一种用于检测HBsAg抗原蛋白的荧光检测方法及试剂盒

一种用于检测hbsag抗原蛋白的荧光检测方法及试剂盒
技术领域
1.本技术涉及物质检测领域，尤其涉及一种用于检测hbsag抗原蛋白的荧光检测方法及试剂盒。


背景技术：

2.乙型肝炎病毒(hbv)属于肝病毒科dna病毒，它是人类最常见的慢性病毒感染之一，也是世界范围内慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的主要病因。hbv感染者以食欲衰减、恶心呕吐以及肝功能异常为主要临床表现，而重型hbv感染者表现为肝肾功能衰竭，并且有着出血倾向，甚至导致死亡。因此，早期诊断、早期治疗是有效治疗乙肝病毒感染者的关键。乙型肝炎表面抗原(hbsag)是糖基化的病毒蛋白gp27，大量存在于感染者的血液中，hbsag为hbv感染后首个出现的血清标志物，不仅效价最高，而且与hbv复制指标hbv-dna有着明显的正相关性，对乙型肝炎的早期诊断有着十分重要的意义。迄今为止，对hbsag的检测方法主要包括：酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫分析(ria)、电化学测试以及化学发光法(clia)等。但是以上方法通常不仅需要昂贵的设备与仪器，并且存在操作复杂、实验流程耗时等弊端，因此，研制出一种简单、高灵敏、耗时短的能够对hbsag产生高亲和力，达到高特异性识别的新型可视化检测传感器体系，是十分有必要的。


技术实现要素：

3.针对以上问题，本发明提出了一种用于检测hbsag抗原蛋白的荧光检测方法，包括以下步骤：
4.s1：提供4-氨基苯磷酸钠盐与缓冲液，将所述4-氨基苯磷酸钠盐溶解于所述缓冲液，得到第一溶液；
5.s2：提供荧光复合物和捕获抗体，所述荧光复合物表面具有能够与所述捕获抗体结合的活性位点，使所述荧光复合物与所述捕获抗体结合得到荧光复合体，接着，使待测hbsag抗原蛋白与所述荧光复合体上的所述捕获抗体结合得到预待测物；
6.s3：提供alp酶联抗体，所述alp酶联抗体表面具有alp酶且与所述捕获抗体具有不同的生物来源，使所述alp酶联抗体与所述预待测物特异性结合得到待测复合物；
7.s4：将所述待测复合物加入至所述第一溶液并加热，得到第一混合液；
8.s5：向所述第一混合液中添加(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷液体，继续加热得到第二混合液；
9.s6：通过荧光光谱仪收集所述第二混合液在455nm及520nm处的发射峰强度，并计算得到所述待测hbsag抗原蛋白的浓度。
10.在其中一个实施例中，步骤s2中所述荧光复合物包括包覆球，以及分散于所述包覆球内的荧光物质，所述荧光物质在紫外光照下显紫色、红色、绿色中的任意一种颜色。
11.在其中一个实施例中，所述荧光物质为钙钛矿量子点、荧光金纳米团簇、荧光碳量子点、荧光硅量子点中的任意一种或多种。
12.在其中一个实施例中，所述包覆球为的材料选自苯乙烯-丙烯酰胺、硅氧化物、钛氧化物中的一种，所述包覆球的平均粒径为100-500nm。
13.在其中一个实施例中，步骤s3中所述alp酶联抗体至少包含第一抗体与第二抗体，所述第一抗体和用于与待测hbsag结合，所述第二抗体的表面具有alp酶，所述第二抗体与所述第一抗体来自同样的生物源，且所述第二抗体连接于所述第一抗体。
14.在其中一个实施例中，步骤s1中所述4-氨基苯磷酸钠盐在所述第一溶液中的浓度为1-100mm。
15.在其中一个实施例中，步骤后s5中所述(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷液体与所述第一混合液的体积比为1:7—3:4。
16.在其中一个实施例中，步骤s1中所述缓冲液为伯瑞坦-罗宾森缓冲液、磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中的至少一种，所述缓冲液的ph值为8.0-10.2。
17.另一方面，本发明还提出一种用于检测hbsag抗原蛋白的试剂盒，包括：4-氨基苯磷酸钠盐、荧光复合物、捕获抗体、alp酶联抗体、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷，所述试剂盒用于通过权利要求1-8任一所述的用于检测hbsag抗原蛋白的荧光检测方法对hbsag进行检测。
18.在其中一个实施例中，所述荧光复合物包括包覆球，以及分散于所述包覆球内的荧光物质，所述荧光物质在紫外光照下显紫色、红色、绿色中的任意一种颜色；所述荧光物质为钙钛矿量子点、荧光金纳米团簇、荧光碳量子点、荧光硅量子点中的任意一种或多种；所述包覆球为的材料选自苯乙烯-丙烯酰胺、硅氧化物、钛氧化物中的一种，所述包覆球的平均粒径为100-500nm。
19.上述检测方法及相应的试剂盒，操作方便，时效高，且检测灵敏度，检测限低，检测范围广，具有良好的应用前景，为hbsag抗原蛋白的检测提供了新思路。
附图说明
20.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明：
21.图1示出了本发明实施例的组合物的使用方法的示意图；
22.图2示出了本发明实施例中hbsag抗原蛋白检测的光谱图及线性关系；
23.图3示出了本发明实施例的特异性数据。
具体实施方式
24.为了更详细地阐明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明的技术方案做进一步阐述。
25.参照图1-3，在本技术中，提出了一种用于检测hbsag抗原蛋白的荧光检测方法，。通常包括以下步骤：s1：提供4-氨基苯磷酸钠盐与缓冲液，将所述4-氨基苯磷酸钠盐溶解于所述缓冲液，得到第一溶液；s2：提供荧光复合物和捕获抗体，所述荧光复合物表面具有能够与所述捕获抗体结合的活性位点，使所述荧光复合物与所述捕获抗体结合得到荧光复合体，接着，使待测hbsag抗原蛋白与所述荧光复合体上的所述捕获抗体结合得到预待测物；s3：提供alp酶联抗体，所述alp酶联抗体表面具有alp酶且与所述捕获抗体具有不同的生物来源，使所述alp酶联抗体与所述预待测物特异性结合得到待测复合物；s4：将所述待测复
合物加入至所述第一溶液并加热，得到第一混合液；s5：向所述第一混合液中添加(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷液体，继续加热得到第二混合液；s6：通过荧光光谱仪收集所述第二混合液在455nm及520nm处的发射峰强度，并计算得到所述待测hbsag抗原蛋白的浓度。
26.需要说明的是，检测过程中使用的捕获抗体与第一抗体均能与hbsag产生特异性结合，但彼此的种类并不相同。例如：捕获抗体和第一抗体均可选自鼠抗hbsag-mab、羊抗hbsag-gab、兔抗hbsag-rab中的一种，且彼此不同。且第二抗体需要选择与第一抗体相同的物种来源，如第一抗体选择羊抗hbsag-gab，则第二抗体可选用兔抗羊rabbit-anti-goat。
27.上述检测方法运用的原理是4-氨基苯磷酸钠盐经碱性磷酸酶催化作用后，去除磷酸基团且进一步与(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷液体发生席夫碱反应，从而生成淡蓝色荧光碳量子点(cds)。由于hbsag抗原蛋白可与捕获抗体和alp酶联抗体特异性结合，所以hbsag抗原蛋白的浓度与alp酶联抗体的浓度存在对应关系，即与第二抗体上偶联的碱性磷酸酶的浓度存在对应关系。不同浓度的hbsag上偶联到的碱性磷酸酶的浓度不同，从而得到的cds的荧光信号不同，即可以通过收集荧光信号得到相应的碱性磷酸酶的用量。该检测方法操作方便，时效高，且检测灵敏度，检测限低，检测范围广，具有良好的应用前景，为hbsag抗原蛋白的检测提供了新思路。
28.需要说明的是，上述检测方法的步骤s1和步骤s2的顺序不作限定，步骤s3-s6在步骤s1和步骤s2完成后依次执行。
29.经过大量的探索实验，为了得到比率荧光检测的可视化效果，使用的荧光物质为钙钛矿量子点、荧光金纳米团簇、荧光碳量子点、荧光硅量子点中的任意一种或多种，在紫外光照下显紫色、红色、绿色中的任意一种颜色，并在荧光光谱出呈现出不同于碳量子点(cds)的发射波长的特征峰。若采用与cds荧光颜色类似的蓝色荧光物质，则会大大削减该比率荧光检测的可视化效果。
30.需要说明的是，本技术中使用的alp酶联抗体，可以是市售的酶联抗体，也可以是由至少两种来源于同一生物的不同抗体特异性结合而成，且其中一种抗体表面具有alp酶。也就是说，alp酶联抗体可以至少包含第一抗体与第二抗体，其中，第一抗体和用于与待测hbsag结合，第二抗体的表面具有alp酶，第二抗体与第一抗体来自同样的生物源，且第二抗体连接于第一抗体共同形成alp酶联抗体。与此同时，在待测复合物的制备过程中，最优选地，当物质的量为捕获抗体:第一抗体:第二抗体:抗原＝50:50:20:1的情况下，各抗体的特异性吸附效果最好，可以充分捕获hbsag抗原且能偶联足够的alp用于后续反应。如若过量则会造成非特异性吸附的增加，最终影响浓度线性关系的建立；如若不足，则无法捕获全部的抗原且无法偶联足够的alp用于后续的催化反应。
31.在探索反应条件的实验中，当4-氨基苯磷酸钠盐的浓度为25mm，(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷液体与所述第一固态交联物的体积比优选为1:7-3:4，最优选地，体积比为1:3，且缓冲液ph值为9.4时，该反应产物cds的产量最高，其荧光强度最强，便于观察荧光颜色的变化。而其他不足或过量的条件，会影响物质的充分反应，降低cds的生成量。先描述优选范围，再描述优选值。
32.示例性地，本发明应用钙钛矿量子点与和苯乙烯-丙烯酰胺(psaa)共聚物构成的荧光复合物完成以下待测复合物的制备：
33.将mab作为捕获抗体：取5μl的钙钛矿荧光球水溶液于离心管中，用1
×
pbs缓冲液
清洗数次后加入300μl浓度为0.01m pb缓冲液(ph＝5.0)超声1min进行充分溶解后，加入100μl浓度为5mg/ml的edc溶液，在37℃下摇床震荡孵育15分钟，再迅速向溶液中加入100μl浓度为2.5mg/ml的nhs溶液继续摇床孵育15分钟。反应完成后，高速离心10分钟弃去上清，将沉淀重新分散于装有1ml
×
pbs缓冲液中，再加入0.5μg的mab，于37℃下气浴振荡1.5h。反应完成后，将溶液取出并移入离心管中在4℃下进行离心洗涤，用浓度为0.01m的1
×
pbs缓冲液洗涤3次后，将沉淀分散于10mg/ml bsa盐溶液中，得到荧光复合体，将其置于4℃冰箱中放置保存。
34.捕获hbsag抗原：取一定量的荧光复合体与不同浓度hbsag抗原蛋白于离心管中，于37℃下孵育1h。反应完成后，将溶液取出并移入离心管中在4℃下进行离心洗涤，用浓度为0.01m的1
×
pbs溶液洗涤3次后，将沉淀重新分散于1
×
pbs溶液中，得到预待测物。
35.将gab作为第一抗体：将清洗掉多余hbsag的预待测物与含有0.5μg的gab溶液在离心管中混合后，于37℃孵育1h。反应完成后，将溶液取出并移入离心管中在4℃下进行离心洗涤，用浓度为0.01m的1
×
pbs溶液洗涤3次后，将沉淀重新分散于1
×
pbs溶液中。
36.将兔抗羊alp作为第二抗体：将连接gab第一抗体并离心洗涤后的沉淀与0.2μg的兔抗羊碱性磷酸酶在离心管中混合，于37℃孵育1h。反应完成后，将溶液取出并移入离心管中在4℃下进行离心洗涤，用浓度为0.01m的1
×
pbs溶液洗涤6次后，将沉淀重新分散于1
×
pbs溶液中。此时，该钙钛矿荧光球上已捕获hbsag，并连接上alp，得到待测复合物。
37.上述实施方式中的钙钛矿量子点和psaa共同构成的荧光复合物的微球的平均粒径为200nm。
38.示例性地，本发明应用钙钛矿量子点与苯乙烯-丙烯酰胺共聚物共同构成的荧光复合物确定对hbsag抗原蛋白的检测浓度范围：
39.用1
×
pbs缓冲液配置100μl终浓度分别为0、0.25、1.25、2.5、5、10、15、20、25、30、50、75ng/ml的hbsag溶液。取定量的钙钛矿荧光复合体于离心管中，向其中加入100μl上述某一浓度的hbsag溶液，37℃孵育1h，形成预待测物后，向其中加入定量羊抗(gab)作为第一抗体，继续37℃孵育1h后加入定量兔抗羊alp作为第二抗体，37℃孵育1h后，第一抗体与第二抗体共同构成酶联抗体，用浓度为0.01m的1
×
pbs溶液洗涤6次后，将沉淀重新分散于1
×
pbs溶液中。此时，该钙钛矿荧光微球上已捕获hbsag，并连接上alp，为待测复合物。配制200μl4-氨基苯磷酸钠盐浓度为25mm的第一溶液，将100μl的待测复合物加入。于70℃下加热105min后，加入100μl(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷液体，继续在70℃下加热80min得到第二混合液。将溶液移入比色皿中，通过荧光光谱仪收集所述第二混合液在455nm及520nm处的发射峰强度；使用不同浓度的hbsag溶液进行检测，记录荧光强度数据，计算检测限和检测范围。
40.如图2a所示，随着hbsag浓度的逐渐增加，alp的浓度也对应增加，整个级联免疫系统的生成cds的荧光强度也在逐渐增强，而定量的钙钛矿荧光球的荧光强度不变，则cds与钙钛矿荧光球发射峰强度的比值不断减小。如图2b所示，hbsag浓度为0.25-30ng/ml的相应荧光信号响应显示出良好的线性关系，其中线性回归方程为i
455
/i
520
＝0.00105c
hbsag
0.782，相关系数为r2＝0.997。其中，i
455
与i
520
分别代表在其原位生成cds及cpb@psaa在各自发射峰处的荧光强度值，c
hbsag
代表的是溶液中hbsag的终浓度(ng/ml)。经过多次实验验证，该检测方法的检出限(lod)低至0.25ng/ml。
41.另一方面，本发明还根据上述对hbsag抗原蛋白的检测方法，提出一种试剂盒用于执行上述检测步骤以实现对hbsag抗原蛋白的检测。试剂盒包括：4-氨基苯磷酸钠盐、荧光复合物、捕获抗体、alp酶联抗体、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷，再结合简单的光谱仪设备即可实现对hbsag的高精度、可视化检测。
42.相应地，用于检测hbsag抗原蛋白的试剂盒，其特征在于，所述荧光复合物包括包覆球，以及分散于所述包覆球内的荧光物质，所述荧光物质在紫外光照下显紫色、红色、绿色中的任意一种颜色；所述荧光物质为钙钛矿量子点、荧光金纳米团簇、荧光碳量子点、荧光硅量子点中的任意一种或多种；所述包覆球为的材料选自苯乙烯-丙烯酰胺、硅氧化物、钛氧化物中的一种，所述包覆球的平均粒径为100-500nm。
43.实施例1：
44.对血清中的hbsag进行检测：
45.从健康志愿者身上取得人血清样品，使用前用1
×
pbs缓冲液稀释50倍。然后通过添加不同浓度的活性hbsag制备标准样品，代替使用1
×
pbs缓冲液配置的hbsag溶液。配置后该体系的hbsag浓度活性分别为5ng/ml、20ng/ml、25ng/ml，其他条件保持不变。本发明应用钙钛矿量子点与苯乙烯-丙烯酰胺共聚物共同构成的荧光复合物进行实验。将配置好的hbsag溶液与钙钛矿荧光球进行组装，形成待测复合物。反应完成后，用1
×
pbs离心洗涤6次，分散于100μl 1
×
pbs中，将150μl含1mm、mgcl的二乙醇胺缓冲溶液(1m,ph 9.4)、20μl的4-氨基苯磷酸钠盐(25mm)和30μl碱性磷酸酶(1u/ml)和100μl hbsag分散液依次加入离心管中，并在70℃下孵育105min。接下来，在离心管中继续加入100μl(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷液体,继续在70℃下孵育80min反应结束。将溶液移入比色皿中，放入荧光光谱仪，进行检测，检测结果如下表所示。测试该hbsag级联免疫检测平台在真实样品测试中的准确性。测试结果如下表所示。
[0046][0047]
结果表明，该方法得到的实际样品分析结果与已知的添加的hbsag浓度高度一致，其平均回收率为99.0％-99.6％。此外，它们的相对标准偏差都不超过2.0％。因此，本技术所提出的对hbsag测定方法是可靠的，能够用于实际样品测定。
[0048]
实施例2：
[0049]
对hbsag的特异性检测：
[0050]
本发明应用钙钛矿量子点与苯乙烯-丙烯酰胺共聚物共同构成的荧光复合物评估对hbsag的特异性检测。将浓度为125ng/ml的乙型肝炎核心抗原(hbcag)、乙型肝炎e抗原(hbeag)、甲胎蛋白(afp)与癌胚抗原(cea)分别作为阴性对照组，将浓度为25ng/ml的hbsag作为实验组，观察荧光信号结果。如图3所示，可以看到，就算在hbcag，hbeag，afp与cea的浓度分别为hbsag的五倍的情况下，该传感系统对hbcag，hbeag，afp与cea的荧光信号反馈仍然十分微弱，而微量的hbsag便可以产生强烈的荧光信号。这是由于在阴性样品的实验中，
由于阴性对照蛋白不能与抗体特异性结合，在洗涤时很轻易地就被洗掉了，因此钙钛矿荧光球上是不会标记上阴性对照蛋白的，也就无法进一步连接兔抗羊alp并在后续反应中原位生成cds，最终观察到的cds的荧光信号就十分微弱。由此可知，该传感系统的cds(em＝455nm)荧光信号强度是hbsag与相应的特异性抗体之间生物特异性相互作用的结果。综上，说明我们制备的荧光免疫传感系统对hbsag的检测具有超高特异性。
[0051]
综上所述，在本技术中，发明人提出了一种用于检测hbsag抗原蛋白的荧光检测方法及试剂盒。通过上述检测方法，操作方便，时效高，且检测限低，检测范围广。可通过比率荧光法实现hbsag抗原蛋白的可视化检测，观察到了令人满意的线性关系。此外，该级联免疫系统同样适用于血清样品中hbsag的检测。该工作为病毒检测与荧光免疫传感系统的研究提供了新思路，在生物医学检测和化学传感领域具有广泛的应用潜力。
[0052]
最后，应当予以说明的是：以上所述实施例仅仅是本发明为清楚地说明本发明所作的较佳举例，但这并不是对本发明的实施方案的限制，所属领域的普通技术人员应当理解，以上方案中技术特征可以任意组合，在上述具体实施方式的基础上还可以做出其它不同形式的修改或对部分技术特征进行同等替换，这里无法对所有的实施方式予以穷举，因而，凡在本发明的精神和原则之内，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的所有的任何修改、改进、等同替换等等，都应处于本发明请求保护的技术范围之内。