一种注射用重组人尿激酶原制剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种注射用重组人尿激酶原制剂及其制备方法和应用，尤其涉及一种注射用重组人尿激酶原液体制剂及其制备方法、一种注射用重组人尿激酶原冻干制剂及其制备方法和包含有注射用重组人尿激酶原冻干制剂的组合套件。


背景技术：

2.尿激酶原(prourokinase，简称pro-uk)是一类丝氨酸蛋白酶，可以激活体内的纤溶酶原转变成有活性的纤溶酶，从而溶解血栓中的纤维蛋白，因此在溶血栓的治疗方面有着广泛的应用。
3.pro-uk中lys158-ile159间肽键容易被纤溶酶及其他一些酶类水解，生成尿激酶(urokinase,简称uk)。uk由a链和b链两条肽链组成，靠链间二硫键连接。和uk相比，pro-uk和纤维蛋白的亲和力较高，激活纤溶系统的部位常在血栓形成的部位，因而引起全身出血倾向的副作用要比尿激酶小，是一种更优越的纤溶酶原激活剂。pro-uk还具有使用剂量小、使用安全、溶栓效果好、再栓率低、无过敏反应等优点，是一种安全无毒的、理想的生物类溶栓制剂，具有广阔的市场前景。
4.pro-uk制剂不稳定，原因是容易被多种蛋白酶切割为尿激酶，同时，在液体状态下，即使低温保存也会自动分解。另外，为了增加稳定性，通常需要采用干燥方法稳定其活性防止降解。
5.基于上述弊端，现有技术中的pro-uk制剂处方做了一些改进，例如专利cn1730098a公开了一种含活性尿激酶原的组合物、其冻干方法及冻干制剂，由重组人尿激酶原、赋形剂、缓冲溶液和盐类组成，还可包括浓度为1.5
‰‑
7.5
‰
(重量/体积比)的人血白蛋白作为保护剂，赋形剂是糖类和/或多元醇，选自甘露醇、蔗糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、山梨醇、麦芽糖中的一种或几种，缓冲溶液是磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲液；盐类是浓度为0.03-0.20mol/l的氯化钠。然而，该制剂中存在一定量的人血白蛋白作为产品保护剂，原料较为特殊，存在三方面的制约因素，一是其来源于人血，存在病毒安全性风险；二是其原料供给存在较大的问题，市场上经常出现供不应求的局面，带来一定的采购风险；三是蛋白在储存过程中发挥发生蛋白聚集、脱酰胺化、非酶褐变、氧化反应和水解作用，其存在于处方中对成品较低的共晶点存在贡献(低共晶点使得产品冻干后的外观较差)。
6.另外，现有技术中的冻干粉针剂型在使用过程中，要求医护人员使用10ml注射器吸取生理盐水后，将液体注入到含有粉针的西林瓶里，轻轻翻倒1-2次混匀；以上步骤反复抽取4支西林瓶，混匀后吸取，用注射器吸入进行注射(3分钟内静脉推注完毕)之后，另取6支西林瓶，90ml生理盐水溶解，摇震混匀，30min内静脉滴注完毕。上述治疗方式，会极大地占用医护人员的宝贵抢救时间，且工作效率较低。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种注射用重组人尿激酶原制剂及其制备方法和应用，尤其提供一种注射用重组人尿激酶原液体制剂及其制备方法、一种注射用重组人尿激酶原冻干制剂及其制备方法和包含有注射用重组人尿激酶原冻干制剂的组合套件。
8.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
9.第一方面，本发明提供一种注射用重组人尿激酶原制剂，所述注射用重组人尿激酶原制剂为液体制剂，其配方包括重组人尿激酶原、保护剂、表面活性剂、缓冲盐，溶剂为注射用水。
10.本发明所涉及的注射用重组人尿激酶原制剂将保护剂和表面活性剂联合使用，共同作为重组人尿激酶原的保护剂，使重组人尿激酶原的结构更加稳定，不易降解。
11.优选地，所述保护剂包括海藻糖。
12.相对于其他保护剂类型，例如蔗糖、海藻糖、甘露醇、氯化钠、盐酸精氨酸、脯氨酸、甘氨酸等，海藻糖能更显著地保证重组人尿激酶原的结构稳定性，不易降解，双链杂质更少。
13.优选地，所述表面活性剂包括聚山梨酯20和/或聚山梨酯80。
14.相对于其他类型的表面活性剂，本发明特定选择聚山梨酯20和/或聚山梨酯80是因为其与海藻糖在维持重组人尿激酶原的结构稳定性方面具有更显著的协同增效效果。
15.优选地，所述缓冲盐包括枸橼酸/枸橼酸钠。
16.本发明特定使用枸橼酸/枸橼酸钠替代现有技术中用到的磷酸盐缓冲体系、柠檬酸盐缓冲体系或琥珀酸盐缓冲体系，能促使产品更加稳定。
17.优选地，所述注射用重组人尿激酶原制剂的配方包括8-12mg/ml重组人尿激酶原、120-240mmol/l海藻糖、0.1-0.5mg/ml聚山梨酯80、5-15mmol/l枸橼酸/枸橼酸钠，溶剂为注射用水。
18.本发明所涉及的重组人尿激酶原制剂选择上述特定的配方，各组分具有最科学的协同配合关系，使得重组人尿激酶原的结构更加稳定，不易降解。
19.所述重组人尿激酶原的浓度可以为8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml或12mg/ml等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
20.所述海藻糖的浓度可以为120mmol/l、140mmol/l、160mmol/l、170mmol/l、180mmol/l、190mmol/l、200mmol/l或240mmol/l等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
21.所述聚山梨酯80的浓度可以为0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml或0.5mg/ml等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
22.所述枸橼酸/枸橼酸钠的浓度为5mmol/l、7mmol/l、8mmol/l、9mmol/l、10mmol/l、12mmol/l、13mmol/l或15mmol/l等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
23.进一步优选地，所述注射用重组人尿激酶原制剂的配方包括10mg/ml重组人尿激酶原、180mmol/l海藻糖、0.3mg/ml聚山梨酯80、10mmol/l枸橼酸/枸橼酸钠，溶剂为注射用水。
24.在本发明中，所述注射用重组人尿激酶原制剂的ph为3.9-4.5，例如ph＝3.9、ph＝4.0、ph＝4.1、ph＝4.2、ph＝4.3、ph＝4.4或ph＝4.5等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选ph为4.2。
25.相较于现有技术中注射用重组人尿激酶原制剂类产品的ph值一般高于5.0，本发明特定选择ph为3.9-4.5的数值范围是因为ph 5.0远离蛋白酶原等电点及其在体内发挥作用的生理ph，因此本发明所涉及的产品稳定性更优。
26.第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的注射用重组人尿激酶原制剂的制备方法，所述制备方法包括：将重组人尿激酶原、保护剂、表面活性剂、缓冲盐和注射用水混合，即得。
27.第三方面，本发明提供一种注射用重组人尿激酶原冻干制剂，所述注射用重组人尿激酶原冻干制剂是由第一方面所述的注射用重组人尿激酶原制剂经过冻干工艺制备得到的。
28.第四方面，本发明提供一种如第三方面所述的注射用重组人尿激酶原冻干制剂的制备方法，所述制备方法为：将第一方面所述的注射用重组人尿激酶原制剂置于容器中，于冷冻干燥机中依次经过预冻降温、预冻、升温、一次干燥、升温、二次干燥，得到所述注射用重组人尿激酶原冻干制剂。
29.优选地，所述预冻阶段的降温速率为0.5-1.5℃/min，例如0.5℃/min、0.6℃/min、0.8℃/min、1.0℃/min、1.2℃/min、1.3℃/min或1.5℃/min等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
30.优选地，所述预冻的温度为-45～-35℃，例如-45℃、-42℃、-40℃、-38℃、-36℃或-35℃等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
31.优选地，所述一次干燥的温度为-20～-10℃，例如-20℃、-18℃、-15℃、-12℃或-10℃等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
32.优选地，所述二次干燥的温度为25-35℃，例如25℃、28℃、30℃、32℃或35℃等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
33.优选地，所述一次干燥阶段和二次干燥阶段的冻干腔压力独立地为15-25pa，例如15pa、18pa、20pa、22pa或25pa等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
34.优选地，所述容器的底面积为6-8cm2，例如肖特中硼3007 30ml西林瓶。
35.优选地，所述注射用重组人尿激酶原制剂在容器中的装量为4.5-5.5ml，例如4.5ml、4.6ml、4.7ml、4.8ml、4.9ml、5.0ml、5.1ml、5.2ml、5.3ml、5.4ml或5.5ml等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
36.在上述各项冻干参数的特定条件的配合下，使冻干获得的产品外观良好，复溶后外观依旧良好，产品具有很好的热稳定性，经热加速试验后，可见异物、不溶性微粒的含量均非常低。
37.第五方面，本发明还提供一种包含有注射用重组人尿激酶原冻干制剂的组合套件，所述组合套件包括独立包装的如第三方面所述的注射用重组人尿激酶原冻干制剂、生理盐水、快接连通器和注射器。
38.所述快接连通器用于连接生理盐水和注射用重组人尿激酶原冻干制剂，用于快速
溶解，连通器型号示例性地可以为：west(连通器供应商)mix2vial20/20mm。
39.本发明所涉及的上述包含有注射用重组人尿激酶原冻干制剂的组合套件能够提高医护人员的工作效率，顺应性提高，能够节约抢救时间，改善医护人员的使用体验，有很好的实用性和现实意义。
40.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
41.本发明所涉及的注射用重组人尿激酶原制剂(液体制剂或冻干制剂)将保护剂和表面活性剂联合使用，共同作为重组人尿激酶原的保护剂，使重组人尿激酶原的结构更加稳定，不易降解。其中保护剂优选为海藻糖，因为相对于其他保护剂类型，例如蔗糖、海藻糖、甘露醇、氯化钠、盐酸精氨酸、脯氨酸、甘氨酸等，海藻糖能更显著地保证重组人尿激酶原的结构稳定性，不易降解，双链杂质更少；表面活性剂优选为聚山梨酯80，其与海藻糖在维持重组人尿激酶原的结构稳定性方面具有更显著的协同增效效果；缓冲盐优选为枸橼酸/枸橼酸钠去替代现有技术中用到的磷酸盐缓冲体系、柠檬酸盐缓冲体系或琥珀酸盐缓冲体系，能促使产品更加稳定。本发明所涉及的注射用重组人尿激酶原制剂除了处方药物之外均是成分明确的化学物质，采用目前常规的sds电泳纯度以及sec-hplc的分析方法可以很好地分析纯度和杂质，以便更好地控制注射用重组人尿激酶原制剂。
42.另外，本发明所涉及的包含有注射用重组人尿激酶原冻干制剂的组合套件能够提高医护人员的工作效率，顺应性提高，能够节约抢救时间，改善医护人员的使用体验，有很好的实用性和现实意义。
具体实施方式
43.为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
44.下述实施例或对比例所涉及的重组人尿激酶原可按专利公开号cn1062016c、专利公开号cn1730098a中的方法制备得到；容器具体为肖特中硼3007 30ml西林瓶。
45.实施例1
46.本实施例提供一种注射用重组人尿激酶原液体制剂和冻干制剂，制备方法如下：
47.(1)称取重组人尿激酶原、海藻糖、聚山梨酯80、枸橼酸/枸橼酸钠与注射用水混合溶解，使重组人尿激酶原、海藻糖、聚山梨酯80、枸橼酸/枸橼酸钠的浓度分别为10mg/ml、180mmol/l、0.3mg/ml、10mmol/l，调节ph至4.2，得到所述注射用重组人尿激酶原液体制剂。
48.(2)将得到的注射用重组人尿激酶原液体制剂置于底面积为7cm2的容器中，装量为5.4ml，后转移至冻干机中按如下工艺进行冷冻干燥，得到所述注射用重组人尿激酶原冻干制剂。
49.[0050][0051]
实施例2
[0052]
本实施例提供一种注射用重组人尿激酶原液体制剂和冻干制剂，制备方法如下：
[0053]
(1)称取重组人尿激酶原、海藻糖、聚山梨酯80、枸橼酸/枸橼酸钠与注射用水混合溶解，使重组人尿激酶原、海藻糖、聚山梨酯80、枸橼酸/枸橼酸钠的浓度分别为8mg/ml、150mmol/l、0.2mg/ml、8mmol/l，调节ph至4.0，得到所述注射用重组人尿激酶原液体制剂。
[0054]
(2)将得到的注射用重组人尿激酶原液体制剂置于底面积为7cm2的容器中，装量为5.0ml，后转移至冻干机中按如下工艺进行冷冻干燥，得到所述注射用重组人尿激酶原冻干制剂。
[0055][0056]
实施例3
[0057]
本实施例提供一种注射用重组人尿激酶原液体制剂和冻干制剂，制备方法如下：
[0058]
(1)称取重组人尿激酶原、海藻糖、聚山梨酯80、枸橼酸/枸橼酸钠与注射用水混合溶解，使重组人尿激酶原、海藻糖、聚山梨酯80、枸橼酸/枸橼酸钠的浓度分别为12mg/ml、200mmol/l、0.4mg/ml、12mmol/l，调节ph至4.4，得到所述注射用重组人尿激酶原液体制剂。
[0059]
(2)将得到的注射用重组人尿激酶原液体制剂置于底面积为7cm2的容器中，装量为4.5ml，后转移至冻干机中按如下工艺进行冷冻干燥，得到所述注射用重组人尿激酶原冻干制剂。
[0060][0061]
实施例4-6
[0062]
本实施例提供三种注射用重组人尿激酶原液体制剂和冻干制剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于将海藻糖替换为蔗糖、甘露醇和盐酸精氨酸，其他条件均保持不变。
[0063]
实施例7-8
[0064]
本实施例提供两种注射用重组人尿激酶原液体制剂和冻干制剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于将枸橼酸/枸橼酸钠替换为琥珀酸/氢氧化钠、柠檬酸/柠檬酸钠，其他条件均保持不变。
[0065]
实施例9-11
[0066]
本实施例提供三种注射用重组人尿激酶原液体制剂和冻干制剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于步骤(1)中调节ph至3.9、4.5、4.8，其他条件均保持不变。
[0067]
实施例12-13
[0068]
本实施例提供四种注射用重组人尿激酶原液体制剂和冻干制剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于步骤(1)中海藻糖的浓度为120mmol/l、240mmol/l，其他条件均保持不变。
[0069]
实施例14-15
[0070]
本实施例提供四种注射用重组人尿激酶原液体制剂和冻干制剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于步骤(1)中聚山梨酯80的浓度为0.1mg/ml、0.5mg/ml，其他条件均保持不变。
[0071]
实施例16-17
[0072]
本实施例提供两种注射用重组人尿激酶原液体制剂和冻干制剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于步骤(2)中注射用重组人尿激酶原制剂在容器中的装量为3.0ml、8.0ml，其他条件均保持不变。
[0073]
对比例1
[0074]
本对比例提供一种注射用重组人尿激酶原液体制剂和冻干制剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于步骤(1)中不添加聚山梨酯80，其他条件均保持不变。
[0075]
对比例2
[0076]
本对比例提供一种注射用重组人尿激酶原液体制剂和冻干制剂，其制备方法与实施例1的区别仅在于步骤(1)中不添加海藻糖，其他条件均保持不变。
[0077]
评价试验：
[0078]
(1)对实施例1-17和对比例1-2获得的注射用重组人尿激酶原液体制剂分别在0时和30℃或40℃下放置1周后，进行如下稳定性指标的评价：
[0079]
外观考察样品的颜色和澄清度；
[0080]
蛋白浓度用紫外测定仪器进行；
[0081]
sec-hplc采用《中国药典》2020版四部面积归一法，色谱柱为waters xbridge beh200a sec 3.5um 7.8*300mm，流动相为900ml 0.05m磷酸盐缓冲液(ph7.0含0.4m氯化钠) 100ml乙腈，柱温25℃，样品池温度4℃，流速0.5ml/min，上样量10μg，于波长280nm处检测。
[0082]
nrce-sds参考《中国药典》2020版四部中的通则0542毛细管电泳法和通则3127单抗分子大小变异体测定法，采用熔融石英毛细管进行分离，样品缓冲液为0.1mol/l的tris缓冲液(ph9.0含1％sds)，毛细管温度25℃，样品池温度25℃，电压上样20s，于波长220nm处检测。
[0083]
单链比例采用s2444显色底物反应法进行检测。注射用重组人尿激酶原经激活剂
嗜热菌蛋白酶(thermlysin)激活转化成具有催化活性的双链尿激酶(uk)后，用显色底物s2444与尿激酶特异性结合显色的方法测定尿激酶的含量；在非激活条件下，单链形式的尿激酶原不会催化水解s2444底物，测定未激活的注射用重组人尿激酶原也就是测定了其中可能存在的双链uk活性，进而可以计算出注射用重组人尿激酶原原液及成品中的单链尿激酶原比例。
[0084]
蛋白活性采用纤维蛋白平板溶圈法。将活性测定标准品用稀释液稀释至49.60、39.68、29.76、19.84、9.92iu/ml，供试样品稀释至约25-40iu/ml；每个样品2复孔，放入湿盒中，置37℃恒温培养箱过夜，纵横2次量取溶圈直径，以标准品各个稀释度活性的对数为横坐标(x)，溶圈直径的平均值(4次量取的数值)的对数为纵坐标(y)。利用统计学软件中的回归分析方法作标准曲线，并求得y＝a bx中的a和b及拟合优度(r2)值，根据样品的溶圈直径计算样品的活性。
[0085]
mfi采用设备专用方法测定。
[0086]
结果如表1所示：
[0087]
表1
[0088]
[0089]
[0090]
[0091][0092]
由表1数据可知：
[0093]
(2)对实施例1-17和对比例1-2获得的注射用重组人尿激酶原冻干制剂进行tg(玻璃化转变温度)、tc(结晶化温度)的测定，并分别在0时和40℃下放置2周、4周后，进行如下稳定性指标的评价：
[0094]
外观考察样品的颜色和澄清度；
[0095]
蛋白浓度用紫外测定仪器进行；
[0096]
sec-hplc采用《中国药典》2010版三部中的面积归一化法，色谱柱为tskgel g3000sw
xl
7.8
×
300mm，流动相为0.01mol/l的磷酸盐缓冲液(ph6.8含0.4mol/l氯化钠)，柱温25℃，样品池温度4℃，流速0.8ml/min，上样量20μg，于波长280nm处检测。
[0097]
nrce-sds参考《中国药典》2020版四部中的通则0542毛细管电泳法和通则3127单抗分子大小变异体测定法，采用熔融石英毛细管进行分离，样品缓冲液为0.1mol/l的tris缓冲液(ph9.0含1％sds)，毛细管温度25℃，样品池温度25℃，电压上样20s，于波长220nm处检测。
[0098]
mfi、渗透压、水分测量及ph均采用设备专用方法测定。
[0099]
表2
[0100]
[0101]
[0102]
[0103][0104]
表3
[0105]
[0106]
[0107]
[0108]
[0109]
[0110]
[0111]
[0112][0113]
由表2和表3数据可知：本发明所涉及的射用重组人尿激酶原制剂具有非常好的稳定性，且保护剂、表面活性剂、缓冲盐的类型、浓度，制剂的ph等均会影响制剂的稳定性。
[0114]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种注射用重组人尿激酶原制剂及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明
产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
[0115]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0116]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。