一种快速检测牛结核病的方法与流程

技术特征：
1.一种快速检测牛结核病的扩增用引物对和探针，其特征在于，所述引物对用于检测序列为seq id no:1的片段，探针检测所述引物扩增的产物。2.如权利要求1所述的扩增用引物和探针，其特征在于，所述的引物对中的上游引物的序列为seq id no：2；下游引物的序列为seq id no：3。3.如权利要求1所述的扩增用引物和探针，其特征在于，所述的探针的序列为seq id no：4。4.如权利要求3所述的扩增用引物和探针，其特征在于，所述的探针的所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰。5.如权利要求4所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列离5
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端碱基数30bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3
′
端碱基数18bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔了3个碱基cag，其中a用四氢呋喃残基替换。6.如权利要求5所述的扩增用引物和探针，其特征在于，所述的述荧光报告基团为fam；荧光淬灭基团为bhq1。7.一种raa荧光检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有权利要求1-6任一项所述的扩增用引物和探针。8.一种基于重组酶等温扩增荧光法快速检测动物布鲁氏菌病的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)提取待检测对象的核酸样品；2)将恒温荧光基因检测仪接通电源进行预热，对反应参数进行设置；反应参数设置为39℃，反应时间：20分钟；3)在25μl反应缓冲液中加入13.7μl水，浓度为15μm的2.1μl权利要求1-6任一项所述的扩增用引物和0.6μl探针，充分混合后添加到raa荧光基础反应试剂中混合，得到反应预混液；4)在反应管盖上加2.5μl的mg
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，将4μl所述步骤1)中得到的核酸样品与所述步骤3)中得到的反应预混液充分混合，得到的反应体系放入恒温荧光基因检测仪检测荧光信号；5)根据raa-f1610检测仪器中的阳性判定方法，选择阈值的方法来判定曲线的阴阳性；在设置自动阈值为300，定性阈值为200，则在20分钟内，荧光值大于300的孔位会被判定为阳性，其余判定为阴性。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的上游引物和下游引物的使用浓度为1～50μm；探针的浓度为1～50μm。10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的上游引物和下游引物的使用浓度为10μm；探针的浓度为10μm。

技术总结
本发明公开了一种通用快速检测牛结核病的引物、探针及检测方法，其中引物和探针适用于RAA荧光法检测，可实现在39℃条件下20分钟内完成动物布鲁氏菌核酸的检测；与猪链球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、布鲁氏菌核酸样本无交叉反应，特异性达100％；检测方法快速、容易实现高通量，同时降低了检测时间和检测成本，本发明提供的基于RAA荧光法通用快速检测牛结核病病原的方法，灵敏度高，反应检测灵敏度在95％的概率下达到66copies/反应。66copies/反应。66copies/反应。


技术研发人员：樊晓旭 张浩博 刘婷婷 亓菲 孙翔翔 刘蒙达 田莉莉 孙明军 董雅琴 焉鑫 付树芳 孙世雄 迟庆安 冯淑芳 仵国政 张培培 魏润宇 王毓秀 邵卫星 孙淑芳 范伟兴
受保护的技术使用者：中国动物卫生与流行病学中心
技术研发日：2022.03.15
技术公布日：2022/6/24