一种水稻异源胞质育性恢复QTLqRf5.1的分子标记及其应用

一种水稻异源胞质育性恢复qtl qrf5.1的分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及水道育种技术领域，具体是指一种水稻异源胞质育性恢复qtl qrf5.1的分子标记及其应用。


背景技术：

2.水稻是全球最重要的三大粮食作物之一，世界上超过50％人群以稻米为主食，因此水稻的高产、稳产与全球粮食安全和社会稳定密切相关。杂种优势利用能有效地提高农作物产量、品质和抗性。水稻三系成功配套，极大推动了水稻杂种优势的利用和杂交水稻的在中国大规模推广应用，其种植面积占到水稻种植面积的1/2(袁隆平等，2010)。
3.水稻细胞质雄性不育和恢复基因的发掘和利用极大提升我国杂交水稻的研究。三系杂交稻的商业化应用除了需培育出优良的不育系外，还要选育与之配套的优良恢复系。因此，在三系杂交水稻研究的过程中，恢复基因的研究备受关注。随着分子生物学技术迅猛快速的发展，极大推动了水稻细胞质雄性不育及其育性恢复的分子机理研究。自20世纪70年代起，国内外研究者对野败型(cms-wa)、红莲型(cms-hl)、包台型(cms-bt)和矮败型(cms-da)等不同类型cms开展了育性恢复qtl分析，在水稻12条染色体上检测到超过75个不同胞质类型育性恢复qtl，其中野败型恢复基因rf4、红莲型育性恢复基因rf5和rf6、包台型恢复基因rf1(rf1a和rf1b)、ifr1、lead-rice型恢复基因rf2以及cw型恢复基因rf17等7个恢复基因被克隆(段琉颖等，2022)。如，庄杰云等(2001)在1号染色体rg532-rg472区间上定位到野败型恢复基因qrf1，其表型贡献率为43.0％；ngangkham等(2010)利用pusa6a和prr78构建的f2群体将野败型育性恢复qtl rf4精细定位至区间rm6737-rm6100，其物理位置约104kb。这些报道到的不同胞质不育类型的育性恢复qtls/基因中绝大部分来自栽培稻和地方品种，有关野生稻恢复基因的发掘和定位研究较为薄弱。
4.自我国三系杂交稻成功配套后，涌现了ir24、ir26、ir30、明恢63、扬稻6号(9311)以及华占等一批王牌的骨干籼型恢复系，然而这些骨干恢复系遗传背景单一，其系谱大部分含有东南亚地区农家品种peta的遗传成分，属于南亚、东南亚中籼生态型，这大大限制高产优质杂交组合的培育。因此，三系杂交稻育种中亟需丰富恢复系的遗传多样性。东乡野生稻是迄今世界分布最北的普通野生稻(oryza rufipogon griff)，是江西特有的野生资源，研究表明东乡野生稻对多种细胞质雄性不育具有恢复特性(张金伟等，2011)。从东乡野生稻中发掘并利用细胞质雄性不育恢复源对促进杂交水稻的发展具有深远的意义。本发明在水稻第5号染色体上定位并验证了东乡野生稻的异源胞质育性恢复基因qrf5.1，并且获得其紧密连锁的分子标记，对促进其在恢复系选育及分子标记辅助育种具有重要的意义。
5.传统的水稻育种主要是通过表型选择，这不仅要求研究人员具有丰富的经验，而且育种年限长达数年甚至十几年的时间。因此，结合分子生物学与基因组学的研究手段与方法，快速检测和辅助选择水稻育性恢复的目标基因/qtl，进行恢复系分子育种改良加快育种进程，实现新的突破。本领域的技术人员致力于开发一种可以快速检测水稻材料水稻育性恢复基因qrf5.1的分子标记，进而实现育性恢复基因qrf5.1的分子育种应用。


技术实现要素：

6.本发明目的是要解决的技术问题是提供一种调控水稻异源胞质不育育性恢复主效qtl及与其紧密连锁的分子标记，用于选育异源胞质不育系配套的恢复系品种，可提高筛选效率和品种选育进程。
7.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种水稻异源胞质育性恢复qtl qrf5.1的分子标记，包括调控水稻异源胞质育性恢复的主效qtl，所述主效qtl位于水稻第05号染色体上，命名为qrf5.1(见图1)；区间遗传距离为104.8cm-110.6cm，物理距离为21,378,343-22,671,210bp；
8.还包括用于检测与异源胞质不育育性恢复的主效qtls的ssr引物对rf01，所述引物对rf01具有下述1)～3)任一项核苷酸序列之一：
9.1)所述引物对rf01中上游引物的核苷酸序列为序列表中seq id no.1所示的核苷酸序列，所述引物对rf01中下游引物的核苷酸序列为序列表中seq id no.2所示的核苷酸序列；
10.2)在高严谨条件下可与序列表中seq id no.1或seq id no.2限定的dna序列杂交的核苷酸序列；
11.3)与1)或2)限定的dna序列具有90％以上同源性，且能扩增出水稻育性恢复相关基因的序列；
12.rf01-f：5'-gagtggaaatggcactta-3'(seq id no.1)
13.rf01-r：5'-atttcacctccctcatct-3'(seq id no.2)。
14.进一步的，用于检测ssr标记的引物对rf01在制备用于检测或辅助选择水稻育性恢复基因qrf5.1的试剂盒或pcr试剂中的应用；所述试剂盒或pcr试剂包括权利要求1所述的引物对rf01。
15.进一步的，所述试剂盒或pcr试剂还包含有pcr技术常用的试剂。
16.进一步的，所述的试剂盒或pcr试剂在检测水稻异源胞质育性恢复基因qrf5.1和/或在水稻恢复系分子标记辅助选择育种中的应用。
17.一种检测水稻育性恢复分子标记辅助育种方法，所述方法包括以下步骤：
18.(1)提取待测水稻样品基因组dna；
19.(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，采用权利要求1所述引物对rf01进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；
20.(3)将步骤(2)得到的pcr扩增产物进行浓度为6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，如果该待测水稻样品扩增出大小为202bp的条带，则该待测水稻携带异源恢复育性基因qrf5.1的水稻品系或候选的育性恢复基因水稻品系。
21.进一步的，步骤(2)所述pcr扩增的反应体系为：2
×
tolo fasttaq premix 5.0μl，10pmol/μl的权利要求1引物对rf01 1μl，300-500ng/μl的水稻基因组模板dna 1μl，加灭菌后的超纯水至10μl。
22.进一步的，步骤(2)所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次；最后72℃延伸10min；扩增产物在4℃下保存。
23.进一步的，所述的水稻携带育性恢复基因qrf5.1。
24.本发明与现有技术相比的优点在于：(1)通过筛选获得与水稻育性恢复紧密连锁
的分子标记，为qrf5.1分子标记辅助选择育种奠定了基础。以待测水稻基因组dna为模板，利用本发明的引物对进行扩增，若所得扩增产物大小为202bp，则判定所述待测水稻具有育性恢复基因。
25.(2)本发明的分子标记准确性高、稳定性好。由于该标记与水稻育性恢复基因qrf5.1紧密连锁，因此可在水稻苗期利用该标记进行快速便捷精准地选择携带目标基因的单株，不仅减少测交工作人工成本、缩减不育系测交单株数量，而且水稻抽穗扬花前预先安排不育系测配工作，加速育种工作进程。
26.(3)本发明提供的分子标记可广泛应用于分子辅助育种中水稻育性恢复基因的分子检测(标记位于水稻参考基因组第5号染色体21,378,325～21,378,343bp之间)，为共显性标记，可以检测纯合和杂合个体，缩短育种周期，提高育种效率和进程。
附图说明
27.图1为水稻异源胞质育性恢复的主效qtls qrf5.1及其连锁标记rf01的染色体位置；
28.图2为本发明实施例中的2019年利用分子标记rf01检测协青早b/东乡野生稻bc4f5群体的基因型；
29.图3为本发明实施例中的2020年利用分子标记rf01检测协青早b/东乡野生稻bc4f6群体的基因型；
30.图4为本发明实施例中的2021年东b11a与协青早b及回交群体的测交花药镜检图；
31.图5、图6分别为本发明实施例中2套测交f1群体中禾a/(协青早b/东乡野生稻bc4f5)和东b11a/(协青早b/东乡野生稻bc4f6)结实率分布图。
具体实施方式
32.下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例仅用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。
33.实施例1、协青早b/东乡野生稻渐渗系的构建及发展
34.东乡野生稻对多种细胞质雄性不育具有恢复特性。本发明以东乡野生稻作为供体亲本，进一步以矮败型保持系协青早b作为轮回亲本进行杂交、回交、自交，获得1套bc1f
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协青早b//东乡野生稻/协青早b回交重组自交群体。利用该套群体在水稻第5染色体检测到育性恢复qtl qrf5.1，选择携带目标qtl qrf5.1的株系(株系编号5339)与协青早b回交，结合分子标记辅助进行前景选择和背景选择，采用单粒传法分别构建了2套bc4f5和bc4f6代协青早b/东乡野生稻渐渗系群体。
35.所有材料分别于2019年、2020年种植于江西省农业科学院水稻研究所南昌实验基地，5月下旬播种，6月中旬移栽，移栽15天后取协青早b/东乡野生稻bc4f5和bc4f6群体单株叶片，提取dna后进行基因型检测，抽穗期(挑选亲本纯合型的单株)取穗分别与野败型不育系中禾a、东野型不育系东b11a等不同胞质类型的不育系进行杂交，成熟后收取f0杂交种，并在分别于2020和2021年种植测交f1群体，考察其自然结实率。
36.实施例2、bc4f5和bc4f6代协青早b/东乡野生稻测交群体结实率考察
37.2020、2021年于江西省农业科学院水稻研究所南昌实验基地种植测交群体，随机
区组设计，3次重复，每区组种植32株，移栽规格16.5cm
×
20cm，水肥管理按常规进行。待成熟期，每重复每份测交材料取株系中间5株，室内自然晾干后，进行室内人工考种，考察水稻结实率等相关性状。
38.实施例3、异源胞质不育系育性恢复qtl qrf5.1定位与验证
39.利用mapmaker 3.0软件对192个bc4f5协青早b/东乡野生稻群体的遗传距离，用kosambi函数将重组率转化为遗传距离，构建bc4f5群体的连锁遗传图。采用软件windows qtl cartographer 2.5对bc4f5协青早b/东乡野生稻群体基因型数据及其测交群体结实率表型数据进行qtl分析。采用复合区间作图法(composite interval mapping,cim)，以lod值2.5作为检测阈值来判定是否存在qtl，最后在5号染色体上的rf01-rm188间定位到一个育性恢复主效qtl，其遗传距离为104.8cm～110.6cm，物理距离为21,378,343～22,671,210bp，并命名为qrf5.1。
40.实施例4、水稻异源胞质育性恢复主效qtl qrf5.1连锁标记的应用
41.2020年和2021年，分别于江西省农业科学院实验基地种植中禾a/(协青早b/东乡野生稻bc4f5)和东b11a/(协青早b/东乡野生稻bc4f2)测交f1群体。于抽穗杨花期，按基因型选择协青早b型、东野型及协青早b与不育系东b11a测交f1单株的幼穗，利用i2-ki溶液进行染色后，在10倍显微镜下随机选择1个视野观察亲本协青早b、协青早b纯合型(单株编号103)和东乡野生稻纯合型(单株编号2)与东b11a测交f1植株的花粉育性(具体结果见图4)，其花粉可育率分别为0.0％、13.45％和78.83％。
42.在qtl位点qrf5.1下游设定分子标记rf01,
43.所述分子标记rf01的引物对为：
44.上游引物gagtggaaatggcactta，
45.下游引物atttcacctccctcatct；
46.取亲本协青早b、东乡野生稻及其渐渗系群体bc4f5和bc4f6的水稻叶片，分别进行如下操作：
47.提取基因组dna，利用上述分子标记对其基因组dna进行pcr扩增，pcr反应体系：2
×
tolo fasttaq premix 5.0μl，10pmol/μl的权利要求1所述引物对1μl，300-500ng/μl的水稻基因组模板dna 1μl，加灭菌后的超纯水至10μl。95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次；最后72℃延伸10min。pcr扩增产物在6％聚丙烯凝胶电泳检测。通过带型分析来确定是否存在相应的标记，若条带趋向于亲本协青早b，则说明该株系不携带异源胞质恢复基因qrf5.1，若趋向东乡野生稻则说明携带异源胞质恢复基因qrf5.1(图2、图3)。
48.具体如下：
49.一、当分子标记rf01的引物对进行pcr扩增时，如图2、图3所示，协青早b的条带为下带；东乡野生稻的条带为上带；
50.二、挑选渐渗系群体bc4f5和bc4f6中rf01标记带型为协青早b型/东野型纯合单株分别与不育系中禾a和不育系东b11a进行测交；
51.三、随后对受试株系结实率与预测结果进行比对，保持系协青早b与不育系中禾a及东b11a的测交结实率分别是21.3％和13.5％；不具有rf01标记的单株测交结实率大部分都在10％-30％，而携带rf01标记的单株测交f1后代结实率均在在50％以上。
52.四、因此，结果显示预测结果与实际检测结果相吻合(图5、图6)。
53.综上所述，本发明的调控水稻调控水稻异源胞质不育育性恢复的主效qtl位点，可以有效加快优化水稻恢复系品种选育进程。在水稻分子辅助育种的过程中可以培育水稻异源胞质育性恢复的水稻恢复系。此种方法简便易行，安全有效，适于大规模推广应用。
54.最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
55.以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，具体实施方式中所示的也只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。