123.如图8所示：图中a为proc c.574_576del野生型在试剂b中的扩增曲线，b为proc c.574_576del突变型在试剂b中的扩增曲线，a有明显的扩增，b无扩增，为proc c.574_576del野生纯合型。
124.本发明试剂盒从ncbi上获得pai-1 4g/5g、thbd c.151g》t、proc565c》t和proc c.574_576del基因cds序列，根据引物探针设计原理，利用primer 5和primer express软件分别设计了能扩增各突变位点的多对上下游引物和探针，并用实时荧光定量pcr技术对其进行验证，发现不同长度及不同修饰的引物探针对扩增效率及特异性有明显的影响，本发明挑选出特异性较好、灵敏度较高、扩增效率较高的引物探针组合，具体引物探针信息如下表：
125.pai-1 4g/5g、thbd c.151g》t、proc 565c》t和proc c.574_576del基因引物与探针序列，如下表所示：
126.[0127][0128]
注：表中小写字母代表错配碱基，“ n”表示锁核酸修饰碱基。
[0129]
试剂盒组成，如下表所示：
[0130]
[0131][0132]
试剂盒检测结果判定，如下表所示：
[0133]
[0134][0135]
虽然在上文中已经参考实施方式对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施方式中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施方式，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。