一种具有高表达能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体及其构建方法

技术特征：
1.一种具有高表达能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体，其特征在于：包括，以pxmj19质粒载体的基因序列为出发序列，在质粒的启动子后端插入一段改造的谷氨酸棒状杆菌内源基因表达启动子的5’utr序列片段，用于外源基因的表达，得到pxmj19-1676-5’utr-外源基因质粒；将pxmj19-1676-5’utr-外源基因质粒转入bzh001或大肠杆菌感受态中表达，即为高表达能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体。2.如权利要求1所述高表达能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体，其特征在于：所述pxmj19质粒，核苷酸序列如seq id no.23所示。3.如权利要求1所述高表达能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体，其特征在于：还包括，在pxmj19组成型空载质粒基础上，在启动子序列后端插入一段50bp长度的改造5’utr片段，再接入一段长度为15bp的核苷酸序列，再接入作为表达的外源基因序列，得到pxmj19-1676-5’utr-外源基因质粒；其中，所述外源基因包括绿色荧光蛋白基因片段和红色荧光蛋白基因片段。4.如权利要求1或3所述高表达能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体，其特征在于：还包括，所述改造5’utr片段，长度为50bp，以seq id no.24为出发序列，对第40bp-第50bp进行人工突变，第40bp-第50bp突变后的核苷酸序列为片段1-4中的一种：片段1的核苷酸序列：cacctcacac；片段2的核苷酸序列：ccgaccacca；片段3的核苷酸序列：gtaggttata；片段4的核苷酸序列：gtccggtatc；所述长度为15bp的核苷酸序列为：aaaggaggacaacta。5.如权利要求1～4所述高表达能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体的构建方法，其特征在于：包括，获得质粒载体：将pxmj19质粒载体切开；获得改造的外源基因片段：设计上下游引物，上下游引物序列分别如seq id no.2～7、seq id no.8～12所示，对外源基因模板进行扩增反应；得到外源基因片段，进行酶切，得到酶切后的外源基因片段产物，产物进行柱回收；连接：将外源基因片段产物和切开的pxmj19质粒载体连接成pxmj19-1676-5’utr-外源基因质粒；培养：将pxmj19-1676-5’utr-外源基因质粒转化入大肠杆菌或bzh001感受态中表达；其中，由上游引物seq id no.3，下游引物seq id no.2，得到1676-5’utr-egfp片段1，序列如seq id no.19所示；由上游引物seq id no.4，下游引物seq id no.2，得到1676-5’utr-egfp片段2，序列如seq id no.20所示；由上游引物seq id no.5，下游引物seq id no.2，得到1676-5’utr-egfp片段3，序列如seq id no.21所示；由上游引物seq id no.6，下游引物seq id no.2，得到1676-5’utr-egfp片段4，序列如seq id no.22所示；其中，由上游引物seq id no.8，下游引物seq id no.12，得到1676-5’utr-m-cherry片段1，序列如seq id no.14所示；由上游引物seq id no.9，下游引物seq id no.12，得到
1676-5’utr-m-cherry片段2，序列如seq id no.15所示；由上游引物seq id no.10，下游引物seq id no.12，得到1676-5’utr-m-cherry片段3，序列如seq id no.16所示；由上游引物seq id no.11，下游引物seq id no.12，得到1676-5’utr-m-cherry片段4，序列如seq id no.17所示。6.如权利要求5所述高表达能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体的构建方法，其特征在于：还包括，获得质粒载体：将pxmj19质粒载体通过双酶切切开，当外源基因为绿色荧光蛋白基因片段时，酶切位点为hind
ꢀⅲ
和ecor
ꢀⅰ
；当外源基因为红色荧光蛋白基因片段时，酶切位点为hind
ꢀⅲ
和bamh
ꢀⅰ
；获得改造的外源基因片段：设计上下游引物，上下游引物序列分别如seq id no.2～7、seq id no.8～12所示，对外源基因模板使用estaq聚合酶进行pcr的扩增反应；得到外源基因片段，进行双酶切，酶切位点为hind
ꢀⅲ
和ecor
ꢀⅰ
或hind
ꢀⅲ
和bamh
ꢀⅰ
，得到酶切后的外源基因片段产物，产物进行柱回收；连接：使用t4dna连接酶将外源基因片段产物和切开的pxmj19质粒载体连接成pxmj19-1676-5’utr-外源基因质粒；培养：将pxmj19-1676-5’utr-外源基因质粒转化入大肠杆菌或bzh001感受态中表达。7.如权利要求5或6所述高表达能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体的构建方法，其特征在于：在获得质粒载体步骤中，所述双酶切pxmj19质粒载体体系包括，两种快切酶各5ul，载体质量4500-5000ng，green buffer 10ul，加无核酸酶灭菌水至100ul。8.如权利要求5或6所述高表达能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体的构建方法，其特征在于：在获得改造的外源基因片段步骤中，所述扩增反应，为使用estaq聚合酶进行pcr扩增，pcr反应条件为：94℃预变性3min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸，变性、退火、延伸进行共35个循环，72℃保温2min；所述双酶切体系包括两种快切酶各3.5-4ul，片段质量3500-4000ng，green buffer 10ul，加无核酸酶灭菌水至100ul。9.如权利要求5或6所述高表达能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体的构建方法，其特征在于：在连接步骤中，所述连接体系包括，片段：载体＝0.3pmol:0.03pmol，buffer 2ul，t4dna连接酶1ul，加无核酸酶灭菌水至20ul，连接温度16℃，连接时间1h。10.如权利要求5或6所述高表达能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体的构建方法，其特征在于：在培养步骤中，将pxmj19-1676-5’utr-外源基因质粒转化入bzh001感受态后，冰浴10-15mim，1800v电击两次，将质粒与感受态的混合液打入lbhis培养基中，46℃水浴6min，30℃摇床恢复培养1.5-2.5h，涂布lbhis 氯霉素抗性的固体培养基平板，30℃培养箱培养24h。

技术总结
本发明提供了一种具有高表达能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体及其构建方法，目的在于提高外源蛋白的蛋白产量；从蛋白表达元件的突变入手，对目的基因前的一段序列加以突变，在不引入副产物，不对宿主菌株产生额外的影响下，提高蛋白产量；原pXMJ19-egfp的荧光表达量在100000左右，现pXMJ19-1676-5’UTR-egfp的荧光表达量在850000左右，对于5’utr核苷酸序列的加入，蛋白表达元件的绿色荧光蛋白表达能力有了8.5倍左右的提升。本发明不仅仅对egfp这种绿色荧光蛋白有效果，对m-cherry的表达也有提升效果，说明，本发明中的质粒系统可以尝试应用于其他的外源蛋白表达。以尝试应用于其他的外源蛋白表达。以尝试应用于其他的外源蛋白表达。


技术研发人员：刘秀霞 崔思楠 詹锦玲 杨艳坤 刘春立 李业 白仲虎
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2022.02.24
技术公布日：2022/6/28