一种含中药外泌体的疤痕敷料及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种含中药外泌体的疤痕敷料及其制备方法。


背景技术：

2.皮肤是人体抵御病原体入侵的第一道防线，然而在日常生活中，皮肤往往受到多种外界因素的影响而造成皮肤创伤，给个人带来或大或小的身体和心理负担。疤痕是各种创伤引起的正常皮肤组织外观形态和组织病理学改变的统称，是在创伤修复过程中组织不能完全自行正常修复，转由纤维组织代替修复的必然产物。伤口愈合过程中各种原因导致的疤痕过度增长，即称之为病理性疤痕，包括增生性疤痕和疤痕疙瘩。病理性疤痕形状各异，表面呈红色或紫红色，不仅影响美观，同时会伴有疼痛、瘙痒甚至神经性疼痛，严重时还会形成挛缩而产生功能障碍，严重影响患者正常的生活质量，因此疤痕治疗的产品十分具有应用前景。
3.外泌体是内膜衍生的一类粒径为30-200nm的囊泡，由脂质双分子层及其内部包含的蛋白质、脱氧核糖核苷酸(dna)、核糖核苷酸(rna)组成，具有沟通细胞间通讯的作用。从中药中提取的外泌体为中药外泌体，中药外泌体具有稳定的双分子磷脂结构，内部空腔有助于负载大量的水溶性物质，而双分子磷脂中间的疏水区则能负载疏水性物质，这种特殊结构能保护其负载药物在恶劣环境下长期存在而不被降解或稀释，能够很好透过皮肤屏障，靶向作用于患处。中药外泌体作为药物载体，可以有效解决药物本身存在的水溶性差、生物利用度低、渗透滞留皮肤能力低、体内分布不理想、对细胞靶向定位差等问题。现代药理研究表明，中药的某些活性单体对疤痕有明显功效，其制成的中药外泌体在创伤修复过程中也发挥重要的调节作用，可促进血管再生、优化成纤维细胞性能，调控纤维化进程，抑制疤痕的效果十分显著。


技术实现要素：

4.为了解决现有背景技术的不足，本发明公开了一种含中药外泌体的疤痕敷料及其制备方法，所述的疤痕敷料由中药外泌体、苦参碱、姜黄素、丹参酮、二甲基硅油等组成。且经现代药理学研究发现中药的某些活性单体对疤痕有明显功效，如苦参碱、姜黄素、丹参酮iia，尤其以中药外泌体作为苦参碱、姜黄素、丹参酮iia的载体，具有独特优势。
5.苦参碱，由豆科植物苦参经乙醇等有机溶剂提取而成，研究发现，苦参碱可以抑制疤痕成纤维细胞的增殖，使成纤维细胞中凋亡相关因子bax表达上调，p53和bc1-2表达下调，从而促进成纤维细胞凋亡。
6.姜黄素，由姜科、天南星科中姜黄等植物的根茎中提取的一种二酮类化合物，具有抗炎、抗氧化应急抑制恶性肿瘤细胞增殖等药理作用，能抑制疤痕疙瘩成纤维细胞的增殖，并使细胞周期停滞在g1期。
7.丹参酮iia，由唇形科植物丹参的干燥根及根茎中提取的一种二萜类化合物，具有
改善冠状动脉循环、抗氧化作用、抗感染等药理作用。研究表明丹参酮iia能够促进创面愈合，抑制成纤维细胞增殖，从而减轻疤痕形成。
8.本发明提供了一种含中药外泌体的疤痕敷料，解决了现有技术中预防和治疗病理性疤痕效果不佳、有效成分溶解度不高、不稳定、靶向性低等问题，本发明采用的技术手段如下：
9.一种含中药外泌体的疤痕敷料，由如下重量份的组分组成：中药外泌体3-12份、苦参碱2-6份、姜黄素4-7份、丹参酮iia 5-12份、二甲基硅油10-30份、甘油1-5份、卡波姆2-6份、聚山梨酸酯-801-5份、三乙醇胺2-5份、羟苯乙酯0.1-0.5份、纯化水5-33份。
10.优选的，敷料由如下重量份的组分组成：中药外泌体7份、苦参碱4份、姜黄素6份、丹参酮iia 9份、二甲基硅油20份、甘油3份、卡波姆4份、聚山梨酸酯-803份、三乙醇胺4份、羟苯乙酯0.3份、纯化水15份。
11.优选的，中药外泌体来源为丹参、姜黄、积雪草、大黄、芦荟中的一种或多种。
12.一种含中药外泌体的疤痕敷料的制备方法，包括如下步骤：
13.(1)取所述重量的卡波姆、纯化水加入水相反应釜中，溶胀，搅拌至无颗粒状，再加入三乙醇胺调节ph至6.0-8.0，备用；
14.(2)取所述重量的二甲基硅油、保湿剂甘油、乳化剂聚山梨酸酯-80、防腐剂羟苯乙酯加入到油相反应釜，搅拌后，加入上述的水相，混合均匀，制得预凝胶体系；
15.(3)取所述中药榨汁，过滤，将滤汁在2-9℃、2000-6000g进行差速离心，离心30-70分钟，取得上清液。将上清液在2-9℃、10000-15000g下，离心40-90分钟后，取得上清液。将上清液在2-9℃、10000-20000g下，离心40-90分钟后，取得沉淀。将沉淀用纯化水重悬后取下层，即得中药外泌体。再通过电穿孔方式，将苦参碱、姜黄素、丹参酮iia装载入中药外泌体，即得负载苦参碱、姜黄素、丹参酮iia的外泌体；
16.(4)将上述负载苦参碱、姜黄素、丹参酮iia的中药外泌体加入预凝胶体系中，混合均匀，即得一种含中药外泌体的疤痕敷料。
附图说明
17.图1为本发明实验外泌体的透射电镜形态图。
18.图2为本发明实验的家兔皮肤疤痕治疗效果图。
具体实施方式
19.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，并不因此将本发明限制在这些实施例的范围之内。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
20.实施例1
21.一种含中药外泌体的疤痕敷料的制备方法，包括如下步骤：
22.(1)取卡波姆2份、纯化水5份，加入水相反应釜中，溶胀，搅拌至无颗粒状，再加入三乙醇胺调节ph至6.0-8.0，备用；
23.(2)取二甲基硅油10份、聚山梨酸酯-801份、羟苯乙酯0.1份、甘油1份，加入到油相反应釜，搅拌后，混合所述的水相和油相，制得预凝胶体系；
24.(3)取丹参、姜黄、积雪草、大黄、芦荟中的一种或多种，粉碎，在2℃、2000g进行差速离心，离心30分钟，取得上清液。将上清液在4℃、10000g下，离心40分钟后，取得上清液。将上清液在2℃、10000g下，离心40分钟后，取得沉淀。将沉淀用纯化水重悬后取下层，即得中药外泌体。取3份中药外泌体，再将苦参碱2份、姜黄素4份、丹参酮iia 5份通过电穿孔方式装载入中药外泌体，即得负载苦参碱、姜黄素、丹参酮iia的外泌体；
25.(4)将上述负载苦参碱、姜黄素、丹参酮iia的中药外泌体加入预凝胶体系中，混合均匀，即得一种含中药外泌体的疤痕敷料。
26.实施例2
27.一种含中药外泌体的疤痕敷料的制备方法，包括如下步骤：
28.(1)取卡波姆3份、纯化水10份，加入水相反应釜中，溶胀，搅拌至无颗粒状，再加入三乙醇胺调节ph至6.0-8.0，备用；
29.(2)取二甲基硅油15份、聚山梨酸酯-802份、羟苯乙酯0.2份、甘油2份，加入到油相反应釜，搅拌后，混合所述的水相和油相，制得预凝胶体系；
30.(3)取丹参、苦参、姜黄中的一种，粉碎，在3℃、3000g进行差速离心，离心40分钟，取得上清液。将上清液在2℃、12000g下，离心50分钟后，取得上清液。将上清液在4℃、12000g下，离心50分钟后，取得沉淀。将沉淀用纯化水重悬后取下层，即得中药外泌体。取5份中药外泌体，再将苦参碱3份、姜黄素5份、丹参酮iia7份通过电穿孔方式装载入外泌体，即得负载苦参碱、姜黄素、丹参酮iia的外泌体；
31.(4)将上述负载苦参碱、姜黄素、丹参酮iia的中药外泌体加入预凝胶体系中，混合均匀，即得一种含中药外泌体的疤痕敷料。
32.实施例3
33.一种含中药外泌体的疤痕敷料的制备方法，包括如下步骤：
34.(1)取卡波姆4份、纯化水15份，加入水相反应釜中，溶胀，搅拌至无颗粒状，再加入三乙醇胺调节ph至6.0-8.0，备用；
35.(2)取二甲基硅油20份、聚山梨酸酯-803份、羟苯乙酯0.3份、甘油3份，加入到油相反应釜，搅拌后，混合所述的水相和油相，制得预凝胶体系；
36.(3)取丹参、姜黄、积雪草、大黄、芦荟中的一种或多种，粉碎，在5℃、4000g进行差速离心，离心50分钟，取得上清液。将上清液在5℃、13000g下，离心60分钟后，取得上清液。将上清液在6℃、14000g下，离心60分钟后，取得沉淀。将沉淀用纯化水重悬后取下层，即得中药外泌体。取7份中药外泌体，再将苦参碱4份、姜黄素6份、丹参酮iia9份通过电穿孔方式装载入外泌体，即得负载苦参碱、姜黄素、丹参酮iia的外泌体；
37.(4)将上述负载苦参碱、姜黄素、丹参酮iia的中药外泌体加入预凝胶体系中，混合均匀，即得一种含中药外泌体的疤痕敷料。
38.实施例4
39.一种含中药外泌体的疤痕敷料的制备方法，包括如下步骤：
40.(1)取卡波姆5份、纯化水20份，加入水相反应釜中，溶胀，搅拌至无颗粒状，再加入三乙醇胺调节ph至6.0-8.0，备用；
41.(2)取二甲基硅油25份、聚山梨酸酯-804份、羟苯乙酯0.4份、甘油4份，加入到油相反应釜，搅拌后，混合所述的水相和油相，制得预凝胶体系；
42.(3)取丹参、姜黄、积雪草、大黄、芦荟中的一种或多种，粉碎，在7℃、5000g进行差速离心，离心60分钟，取得上清液。将上清液在7℃、15000下，离心70分钟后，取得上清液。将上清液在6℃、16000g下，离心70分钟后，取得沉淀。将沉淀用纯化水重悬后取下层，即得中药外泌体。取8份中药外泌体，再将苦参碱5份、姜黄素7份、丹参酮iia 11份通过电穿孔方式装载入外泌体，即得负载苦参碱、姜黄素、丹参酮iia的外泌体；
43.(4)将上述负载苦参碱、姜黄素、丹参酮iia的中药外泌体加入预凝胶体系中，混合均匀，即得一种含中药外泌体的疤痕敷料。
44.实施例5
45.一种含中药外泌体的疤痕敷料的制备方法，包括如下步骤：
46.(1)取卡波姆6份、纯化水25份，加入水相反应釜中，溶胀，搅拌至无颗粒状，再加入三乙醇胺调节ph至6.0-8.0，备用；
47.(2)取二甲基硅油30份、聚山梨酸酯-805份、羟苯乙酯0.5份、甘油5份，加入到油相反应釜，搅拌后，混合所述的水相和油相，制得预凝胶体系；
48.(3)取丹参、姜黄、积雪草、大黄、芦荟中的一种或多种，粉碎，在8℃、6000g进行差速离心，离心70分钟，取得上清液。将上清液在9℃、14000g下，离心80分钟后，取得上清液。将上清液在8℃、18000g下，离心80分钟后，取得沉淀。将沉淀用纯化水重悬后取下层，即得中药外泌体。取10份中药外泌体，再将苦参碱6份、姜黄素6份、丹参酮iia 12份通过电穿孔方式装载入外泌体，即得负载苦参碱、姜黄素、丹参酮iia的外泌体；
49.(4)将上述负载苦参碱、姜黄素、丹参酮iia的中药外泌体加入预凝胶体系中，混合均匀，即得一种含中药外泌体的疤痕敷料。
50.实施例6
51.一种含中药外泌体的疤痕敷料的制备方法，包括如下步骤：
52.(1)取卡波姆6份、纯化水33份，加入水相反应釜中，溶胀，搅拌至无颗粒状，再加入三乙醇胺调节ph至6.0-8.0，备用；
53.(2)取二甲基硅油30份、聚山梨酸酯-804份、羟苯乙酯0.3份、甘油4份，加入到油相反应釜，搅拌后，混合所述的水相和油相，制得预凝胶体系；
54.(3)取丹参、姜黄、积雪草、大黄、芦荟中的一种或多种，粉碎，在9℃、3000g进行差速离心，离心70分钟，取得上清液。将上清液在4℃、13000g下，离心90分钟后，取得上清液。将上清液在9℃、20000g下，离心90分钟后，取得沉淀。将沉淀用纯化水重悬后取下层，即得中药外泌体。取12份中药外泌体，再将苦参碱6份、姜黄素7份、丹参酮iia 12份通过电穿孔方式装载入外泌体，即得负载苦参碱、姜黄素、丹参酮iia的外泌体；
55.(4)将上述负载苦参碱、姜黄素、丹参酮iia的中药外泌体加入预凝胶体系中，混合均匀，即得一种含中药外泌体的疤痕敷料。
56.实施例7
57.一种含中药外泌体的疤痕敷料的制备方法，包括如下步骤：
58.(1)取卡波姆4份、纯化水25份，加入水相反应釜中，溶胀，搅拌至无颗粒状，再加入三乙醇胺调节ph至6.0-8.0，备用；
59.(2)取二甲基硅油20份、聚山梨酸酯-803份、羟苯乙酯0.4份、甘油4份，加入到油相反应釜，搅拌后，混合所述的水相和油相，制得预凝胶体系；
60.(3)取丹参、姜黄、积雪草、大黄、芦荟中的一种或多种，粉碎，在5℃、4000g进行差速离心，离心60分钟，取得上清液。将上清液在4℃、13000g下，离心70分钟后，取得上清液。将上清液在7℃、18000g下，离心60分钟后，取得沉淀。将沉淀用纯化水重悬后取下层，即得中药外泌体。取10份中药外泌体，再将苦参碱4份、姜黄素5份、丹参酮iia 10份通过电穿孔方式装载入外泌体，即得负载苦参碱、姜黄素、丹参酮iia的外泌体；
61.(4)将上述负载苦参碱、姜黄素、丹参酮iia的中药外泌体加入预凝胶体系中，混合均匀，即得一种含中药外泌体的疤痕敷料。
62.实施例8
63.一种含中药外泌体的疤痕敷料的制备方法，包括如下步骤：
64.(1)取卡波姆2份、纯化水15份，加入水相反应釜中，溶胀，搅拌至无颗粒状，再加入三乙醇胺调节ph至6.0-8.0，备用；
65.(2)取二甲基硅油10份、聚山梨酸酯-802份、羟苯乙酯0.1份、甘油5份，加入到油相反应釜，搅拌后，混合所述的水相和油相，制得预凝胶体系；
66.(3)取丹参、姜黄、积雪草、大黄、芦荟中的一种或多种，粉碎，在7℃、5000g进行差速离心，离心50分钟，取得上清液。将上清液在4℃、13000g下，离心60分钟后，取得上清液。将上清液在4℃、16000g下，离心50分钟后，取得沉淀。将沉淀用纯化水重悬后取下层，即得中药外泌体。取8份中药外泌体，再将苦参碱2份、姜黄素4份、丹参酮iia 8份通过电穿孔方式装载入外泌体，即得负载苦参碱、姜黄素、丹参酮iia的外泌体；
67.(4)将上述负载苦参碱、姜黄素、丹参酮iia的中药外泌体加入预凝胶体系中，混合均匀，即得一种含中药外泌体的疤痕敷料。
68.为研究实施例3所制成的一种含中药外泌体的疤痕敷料的性能和功效，进行如下实验：
69.一、外泌体的生物学特征鉴定实验
70.采用差速离心法从丹参、姜黄、积雪草、大黄、芦荟中的一种或多种鲜药材中分离得到一定形态的囊泡颗粒，为了鉴别其是否为所需的外泌体，根据细胞外囊泡实验要求：(1)使用电子显微镜等对样本进行成像分析，证实膜泡结构；(2)通过纳米级别的分析技术测定膜泡的粒径情况；(3)使用免疫印迹法或流式等技术检测囊泡的蛋白质标志物，进行如下实验。
71.1.外泌体的形态及粒径
72.取10ul外泌体重悬液滴于电镜专用铜网上，静置3分钟后用10ul 2％磷钨酸溶液复染，静置5分钟后用吸水滤纸吸干残留的多余浮液。常温静置干燥约10分钟后置于透射电镜下，使用80-120kv成像，观察。在电镜视野下可以观察到，本发明所提的外泌体分散度较好，具有立体双膜结构，形态完整，大小不一，呈现典型的圆球形或椭圆形杯状结构，直径为30-150nm之间，符合现有文献中提到的外泌体结构，结果如图1所示。
73.2.westernblotting测定外泌体标志蛋白cd9
74.外泌体蛋白悬液采用二喹啉甲酸(bca)法进行定量检测，100℃水浴10分钟，配胶，上样。随后进行十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳(sds-page)，切胶，转移到pvdf膜上，封闭2小时。4℃下孵育一抗，过夜，然后用三羟甲基氨基甲烷-吐温(tbst)缓冲液洗涤，后加入二抗，室温孵育2小时，用tbst缓冲液洗涤，随后采用电化学发光法进行显影。结果表明，本
发明所提取的外泌体的特异性标志蛋白cd9呈现阳性表达，说明本发明所提取的外泌体符合文献中的要求。
75.二、皮肤刺激性实验
76.取4只健康成年新西兰家兔(2.5-3.0kg)做皮肤刺激实验，随机平分为实验组和对照组。每只家兔选取3个实验部位，每个部位约3
×
3cm2，选区脱毛。实验组涂抹一种含中药外泌体的疤痕敷料，对照组给予生理盐水。涂药后1、24和48h观察家兔皮肤情况，按皮肤不良反应分级标准表(表1)评分。结果显示，实验组、对照组皮肤不良反应均不出现红斑、水肿现象，评分均为0分，表明本发明对皮肤不造成刺激反应。
77.表1皮肤不良反应分级
[0078][0079]
三、家兔皮肤疤痕治疗效果实验
[0080]
取清洁级疤痕模型新西兰家兔18只，雌雄各半，体重2.5-3.0kg。随机分为3组，疤痕模型组不作特殊处理，实验组给予含中药外泌体的疤痕敷料，阳性药物对照组给予硅酮凝胶敷料。每日2次，每次用量0.2g，连续用药30天。另取2只清洁级正常皮肤的新西兰家兔作为空白对照组。实验结束后将家兔处死，进行组织学观察。
[0081]
30天后，组织学观察，空白对照组(正常皮肤组织)中成纤维细胞数目少，胶原纤维排列整齐；疤痕模型组中真皮层增厚，成纤维细胞数目多，胶原纤维大量堆积且排列紊乱，并伴有炎细胞浸润；实验组(一种含中药外泌体的疤痕敷料)成纤维细胞明显减少，胶原纤维排列规则，治疗效果优于阳性药物对照组(硅酮凝胶敷料)。结果见图2。
[0082]
四、防治病理性疤痕的临床实验
[0083]
1.临床资料
[0084]
选取90例疤痕患者进行临床试验，纳入标准：(1)符合病理性疤痕临床诊断标准；(2)知情本实验并签署知情同意书。排除标准：(1)孕妇患者；(2)疤痕体质；(3)疤痕增生既往病史等。采用随机法将患者随机分为对照组(n＝45)和实验组(n＝45)，两组患者临床资料无显著性差异(p》0.05)。
[0085]
2.实验方法
[0086]
实验组患者给予一种含中药外泌体的疤痕敷料；对照组患者给予硅酮凝胶敷料。两组患者均采用外敷方式，将药物外敷于无溃疡、无破损的患处，每日两次，疗程均为3个月。
[0087]
3.两组患者疤痕评估量评分
[0088]
参照国际温哥华疤痕评估量(vss)评分，观察并记录两组患者治疗前、治疗3个月后的vss评分，vss评分包括疤痕色泽、血管分布、厚度、柔软度四个方面，按严重程度分为0-5分，vss分值越高表明患者病理性疤痕越严重，总分为15分。
[0089]
两组患者经过3个月治疗后，实验组vss评分(4.1
±
1.8)明显低于治疗前vss评分。实验组与对照组相比存在非常显著差异(p《0.01)，实验结果显示实验组对病理性疤痕的治疗效果优于对照组。
[0090]
表2两组患者vss评分
[0091][0092]
**表示p《0.01。
[0093]
综上所述表明，一种含中药外泌体的疤痕敷料能够有效抑制成纤维细胞及炎细胞的形成，对预防和治疗皮肤病理性疤痕具有显著供效，且优于硅酮凝胶敷料的治疗作用，具备临床应用价值。
[0094]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润色，均应视为本发明的保护范围。