组合物在制备药物中的用途的制作方法

1.本发明涉及医药领域。具体地，本发明涉及组合物在制备抗病毒药物中的用途。


背景技术：

2.冠状病毒是一类主要引起呼吸道、肠道疾病的病原体，这类单股正链rna病毒颗粒的表面有许多规则排列的突起，整个病毒颗粒就像一顶帝王的皇冠，因此得名“冠状病毒”，是一个大型病毒家族，在自然界广泛存在。目前已知感染人的冠状病毒有7种，其中四种在人群中较为常见(hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1)，另外三种是中东呼吸综合症相关冠状病毒(mersr-cov)和严重急性呼吸综合症相关冠状病毒(sarsr-cov)以及2019新型冠状病毒(2019-ncov)。冠状病毒感染后症状因不同种类而异，常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合症、肾衰竭，甚至死亡。
3.人类冠状病毒(hcov-229e)是引起人类上呼吸道感染的病原，是冠状病毒的主要流行株之一，其临床表现为发热、流涕、咽喉肿痛等症状，临床上除引起呼吸道感染外，还能引起低年龄组特别是小儿的急性肠胃炎。
4.目前针对冠状病毒的药物治疗主要为：抗病毒药物治疗、抗菌药物治疗以及中医中药治疗。冠状病毒感染的肺炎属于中医疫病范畴，基本病机特点为“湿、热、毒、瘀”，目前中药用于防治与治疗冠状病毒肺炎的效果已经被临床所证实。
5.然而，目前的抗病毒的药物仍有待研究。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了组合物在制备药物中的用途，该药物具有较好的抗冠状病毒作用，为冠状病毒感染疾病的研究和治疗奠定了基础，应用前景广阔。
7.本发明提出了组合物在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于抗冠状病毒，所述组合物包括：金银花、连翘、玄参、板蓝根、赤芍、黄芩、桑叶、菊花、前胡、苦杏仁、牛蒡子、泽泻、胖大海、僵蚕、蝉蜕和木蝴蝶。发明人发现，上述组合物具有较好的抗冠状病毒作用，由此，为冠状病毒感染疾病的研究和治疗奠定了基础，应用前景广阔。
8.根据本发明的实施例，上述组合物在制备药物中的用途还可以具有下列附加技术特征：
9.根据本发明的实施例，所述冠状病毒选自hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、mersr-cov、sarsr-cov或2019-ncov。
10.根据本发明的实施例，感染冠状病毒使肺指数增加，所述药物用于降低肺指数。发明人发现，上述组合物可以有效地降低肺指数，从而治疗因感染病毒所造成的肺损伤。
11.根据本发明的实施例，感染冠状病毒使肺组织中的il-1β、il-6的表达升高，所述药物用于降低肺组织中的il-1β、il-6的表达。发明人发现，上述组合物可以有效地抑制上
述肺组织炎性细胞因子，从而起到抗病毒作用。
12.根据本发明的实施例，感染冠状病毒使外周血中cd4

t细胞、b细胞和cd8

t细胞含量升高，所述药物用于提高外周血中cd4

t细胞、b细胞和cd8

t细胞含量。发明人发现，上述组合物可以有效地提高外周血中免疫细胞含量，从而起到抗病毒作用。
13.根据本发明的实施例，所述药物用于因感染冠状病毒所引发的治疗呼吸道疾病。
14.根据本发明的实施例，所述药物为单剂型，含有1g/60kg/d～5g/60kg/d的所述组合物。上述为人的给药剂量，采用具有上述组合物含量的药物每天给药一次，可以起到较好的治疗目的。对应地，小鼠采用具有0.2g/kg/d～0.9g/kg/d上述组合物含量的药物每天给药一次，可以起到较好的治疗目的。
15.根据本发明的实施例，所述药物的剂型为丸剂、片剂、胶囊或颗粒剂。
16.根据本发明的实施例，所述组合物选自：金银花115～135份；连翘115～135份；玄参115～135份；板蓝根115～135份；赤芍40～60份；黄芩65～85份；桑叶40～60份；菊花40～60份；前胡40～60份；苦杏仁40～60份；牛蒡子40～60份；泽泻40～60份；胖大海40～60份；僵蚕40～60份；蝉蜕40～60份和木蝴蝶40～60份。由此，采用上述组合物具有较好的抗冠状病毒作用。
17.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
18.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
19.实施例1
20.在该实施例中，按照下列方法制备抗冠状病毒药(丸剂)：
21.1、原料药配方为：
[0022][0023]
2、生产丸剂的工艺制备方法如下步骤：
[0024]
(1)、将僵蚕麸炒，苦杏仁去皮后，备用。
[0025]
(2)、将十六味中药，全部粉碎成细粉，过100-120目筛，混合均匀后，备用。
[0026]
(3)、将100份细粉末与炼蜜35-50份和适量的纯化水拌匀，混合均匀炼药、出条、搓丸、干燥、选丸等工序过程制成每10粒重1克的丸粒。
[0027]
实施例2
[0028]
在该实施例中，按照下列方法制备抗冠状病毒药(片剂)：
[0029]
1、原料药配方为：
[0030][0031]
2、生产片剂的工艺制备方法如下步骤：
[0032]
(1)、将僵蚕麸炒，苦杏仁去皮后，备用。
[0033]
(2)、将板蓝根、僵蚕粉碎成细粉，过100-120目筛，混合均匀后，备用。
[0034]
(3)、将金银花、连翘、赤芍、苦杏仁粉碎成60粗粉，以80％乙醇加热回流提取二次，每次2小时，合并提取液，滤过，将滤液收集。
[0035]
(4)、将步骤(3)中的药渣与其余十味玄参、黄芩等中药，加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至在温度为25℃时、相对密度为1.28-1.30的清膏，加乙醇使含醇量达70％，搅拌均匀，静置，滤过，滤液与上述步骤(3)中的醇提取液合并，回收乙醇并浓缩至在温度为60℃时、相对密度为1.38-1.40的清膏，再加入步骤(2)制备的细粉及辅料制粒，辅料可采用糊精、淀粉、饴糖、硬脂酸镁等，再用常温烘箱70-80℃干燥，压制成片，包薄膜衣，即得。
[0036]
实施例3
[0037]
在该实施例中，按照下列方法制备抗冠状病毒药(胶囊剂)：
[0038]
1、原料药配方为：
[0039][0040]
2、生产胶囊剂的工艺制备方法如下步骤：
[0041]
(1)、将僵蚕麸炒，苦杏仁去皮后，备用。
[0042]
(2)、将板蓝根、僵蚕粉碎成细粉，过100-120目筛，混合均匀后，备用。
[0043]
(3)、将金银花、连翘、赤芍、苦杏仁粉碎成60粗粉，以80％乙醇加热回流提取二次，每次2小时，合并提取液，滤过，将滤液收集。
[0044]
(4)、将步骤(3)中的药渣与其余十味玄参、黄芩等中药，加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至在温度为25℃时、相对密度为1.28-1.30的清膏，加乙醇使含醇量达70％，搅拌均匀，静置，滤过，滤液与上述步骤(3)中的醇提取液合并，回收乙醇并浓缩至在温度为60℃时、相对密度为1.38-1.40的清膏，再加入步骤(2)制备的细粉，搅匀，常温烘箱70-80℃干燥，制粒，装入胶囊1000粒，即得。
[0045]
实施例4
[0046]
在该实施例中，按照下列方法制备抗冠状病毒药(颗粒剂)：
[0047]
1、原料药配方为：
[0048][0049]
2、生产颗粒剂的工艺制备方法如下步骤：
[0050]
(1)、将僵蚕麸炒，苦杏仁去皮后，备用。
[0051]
(2)、将板蓝根、僵蚕粉碎成细粉，过100-120目筛，混合均匀后、备用。
[0052]
(3)、将金银花、连翘、赤芍、苦杏仁粉碎成40-60粗粉，以80％乙醇加热回流提取二次，每次2小时，合并提取液，滤过，将滤液收集。
[0053]
(4)、将步骤(3)中的药渣与其余十味玄参、黄芩等中药，加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至在温度为50℃时、相对密度为1.18-1.20的清膏，加乙醇使含醇量达70％，搅拌均匀，静置，滤过，滤液与上述步骤(3)中的醇提取液合并，回收乙醇并浓缩至在温度为60℃时、相对密度1.38-1.40的清膏，再加入步骤(2)制备的细粉。
[0054]
(5)、然后再加入400g蔗糖、200g淀粉，制粒，即得。
[0055]
实施例5
[0056]
在该实施例中，按照下列方法制备抗冠状病毒药(软胶囊剂)：
[0057]
1、原料药配方为：
[0058][0059]
2、生产软胶囊剂的工艺制备方法如下步骤：
[0060]
(1)、将僵蚕麸炒，苦杏仁去皮后，备用。
[0061]
(2)、将板蓝根、僵蚕粉碎成细粉，过100-120目筛，混合均匀后、备用。
[0062]
(3)、将金银花、连翘、赤芍、苦杏仁粉碎成40-60粗粉，以80％乙醇加热回流提取二次，每次2小时，合并提取液，滤过，将滤液收集。
[0063]
(4)、将步骤(3)中的药渣与其余十味玄参、黄芩等中药，加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至在温度为50℃时、相对密度为1.18-1.20的清膏，加乙醇使含醇量达85％，搅拌均匀，静置，滤过，滤液与上述步骤(3)中的醇提取液合并，回收乙醇并浓缩至在温度为60℃时、相对密度1.38-1.40的清膏。
[0064]
(5)、加入步骤(2)制备的细粉、干燥、粉碎、再加入色拉油混匀成45-50％的混悬液、制成软胶囊，即得。
[0065]
对比例1
[0066]
在该实施例中，按照下列方法制备抗冠状病毒药(胶囊剂)：
[0067]
1、原料药配方为：
[0068]
连翘：255g、金银花255g、炙麻黄85g、炒苦杏仁85g、石膏255g、板蓝根255g、绵马贯众255g、鱼腥草255g、广藿香85g、大黄51g、红景天85g、薄荷脑7.5g、甘草85g。
[0069]
2、制备方法
[0070]
同实施例3。
[0071]
实施例6
[0072]
对实施例1～5所得抗冠状病毒药进行药性测试，发现其均有较好的抗病毒作用。下面以实施例3所得抗病毒药为例，进行详细描述。
[0073]
1试验材料
[0074]
1.1实验动物
[0075]
种类级别体重性别icr小鼠spf级14
±
1g雌icr小鼠spf级14
±
1g雄
[0076]
1.2毒株及细胞
[0077]
1.2.1病毒毒株：人冠状病毒229e(hcov-229e)，由中国医学科学院医药生物技术研究所提供，本实验室传代，-80℃冰箱保存备用。
[0078]
1.2.2细胞株：小鼠单核巨噬细胞raw264.7，购自北京北纳创联生物技术研究院，本实验室传代，液氮保存备用。
[0079]
1.3试验试剂
[0080][0081]
[0082]
2试验方法
[0083]
2.1药物剂量设计及配制
[0084]
(1)本发明药物
[0085][0086]
2.2病毒传代
[0087]
取已长成单层的raw264.7细胞的25cm2培养瓶，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，加入hcov-229e的病毒液200μl，置37℃5％co2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，48～72h，直至80％细胞出现明显病变(cpe)后，将细胞培养瓶置于-80℃低温冰箱冻存，病毒液反复冻融3次后，用于检测病毒毒力。
[0088]
2.3病毒滴度测定
[0089]
取已长成单层raw264.7细胞的培养板，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，按10倍稀释接种不同滴度的hcov-229e病毒液，10-1
～10-8
共8个稀释度，100μl/孔，每个浓度4个复孔，同时设正常细胞对照。置37℃、5％co2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，48～72h记录各孔的细胞病变情况。按reed-muench计算50％细胞病变浓度(tcid
50
)。
[0090]
2.4 hcov-229e感染小鼠肺炎模型造模及给药
[0091]
icr小鼠70只，按体重随机分为正常对照组、模型对照组、对比例1组、本发明药物组，每组10只，雌雄各半。除正常对照组外，其余各组小鼠用乙醚轻度麻醉，100tcid
50
hcov-229e滴鼻感染。感染当天开始给药，各给药组按20ml/kg/d灌胃，每天1次，连续4天。正常对照组在同等条件下给予20ml/kg/d蒸馏水灌胃。感染第5天称重后解剖进行检测。
[0092]
2.5计算肺指数及抑制率
[0093]
末次给药后一天称量小鼠体重，解剖取肺并称量肺重，计算肺指数及肺指数抑制率。
[0094][0095][0096]
2.6肺组织中病毒载量检测(real-time rt-pcr法)
[0097]
核酸裂解处理：
[0098]
小鼠解剖后将肺组织分装置于-80℃低温冰箱中保存；将小鼠肺组织从-80℃低温冰箱中取出，置于洁净的研钵中，倒入少量液氮并使用研杵将其研磨成粉末，收集粉末于
1.5ml离心管中并立即加入1ml trizol reagent，轻弹管底，尽快混合样品至重悬；室温水平放置离心管，孵育20min；4℃，12000rpm，离心10min；将澄清上清液移入新的1.5ml离心管中；加入0.2ml氯仿，盖紧管盖，用力摇动离心管15s，室温孵育2-3min至液体分层；4℃，12000rpm，离心15min；将透明上清液小心移入新的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温孵育30min；4℃，12000rpm，离心10min；弃去上清，用1ml75％乙醇轻洗沉淀(使白色沉淀轻轻飘起)；4℃，7500rpm，离心5min；吸尽上清液，短暂干燥rna沉淀5-10min；m)用20μl depc水溶解沉淀，﹣80℃低温冰箱保存。
[0099]
核酸测定：
[0100]
对照品核酸处理：depc-h2o作为阴性对照。阳性对照品进行10、100、1000倍梯度稀释。
[0101]
试剂配制：取n
×
18μl hcov-229e核酸荧光pcr检测混合液，n
×
1μl内部对照品，与n
×
1μl rt-pcr酶(n为反应管数)，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。
[0102]
pcr扩增：采用中国上海之江生物技术有限公司的人冠状病毒实时rt-pcr试剂盒进行。具体地，取上述混合液20μl置于pcr管中，然后将样品核酸提取液、depc-h2o、阳性对照品各5μl、分别加入pcr管中，盖紧管盖，离心数秒使所有液体置于底部，立即进行pcr扩增反应。循环参数设置为：45℃
×
10min；95℃
×
15min；再按95℃
×
15sec
→
60℃
×
60sec，循环40次；单点荧光检测在60℃，反应体系为25μl。
[0103]
荧光通道检测选择：选用fam和hex/vic/joe通道。
[0104]
2.7小鼠肺组织中il-1β、il-6检测(elisa法)
[0105]
肺组织匀浆液样本：小鼠取肺组织称重后，收集小鼠肺组织，-4℃保存。称量50mg肺组织加入500μl生理盐水后，使用超声细胞破碎仪匀浆组织，使用低温高速离心机-4℃1000rpm离心10分钟。吸取上清液之后分装，保存于-80℃冰箱贮存备用。避免反复冻融。待测il-1β、il-6。
[0106]
检测时按照试剂盒说明书检测，用酶标仪检测450nm的吸光度。
[0107]
2.8小鼠外周血t淋巴细胞亚群及b淋巴细胞比例流式检测
[0108]
离心机4℃预冷。小鼠摘眼球取血，向装有10ml 1
×
pbs的15ml离心管中加入3滴血(约150μl)，1600rpm，15min，室温离心；用移液管小心弃去上清，每管加入1ml红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温裂解约5-10min至液体从浑浊变澄清，加入10ml pbs终止裂解，2000rpm，5min，4℃离心，弃上清。细胞沉淀用10ml pbs重悬，2000rpm，5min，4℃离心，弃上清，用1ml封闭液(含5％fbs的pbs)重悬，2000rpm，5min，4℃离心，弃上清。避光于封闭液中配制流式抗体如下：pe标记抗小鼠b220，percp-cy5.5标记抗小鼠cd4、apc标记抗小鼠cd8a，配制体积为：抗体各0.8μl/样品，封闭液50μl/样品。加入流式抗体，每管50μl，4℃避光染色30min，加入1ml pbs，2000rpm，5min，4℃离心，弃上清。加入100μl含2％fbs的pbs以及100μl 4％多聚甲醛重悬细胞，4℃保存，尽快上机检测。
[0109]
2.9统计分析
[0110]
采用spss17.0软件进行统计学分析，组间差异采用单因素方差分析，p《0.05为差异具有统计学意义。
[0111]
3实验结果
[0112]
3.1本发明药物对hcov-229e感染小鼠肺炎模型肺指数及抑制率的影响
[0113]
表1本发明药物对hcov-229e感染小鼠肺炎模型的治疗作用
[0114][0115]
注：与正常对照组比较
##
p《0.01，与模型对照组比较
**
p《0.01；与对比例1组比较，
☆
p《0.05。
[0116]
表1结果显示：与正常对照组比较，模型对照组小鼠肺指数显著增加(p《0.01)；本发明药物小鼠肺指数显著降低，与模型对照组比较均有显著性差异(p《0.01)；与对比例1组比较，本发明药物组肺指数低于对比例1组(p《0.05)；肺指数抑制率达到141.95％。
[0117]
3.2本发明药物对hcov-229e感染小鼠肺炎模型肺组织病毒载量的影响
[0118]
表2本发明药物对hcov-229e感染小鼠肺炎模型的治疗作用
[0119][0120]
注：与正常组比较，
##
p《0.01；与模型组比较，
**
p《0.01；
[0121]
表2结果显示：正常对照组小鼠肺组织中无hcov-229e核酸表达；采用hcov-229e感染小鼠后，小鼠肺组织中有明显核酸表达，模型对照组小鼠肺组织病毒载量显著增高，与正常对照组比较有显著性差异(p《0.01)；本发明药物组均可明显降低肺组织中病毒核酸表达量，与模型组比较均有显著性差异(p《0.01)。
[0122]
3.3本发明药物对hcov-229e感染小鼠肺炎模型肺组织炎性细胞因子的影响
[0123]
表3本发明药物对hcov-229e感染小鼠肺炎模型的治疗作用
[0124][0125]
注：与正常对照组比较
##
p《0.01，与模型对照组比较
**
p《0.01。
[0126]
表3结果显示：hcov-229e感染后，模型对照组小鼠肺组织中il-1β、il-6表达均显著升高，与正常对照组比较均有显著性差异(p《0.01)；本发明药物组均可显著降低肺组织中il-1β、il-6的表达，与模型对照组比较均有显著性差异(p《0.01)。
[0127]
3.4本发明药物对hcov-229e感染小鼠外周血中淋巴细胞比例的影响
[0128]
表4本发明药物对hcov-229e感染小鼠肺炎模型的治疗作用
[0129][0130][0131]
注：与正常对照组比较
##
p《0.01，与模型对照组比较
**
p《0.01。与对比例1组比较，
☆
p《0.05，
☆☆
p《0.01。
[0132]
表4结果显示：hcov-229e感染后，模型对照组小鼠外周血中免疫细胞cd4

t细胞百分比、cd8

t细胞百分比、b细胞百分比均明显降低，与正常组比较有显著性差异(p《0.01，p《0.05)；本发明药物可明显升高cd4

t细胞、cd8

t细胞及b细胞百分比，与模型对照组比较均有显著性差异(p《0.05，p《0.01)，与对比例1组比较，本发明药物组cd4 t细胞、b细胞百分比显著高于对比例1组(p《0.05，p《0.01)。
[0133]
4小结
[0134]
本实验采用人类冠状病毒229e(hcov-229e)滴鼻感染制备冠状病毒肺炎小鼠模型，评价本发明药物对hcov-229e感染小鼠肺炎模型的治疗作用，结果显示：本发明药物受试剂量显著降低hcov-229e感染后的肺指数、显著降低肺组织病毒载量、显著降低肺组织炎性细胞因子il-1β、il-6表达、显著升高外周血中免疫细胞cd4

t细胞百分比、cd8

t细胞百分比、b细胞百分比。综上所述，本发明药物对人类冠状病毒hcov-229e感染性肺炎有治疗作用。
[0135]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0136]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。