一种基于衍生化技术同时检测替格瑞洛合成中间体TKG中三种不同异构体的方法与流程

一种基于衍生化技术同时检测替格瑞洛合成中间体tkg中三种不同异构体的方法
技术领域
1.本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种同时检测替格瑞洛合成中间体tkg中 三种不同异构体的高效液相色谱方法。


背景技术：

2.替格瑞洛是一种血小板聚集抑制剂，化学名称为(1s,2s,3r,5s)-3-[7-[[(1r,2s)-2-(3,4
‑ꢀ
二氟苯基)环丙基]氨基]-5-丙硫基三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟乙氧基)-1,2-环戊二醇， 分子式为c
23h28
f2n6o4s，结构式如下：
[0003][0004]
tkg中有三种异构体杂质结构式如下：
[0005]
对映异构体
[0006]
非对映异构体-1
[0007]
非对映异构体-2
[0008]
tkg是替格瑞洛的重要中间体，也是其手性来源之一，因此需要准确可靠的检测手 段保证tkg的手性纯度，以确保下游产品替格瑞洛的手性纯度。tkg中有三种异构体 杂质，而tkg及其异构体均无生色团，有必要开发一种准确有效测定tkg异构体的分 析测定方法，对替格瑞洛产品的质量控制具有重要意义。


技术实现要素：

[0009]
本发明的目的在于提供一种基于衍生化技术同时采用反相高效液相色谱检测替格瑞 洛合成中间体tkg中三种不同异构体的分析方法。使用该检测方法，各异构体杂质峰之 间以及杂质峰和主峰间分离度均较高，各峰互相之间无干扰，灵敏度好，可以实现对待 测物tkg中不同异构体的准确检测。
[0010]
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0011]
本发明涉及一种基于衍生化技术同时检测tkg中三种不同异构体的高效液相色谱法 方法，所述的tkg异构体同时包括tkg对映异构体、tkg非对映异构体-1、tkg非对 映异构体-2；所述方法包括如下步骤：
[0012]
(1)以tkg及其三种异构体对照品制备系统适用性溶液；以待检测样品tkg制备 供试品溶液及其对照溶液；
[0013]
(2)进样前样品衍生化；
[0014]
(3)使用以十八烷基键合硅胶为固定相的色谱柱和以硅胶表面敷有纤维素-三(3,5
‑ꢀ
二甲基苯基氨基甲酸酯)为固定相色谱柱串联的方式，梯度洗脱检测样品；
[0015]
(4)自身对照法以峰面积计算，得到待检测样品中tkg对映异构体、tkg非对映 异构体-1、tkg非对映异构体-2的准确含量。
[0016]
进一步，步骤(1)中，系统适用性溶液tkg浓度为2～10mg/ml，tkg三种异构体 浓度均为2～10μg/ml，优选为tkg浓度为5mg/ml，tkg三种异构体浓度均为5μg/ml；。
[0017]
进一步，步骤(1)中，供试品溶液浓度为2～10mg/ml，优选为5mg/ml。
[0018]
进一步，步骤(2)中，衍生化试剂配制方法：精密称定邻苯二甲醛360～440mg， 100ml量瓶中加适量甲醇溶解，加入0.9～1.1ml三乙胺和0.36～0.44ml巯基乙醇，用甲醇 稀释到刻度，摇匀，即得。优选为：邻苯二甲醛400mg、三乙胺1ml、巯基乙醇0.4ml。
[0019]
进一步，步骤(2)中，衍生化方法：1～2ml样品溶液置5ml量瓶中，加入1～2ml衍 生化试剂，用水稀释至刻度，摇匀。优选为：样品溶液2ml，衍生化试剂2ml。
[0020]
进一步，步骤(3)中，所述流动相的流速为0.8～1.2ml/min，优选为1ml/min。
[0021]
进一步，步骤(3)中，进样体积为5～50μl，优选为10μl。
[0022]
进一步，步骤(3)中，柱温为20～40℃，优选为30℃。
[0023]
进一步，步骤(3)中，波长为335nm～345m，优选为340nm。
[0024]
优选的，步骤(3)中，流动相ph值为6～7，进一步优选为6.8，以磷酸进行调节。
[0025]
优选的，步骤(3)中，三乙胺溶液浓度为0.2～0.3％(v/v)，进一步优选为0.3％ (v/v)。
[0026]
优选的，步骤(3)中，a相三乙胺溶液-乙腈比例为60:40～70:30(v/v)，b相三乙 胺溶液-乙腈比例为10:90～30:70(v/v)，最优选为：a相三乙胺溶液-乙腈比例为65:35 (v/v)，b相三乙胺溶液-乙腈比例为20:80(v/v)。
[0027]
本发明具有如下有益效果：
[0028]
(1)tkg本无生色团，在紫外下无吸收，本发明将tkg进行柱前衍生化以增加紫 外响应；
[0029]
(2)创造性的采用c18色谱柱和手性色谱柱串联的方式，增加异构体保留并实现色 谱峰之间高效分离，各异构体杂质峰之间以及杂质峰和主峰间分离度均较高，各峰互相 之间无干扰，灵敏度好；
[0030]
(3)本发明的检测方法操作简便，降低药物检测难度，降低检测成本低，经方法验 证，确认具有良好的线性、专属性、精密度、稳定性、灵敏度和重复性，加样回收率 高，检测结果准确可靠，为同时检测tkg中三种不同异构体的含量提供一种准确、有 效、可重复的检测方法，为替格瑞洛原料及制剂的异构体质量研究提供一种新的检测思 路。
附图说明
[0031]
图1：实施例1中空白溶液的hplc图。
[0032]
图2：实施例1中对照溶液的hplc图。
[0033]
图3：实施例1中供试品溶液的hplc图。
[0034]
图4：实施例1中加标供试品溶液的hplc图。图5：实施例3中tkg非对映异构体-1的线性图。图6：实施例3中tkg非对映异构体-2的线性图。图7：实施例3中tkg对映异构体的线性图。图8：实施例3中tkg的线性图。
具体实施方式
[0035]
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
[0036]
本发明具体实施方式中使用的设备、试剂、耗材等均为市售产品，非须特殊定制或 采购。
[0037]
实施例采用如下条件：
[0038]
色谱柱：agilent sb c18，150
×
4.6mm，5μm或效能相当色谱柱 daicel od-rh， 150
×
4.6mm，5μm或效能相当色谱柱；
[0039]
流动相a：0.3％三乙胺溶液(磷酸调节ph至6.8)-乙腈(65﹕35)；
[0040]
流动相b：0.3％三乙胺溶液(磷酸调节ph至6.8)-乙腈(20﹕80)；
[0041]
检测波长：340nm；
[0042]
柱温：30℃
[0043]
洗脱梯度条件如下：
[0044][0045][0046]
实施例1：专属性试验
[0047]
空白(溶剂)：超纯水。
[0048]
tkg及杂质对照储备液(500μg/ml)：以tkg对映异构体为例，称取tkg对映异构 体对照品约5mg，精密称定，置10ml量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。 同法配制tkg及各杂质对照储备液。
[0049]
杂质混合溶液(50μg/ml)：量取各杂质对照储备液各1ml，置同一10ml量瓶中，用 溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0050]
系统适用性溶液：称取tkg对照品约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入杂质 混
合溶液1ml，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0051]
杂质定位溶液(5μg/ml)：分别量取各杂质对照储备液1ml，置相对应的100ml量瓶 中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0052]
供试品溶液(5mg/ml)：称取tkg样品约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，用溶 剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0053]
衍生化试剂：称取邻苯二甲醛400mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇适量使 溶解，加入1ml三乙胺和0.4ml巯基乙醇，用甲醇稀释到刻度，摇匀，即得。
[0054]
取待空白2ml，置5ml量瓶中，加入2ml衍生化试剂，用溶剂稀释至刻度，摇匀， 取样进液相，记录谱图。系统适用性溶液、供试品溶液同空白溶液衍生化后进液相，记 录谱图。
[0055]
专属性试验结果如下：
[0056]
名称保留时间理论板数分离度tkg非对映异构体-111.27012691-tkg非对映异构体-212.780110503.14tkg对映异构体18.569132609.62tkg20.558103362.70
[0057]
由上表和图1～4可见，tkg非对映异构体-1、tkg非对映异构体-2、tkg对映异构 体测定不受其它峰干扰，方法专属性良好。
[0058]
实施例2：灵敏度试验
[0059]
线性储备溶液(50μg/ml)：分别量取tkg及各杂质对照储备液各2ml，置同一20ml 量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀即得。
[0060]
定量限溶液：量取线性储备溶液(50μg/ml)1ml，置50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻 度，摇匀即得。同法配制6份。
[0061]
检测限溶液：量取定量限溶液3.5ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀即 得。
[0062]
上述样品溶液分别精密量取2ml，置5ml量瓶中，加入2ml衍生化试剂，用溶剂稀 释至刻度，摇匀，得衍生化后样品溶液(衍生化样品需现配现用)。量取衍生化后样品溶 液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如下：
[0063]
定量限试验结果如下：
[0064][0065][0066]
检测限试验结果如下：
[0067][0068]
由上述结果可见本方法tkg及跟异构体检测限均小于供试品浓度的0.05％，检测限 均小于供试品浓度的0.02％，方法灵敏度良好。
[0069]
实施例3：线性
[0070]
线性储备溶液(50μg/ml)：分别量取tkg及各杂质对照储备液各2ml，置同一20ml 量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀即得。
[0071]
分别量取不同体积的线性储备溶液按下表制得50％、80％、100％、150％、200％限 度浓度水平的线性溶液。
[0072]
浓度水平(％)量取线性储备溶液体积(ml)量瓶体积(ml)定量限1505012080225100110150320200210
[0073] 上述样品溶液分别精密量取2ml，置5ml量瓶中，加入2ml衍生化试剂，用溶剂溶 解并稀释至刻度，摇匀，得衍生化后样品溶液。(衍生化样品需现配现用)。量取衍生化 后样品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如下：
[0074]
tkg非对映异构体-1线性试验结果汇总如下：
[0075][0076]
tkg非对映异构体-2线性试验结果汇总如下：
[0077][0078][0079]
tkg对映异构体线性试验结果汇总如下：
[0080][0081][0082]
tkg线性试验结果汇总如下：
[0083][0084]
由上述汇总结果可见，tkg非对映异构体-1、tkg非对映异构体-2、tkg对映异构 体、tkg在限度浓度(5μg/ml)的20％～200％范围内线性关系系数r大于0.990，响应 因子rsd小于10％，y轴截距在100％响应值的25％以内，说明本检测方法线性良好。
[0085]
根据线性结果，回归曲线斜率比值即为响应因子比值，以tkg相对相应因子为1， 计算tkg非对映异构体-1校正因子为1.01、tkg非对映异构体-2校正因子为1.04、 tkg对映异构体校正因子为1.00，故采用不带校正因子的自身对照法计算供试品中tkg 非对映异构体-1、tkg非对映异构体-2、tkg对映异构体杂质含量。
[0086]
实施例4：回收率试验
[0087]
杂质对照品储备溶液a(25μg/ml)：称取各杂质对照品约2.5mg，精密称定，置同一 100ml量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得杂质对照储备溶液a。同法配制杂 质对照储备溶液b、c。
[0088]
供试品溶液：称取tkg样品约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，用溶剂溶解并稀 释至刻度，摇匀，即得。
[0089]
自身对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇 匀，再精密量取此溶液1ml，置50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
[0090]
量取杂质对照储备溶液按下表配制50％、100％和150％浓度水平的回收率溶液(加 标供试品溶液)。
[0091][0092]
上述样品溶液分别精密量取2ml，置5ml量瓶中，加入2ml衍生化试剂，用溶剂溶 解并稀释至刻度，摇匀，得衍生化后样品溶液。(衍生化样品需现配现用)。量取衍生化 后样品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，回收率结果汇总(自身对照法)如 下：
[0093]
[0094][0095]
各浓度水平下杂质的平均回收率均应在90％～110％之间，每个浓度水平回收率的 rsd均不大于10.0％，方法准确度良好。
[0096]
综上所述，本发明提供了一种新的检测替格瑞洛中间体tkg异构体含量的方法，各 异构体杂质峰之间分离度高、灵敏度好、准确度好，能够有效的检测tkg中异构体杂质 的含量。
[0097]
以上所述，仅为本技术的实施例而已，本技术的保护范围并不受这些具体实施例的 限制，而是由本技术的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本技术可以有各 种更改和变化。凡在本技术的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进 等，均应包含在本技术的保护范围之内。