一种高温降解纤维素的菌株及其应用

1.本发明涉及微生物技术领域，具体地说是涉及一种高温降解纤维素的菌株及其应用。


背景技术：

2.白酒糟是白酒产业主要的副产品，其含有丰富的营养成分，如淀粉、脂肪、蛋白质、维生素、氨基酸等，具有广阔的开发利用价值。2020年1～12月，白酒产量740.73万千升，按白酒与酒糟的产量比为1:3，可以计算出2020年酒糟的生产量大概是2222.19万吨，如此庞大的酒糟不能合理利用将会是资源浪费，也会污染环境。将酒糟重复利用制作饲料，不仅能有效缓解饲料短缺问题，也能促进白酒行业经济的发展。
3.纤维素是自然界中分布广泛、含量最多的有机物之一，分子结构非常的稳定，难以降解。酒糟中含有大量的纤维素，是制作酒糟饲料的主要限制因素，所以解决这一问题十分重要，利用纤维素降解酶这一生物法来实现纤维素的原料转化，是当前生物质资源研究的热点和重点。
4.高温菌是一类能在45℃以上生长和繁殖的嗜热微生物，降解性能好、代谢效率高，在很多领域都发挥着重要的作用。高温有利于纤维素降解但也会抑制微生物的生长，从而影响纤维素的快速降解。嗜热纤维素降解菌可降解纤维素，还可加速发酵进程，促进物料腐熟，添加高温纤维素降解菌剂可提高酒糟饲料的消化率和适口性。因此筛选耐受高温的纤维素降解菌，既有利于降低酒糟饲料中的粗纤维素含量，又能抑制杂菌的感染，提高酒糟饲料的安全性，在一定程度上提高酒糟的饲喂价值。
5.本发明筛选出高温的纤维素降解菌，通过对其进行相关特性研究，以期为后续高温菌剂的制备及有机饲料的生产奠定基础，这对于白酒糟发酵饲料生产技术的应用和推广具有重要意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种高温降解纤维素的菌株及其应用，以解决现有技术中酒糟量大而难以降解利用的问题。
7.本发明技术方案为：一种高温降解纤维素的菌株，所述菌株为嗜热子囊菌(thermoascussp.)k1(具体种为thermoascus aurantiacus)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年05月 07日，保藏编号为cgmcc no.21957。
8.菌株k1的形态特征：培养初期菌丝白色，呈稀疏网状，3d后，菌落表面有白色颗粒状出现，渐转为金黄色至锈棕色，5～6d左右产生黄色或者棕色的水珠状的分泌物，菌丝无色，光滑，具分枝和隔膜，分生孢子位于菌丝的末端，闭囊壳单生或簇生，球形或不规则状，黄棕色。
9.菌株k1的its序列为：
mgso4·
7h2o 0.5g、滤纸条1cm
×
5cm 5条、蒸馏水1l，ph自然。
29.分离培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、孟加拉红培养基。
30.马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，pda)培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1l，ph自然。
31.发酵培养基：酒糟10g、蛋白胨5g、nacl 5g、kh2po
4 1g、(nh4)2so
4 2g、mgso4·
7h2o0.5g蒸馏水1l，ph自然。
32.酒糟降解培养基：酒糟10g、麸皮7.5g，蒸馏水30ml，ph自然。
33.1.菌株k1的分离、纯化和保藏
34.取河北大学校内的松针腐质土为样品，称取10g的土样倒入装有90ml无菌水的500ml 锥形瓶中，50℃、180rpm震荡培养，直到滤纸全部分解，然后按1％的接种量接入另一富集培养基中，反复驯化4-5次。
35.吸取1ml富集液进行梯度稀释，分别涂布于配置好的培养基中，放置50℃条件下培养，其中细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基；霉菌采用孟加拉红培养基；放线菌采用高氏一号培养基。多次进行平板划线进行菌种纯化得到单菌落，并于4℃斜面保存。
36.2初筛与复筛
37.将分离得到的菌株挑取2环接种到发酵培养基中，在50℃、180rpm条件下振荡培养，细菌培养1天，霉菌培养4天，放线菌培养7天，每组做3个平行，测定其滤纸酶活和纤维素酶活(见表1)，筛选出酶活高的一株菌株k1，菌体形态及生殖结构如图1所示。
38.表1：初筛与复筛测定结果
[0039][0040]
3.菌株的分子生物学鉴定
[0041]
通过美国生物工程信息中心(national center for biotechnology information，ncbi)blast 程序比对，发现本发明的cgmcc no21957的菌株k1的its基因序列与ncbi中的thermoascus aurantiacus具有较高的同源性，用megax软件构建系统发育树(图2)，图2 显示菌株k1与thermoascus aurantiacus同源，确定为嗜热子囊菌。
[0042]
实施例2发酵特性实验
[0043]
1.各温度下生长曲线的测定
[0044]
将菌株点接到pda培养基上，分别置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、 55℃、60℃、65℃、70℃下静置培养，每天测定菌落的大小，绘制曲线如图3所示。
[0045]
2.菌株k1纤维素酶活和滤纸酶活的测定
[0046]
酶活测定测定方法采用dns法，参照中华人民共和国轻工行业标准qb 2583—2003《纤维素酶制剂》中适应酸性纤维素酶测定方法，测定滤纸酶活力和cmc酶活力。
[0047]
cmc酶活力计算公式为：x1＝a
×
1/0.5
×n×2[0048]
式中x1:羧甲基纤维素酶活力，u/g(或u/ml)；
[0049]
a：吸光度在标准曲线上查得(或计算出)的还原糖量，mg；
[0050]
1/0.5：换算成酶液1ml；
[0051]
n：酶样的稀释倍数；
[0052]
2：时间换算系数。
[0053]
滤纸酶活力计算公式为：x2＝a
×
1/0.5
×n[0054]
式中x2：样品的滤纸酶活力(fpa)，u/g(或u/ml)；
[0055]
a：根据吸光度在标准曲线上查得(或计算出)的还原糖量，mg；
[0056]
1/0.5：换算成酶液1ml；
[0057]
n:酶样的稀释倍数。
[0058]
主要测定步骤为：
[0059]
①
葡萄糖标准曲线的制备：取7支25ml具塞试管，分别加入葡萄糖标准溶液0ml、5ml、 7.5ml、10ml、12.5ml、15ml、17.5ml，加入1.5ml的柠檬酸缓冲液，再加入3ml的dns，沸水浴10min，冷却后定容到25ml。以0号试管为空白对照，在540nm下测定吸光度，并绘制标准曲线。
[0060]
②
粗酶液的制备：将菌株接种到pda培养基上50℃培养3d，用灭菌的牛津杯取相同大小的菌块，加入到发酵培养基中，50℃、180rpm振荡培养4d，将发酵液4000rpm离心10min，取上清液，即粗酶液。
[0061]
③
测定纤维素酶活力，根据公式计算纤维素酶活力。
[0062]
测定结果如表2和表3所示。
[0063]
表2：菌株k1不同温度下2种纤维素酶活力
[0064][0065]
菌株k1在40～60℃均能产生较高的纤维素酶活，cmc酶活在40℃～50℃范围内呈上升状态，在50℃达到最高值，50℃～60℃呈下降状态；滤纸酶活在40℃～45℃呈上升状态，在 45℃达到最高值，在45℃～60℃呈下降状态。综合cmc酶活力和滤纸酶活力，菌株k1的最佳发酵温度为50℃，该菌产酶属于高温产酶范畴。
[0066]
表3：菌株k1在不同初始ph条件下2种纤维素酶活力
[0067]
phcmc酶活力(u/ml)滤纸酶活力(u/ml)20.2310.098
35.2570.96548.9021.88558.3661.71060.2690.098
[0068]
菌株k1在ph2～6范围内均能产生纤维素酶活。cmc酶活和滤纸酶活在ph2～4范围内呈上升状态，在ph＝4时达到最高值，ph在4～6范围内呈下降状态。菌株k1的最佳发酵初始ph为4，该菌株属于耐酸产酶范畴。
[0069]
实施例3菌株k1降解酒糟能力的测定
[0070]
在50℃下，将菌株k1接种到酒糟降解培养基中作为试验组，对照组不接菌，在50℃条件下静止培养30天，将样品用蒸馏水全部洗涤出来，抽滤处理，最后将酒糟置于烘箱烘干至恒重。酒糟降解率的计算公式为：
[0071]
酒糟降解率＝(处理前干质量-处理后干质量)/处理前干质量
×
100％
[0072]
经菌株k1处理的酒糟失重率为41.36％，对照组的酒糟失重率为12.57％，菌株k1对酒糟降解率为28.79％。