一种鉴别陈皮年份的数学模型及其建立方法、应用

1.本发明涉及中药材鉴别技术领域，尤其涉及一种鉴别陈皮年份的数学模型及其建立方法、应用。


背景技术：

2.陈皮，又名橘皮、贵老，是芸香科植物橘的成熟果皮经过反复晾晒，并在特定环境下长期贮藏后形成的一种滋补饮品和中药材，具有理气健脾、燥湿化痰的功效，是一种药食同源的功能性物质。传统观点认为陈皮储存时间越久，其药用价值就越高。目前，市面上销售的陈皮根据其储藏年份不同，价格差异巨大，二十年以上的陈皮价格可达一公斤几万元。而不同年份的陈皮难以分辨，市场上存在以次充好的现象。因此，建立一种准确鉴定陈皮年份的方法成为了一个亟待解决的问题。
3.目前，陈皮年份的鉴定方法主要包括外部特征观察、活性成分测定和光谱指纹技术。外观观察主要是利用人的视觉和嗅觉对陈皮的颜色、气味和质地进行观察来判断陈皮的年份。这种方法主观性较强，需要鉴定者具有丰富的实践经验。王光宁等人采用色彩色差计对广陈皮的外观颜色进行量化，建立了基于明度值、红绿分量值和黄蓝分量值的广陈皮陈化年份的数学模型，一定程度上减小了人为鉴别造成的偏差。陈皮中活性成分含量的测定是另一种常用的陈皮年份鉴定方法。2020年《中国药典》中指出在广陈皮中橙皮苷的含量不得少于2.0％、川陈皮素和橘皮素的总量不得少于0.42％。梁天一等采用气相-离子迁移谱(gc-ims)分析了不同年份陈皮中的挥发性物质组成，发现不同年份陈皮中挥发油组分存在很大的差异，可作为一种陈皮年份鉴定的方法。此外，各种光谱指纹技术也被逐渐用于陈皮的年份鉴定，余梅等人利用近红外光谱技术对不同年份陈皮进行了鉴别。周洁等利用高效液相色谱构建了陈皮的指纹图谱，为不同年份陈皮质量控制提供参考。
4.目前，常通过检测陈皮中橙皮苷(橙皮苷属于黄酮类物质)的含量来判断陈皮的年份。但是，随着陈皮年份的增加，橙皮苷含量的变化趋势并不确定，有的成增加趋势，有的呈降低趋势，导致采用橙皮苷含量来判断陈皮年份并不准确。另外陈皮中活性物质的存在形式往往是一种动态的，例如黄酮等可以游离态、酯化态和绑定-不溶态的形式存在。在进行活性成分提取时，通常只能提取到游离态、酯化态的活性成分，而绑定-不溶态的活性成分不易提取，并且采用紫外光度法和高效液相色谱法(外标法)检测时，酯化态活性成分无紫外吸收或最大吸收波长易发生偏移，导致酯化态活性成分无法检测或存在检测误差，从而进一步降低陈皮年份判定的准确性，容易产生误差。
5.另外，挥发油虽然是陈皮中一种重要的活性成分，但由于其具有较强的挥发性，随着陈化年份的延长，其浓度往往降低，无法建立良好的判定模型。指纹等波谱技术虽然可以对陈皮年份进行判定，但需要高昂的仪器设备和专业技术，不利于企业的实际生产。


技术实现要素：

6.基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种鉴别陈皮年份的数学模型及其
建立方法、应用，本发明采用酯化酚酸在总酚酸中的质量分数作为自变量，一方面符合酚酸在陈皮陈化过程中的存在形式的变化规律，另一方面可以减少由于样品个体差异造成的偏差，提高陈皮年份鉴别的准确性。
7.本发明提出了一种鉴别陈皮年份的数学模型，以x为横坐标、y为纵坐标，拟合多项式回归曲线，得到回归方程从而构建成数学模型，其中，x为各年份的陈皮中酯化酚酸在总酚酸中的质量分数，y为陈皮年份。
8.优选地，总酚酸为游离酚酸、酯化酚酸与绑定酚酸的总和。
9.陈皮中除了黄酮和挥发油类外，还含有大量的酚酸，含量在2.0％以上。酚酸在结构上包含酚羟基，能与羧基形成酯键。而陈皮中含量最丰富的碳水化合物是一类果胶类物质，其中含有大量的半乳糖醛酸，可以与酚酸发生酯化反应。因此，陈皮中酚酸存在游离态、酯化态和绑定(即不溶态)的形式。
10.而发明人经研究发现，随着陈皮年份的增加酯化态酚酸的含量呈增加趋势，因此发明人提出了用酯化酚酸在总酚酸中的质量分数作为自变量，陈皮年份作为因变量，建立两者的数学模型，用于陈皮年份的鉴定。
11.采用酯化酚酸在总酚酸中的质量分数作为自变量，一方面符合酚酸在陈皮陈化过程中的存在形式的变化规律，另一方面可以减少由于样品个体差异造成的偏差，提高陈皮年份鉴别的准确性，且本发明所述数学模型是之前所没有的。另外本发明所述数学模型的建立方法简单，用于陈皮年份鉴别的方法也简便，易于操作。
12.本发明还提出了上述鉴别陈皮年份的数学模型的建立方法，包括如下步骤：从各年份陈皮中提取游离酚酸、酯化酚酸、绑定酚酸，然后检测各年份陈皮中游离酚酸、酯化酚酸、绑定酚酸的含量，计算各年份陈皮中酯化酚酸在总酚酸中的质量分数，然后以x为横坐标、y为纵坐标，拟合多项式回归曲线，得到回归方程从而构建成数学模型，其中，x为各年份的陈皮中酯化酚酸在总酚酸中的质量分数，y为陈皮年份。
13.上述陈皮中游离酚酸、酯化酚酸、绑定酚酸的提取方法，可以采用本领域常规方法，也可以采用如下方法。
14.优选地，陈皮中游离酚酸的提取步骤包括：用乙醇水溶液对陈皮进行超声提取得到沉淀物和上清液，去除上清液中的乙醇，调节ph＝1.8-2.2得到溶液a；向溶液a中加入乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相浓缩至干得到物质b，用甲醇水溶液溶解物质b得到游离酚酸待测液。
15.优选地，乙醇水溶液中，乙醇的体积分数为45-55％。
16.优选地，用无机酸调节ph；优选用盐酸调节ph。
17.优选地，陈皮中酯化酚酸的提取步骤包括：取游离酚酸提取步骤中乙酸乙酯萃取后剩余的水相，去除水相中残余的乙酸乙酯，加入碱性物质混匀得到溶液c；在惰性气体氛围中，进行碱水解反应，然后调节ph＝1.8-2.2，加入乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相浓缩至干得到物质d，用甲醇水溶液溶解物质d得到酯化酚酸待测液。
18.优选地，溶液c中，碱性物质的浓度为3.8-4.2mol/l；优选碱性物质为无机碱，更优选为氢氧化钠。
19.优选地，碱水解反应的温度为室温，碱水解反应的时间为3.5-4.5h。
20.优选地，用无机酸调节ph；优选用盐酸调节ph。
21.优选地，陈皮中绑定酚酸的提取步骤包括：取游离酚酸提取步骤中的沉淀物，与碱性物质水溶液混匀，在惰性气体氛围中，进行碱水解反应，然后调节ph＝1.8-2.2，固液分离得到溶液e；向溶液e中加入乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相浓缩至干得到物质f，用甲醇水溶液溶解物质f得到绑定酚酸待测液。
22.优选地，碱性物质水溶液的浓度为3.8-4.2mol/l；优选碱性物质为无机碱，更优选为氢氧化钠。
23.优选地，碱水解反应的温度为室温，碱水解反应的时间为3.5-4.5h。
24.优选地，用无机酸调节ph；优选用盐酸调节ph。
25.在提取游离酚酸、酯化酚酸、绑定酚酸时，陈皮和甲醇水溶液的重量体积比优选为1g:20ml；甲醇水溶液中，甲醇的体积分数优选为45-55％。
26.在提取游离酚酸、酯化酚酸、绑定酚酸时，超声提取和萃取的次数为至少一次。
27.发明人采用上述提取步骤对同一陈皮中的游离酚酸、酯化酚酸、绑定酚酸进行提取，并使得各待测液中酚酸的状态最终均呈游离态，使得酚酸可以被紫外或高效液相准确检测，从而提高模型的准确性。
28.优选地，采用紫外光谱法、高效液相色谱法或气相色谱法检测，按外标法计算陈皮中游离酚酸、酯化酚酸、绑定酚酸的含量。
29.优选地，外标法使用的对照品为没食子酸。
30.优选外标法的具体步骤包括：配置不同浓度的对照品溶液，采用紫外光谱仪检测各对照品溶液的吸光度，并绘制标准曲线，得到线性回归方程；然后分别检测游离酚酸待测液、酯化酚酸待测液、绑定酚酸待测液的吸光度，根据线性回归方程计算陈皮中游离酚酸、酯化酚酸和绑定酚酸的含量，再计算得到陈皮中酯化酚酸在总酚酸中的质量分数。
31.上述酯化酚酸在总酚酸中的质量分数的计算公式为：酯化酚酸含量/(游离酚酸含量 酯化酚酸含量 绑定酚酸含量)
×
100％。
32.本发明还提出了一种陈皮年份的鉴别方法，包括如下步骤：检测待测陈皮中酯化酚酸在总酚酸中的质量分数，根据上述鉴别陈皮年份的数学模型，将酯化酚酸在总酚酸中的质量分数的检测结果带入回归曲线和回归方程中，算得待测陈皮的年份。
33.有益效果：
34.发明人经研究发现，随着陈皮年份的增加酯化态酚酸的含量呈增加趋势，因此发明人提出了用酯化酚酸在总酚酸中的质量分数作为自变量，陈皮年份作为因变量，建立两者的数学模型，用于陈皮年份的鉴定。
35.采用酯化酚酸在总酚酸中的质量分数作为自变量，一方面符合酚酸在陈皮陈化过程中的存在形式的变化规律，另一方面可以减少由于样品个体差异造成的偏差，提高陈皮年份鉴别的准确性，且本发明所述数学模型是之前所没有的。另外本发明所述数学模型的建立方法简单，用于陈皮年份鉴别的方法也简便，易于操作。
附图说明
36.图1为实施例4中没食子酸的线性标准曲线。
37.图2为实施例6中的拟合多项式回归曲线。
具体实施方式
38.下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明，但是应该明确提出这些实施例用于举例说明，但是不解释为限制本发明的范围。
39.以下实施例中所用的样品和试剂信息如下：
40.一、三、五、七、十、十五和二十年的陈皮购自广东省江门市新会区新宝堂茶叶有限公司，是大红柑的干果皮。陈皮样品在40℃烘箱中干燥至恒重，用组织粉碎机粉碎后过18目筛，收集过筛颗粒，备用。
41.没食子酸(分析纯)购至国药集团；无水乙醇、乙酸乙酯、甲醇、盐酸、碳酸钠等均为分析纯。
42.以下实施例中用的水均为蒸馏水。
43.实施例1
44.从各年份的陈皮中提取游离酚酸，提取步骤为：
45.精确称取1.0g陈皮颗粒，在30℃和40khz条件下，用体积分数为50％的乙醇水溶液超声提取3次(每次乙醇水溶液的用量均为20ml，每次超声时间均为1.0h，每次均8000rpm离心10min)，合并3次超声的上清液(沉淀物在50℃鼓风干燥箱烘干备用)，用真空-旋转蒸发仪(re-2000b，巩义市予华仪器有限公司)于50℃对上清液进行浓缩，去除其中的乙醇，浓缩后的体积约30-40ml，然后用6.0mol/l的hcl水溶液调ph＝2.0得到溶液a；向溶液a中加入乙酸乙酯萃取3次(每次乙酸乙酯的用量均与溶液a体积相同)，合并3次的乙酸乙酯相，用真空-旋转蒸发仪浓缩至干得到物质b，用20ml体积分数为50％的甲醇水溶液溶解物质b得到游离酚酸待测液。
46.实施例2
47.从各年份的陈皮中提取酯化酚酸，提取步骤为：
48.取实施例1的提取步骤中乙酸乙酯萃取后剩余的水相，用真空-旋转蒸发仪浓缩去除水相中残余的乙酸乙酯，用水定容至30-40ml，加入氢氧化钠混匀得到氢氧化钠的浓度为4mol/l的溶液c；然后通入氮气，排除氧气，于室温反应4.0h，然后用6.0mol/l的hcl水溶液调ph＝2.0，加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并3次的乙酸乙酯相，再真空浓缩至干得到物质d，用20ml体积分数为50％的甲醇水溶液溶解物质d得到酯化酚酸待测液。
49.实施例3
50.从各年份的陈皮中提取绑定酚酸，提取步骤为：
51.取实施例1的提取步骤中的沉淀物，加入浓度为4.0mol/l的氢氧化钠水溶液混匀(沉淀物和氢氧化钠水溶液的比值为1g:10ml)，然后通入氮气，排除氧气，于室温反应4.0h，用6.0mol/l的hcl水溶液调ph＝2.0，然后8000rpm离心10min取上清液得到溶液e；向溶液e中加入等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并3次的乙酸乙酯相，真空浓缩至干得到物质f，用20ml体积分数为50％的甲醇水溶液溶解物质f得到绑定酚酸待测液。
52.实施例4
53.绘制标准曲线：
54.用体积分数为50％的甲醇水溶液配置浓度分别为0.004、0.008、0.02、0.032、0.04、0.048和0.06mg/ml的没食子酸标准液；然后取各没食子酸标准液0.5ml，分别与0.5ml浓度为0.25mol/l的folin-ciocalteu试剂混合，用涡轮器混匀3min，再分别加入1.0ml质量
分数为10％的碳酸钠水溶液，于25℃下静置30min，3500rpm离心3min取上清液，以质量分数为15％的碳酸钠水溶液为空白溶液，用紫外可见分光光度计(l4，上海佑科仪器仪表有限公司)在760nm处测定各上清液的吸光度，绘制吸光度与没食子酸浓度之间的标准曲线，得到线性回归方程为：y＝26.942x 0.0484(r2＝0.9961)，x为没食子酸浓度，y为吸光度；标准曲线如图1所示。
55.实施例5
56.检测各年份的陈皮中酯化酚酸在总酚酸中的质量分数：
57.取实施例1-3中获得的各年份陈皮的游离酚酸待测液、酯化酚酸待测液、绑定酚酸待测液，按照如下步骤进行检测：将待测液0.5ml与0.5ml浓度为0.25mol/l的folin-ciocalteu试剂混合，用涡轮器混匀3min，再分别加入1.0ml质量分数为10％的碳酸钠水溶液，于25℃下静置30min，3500rpm离心3min取上清液，以质量分数为15％的碳酸钠水溶液为空白溶液，用紫外可见分光光度计(l4，上海佑科仪器仪表有限公司)在760nm处测定上清液的吸光度；然后将吸光度带入线性回归方程计算各待测液中的酚酸浓度(每个样品重复检测三次，取平均值)；
58.然后根据公式(酚酸含量＝待测液中的酚酸浓度
×
甲醇水溶液的体积/陈皮重量＝待测液中的酚酸浓度
×
20ml/1g，待测液中的酚酸浓度的单位为mg/ml)计算各年份陈皮中游离酚酸、酯化酚酸、绑定酚酸的含量；
59.并根据公式(酯化酚酸含量/(游离酚酸含量 酯化酚酸含量 绑定酚酸含量)
×
100％)计算得到酯化酚酸在总酚酸中的质量分数。
60.实施例6
61.建立鉴别陈皮年份的数学模型，包括如下步骤：
62.用实施例5测得的各年份陈皮中酯化酚酸在总酚酸中的质量分数作为自变量x，对应的陈皮年份作为应变量y，绘制曲线，拟合多项式回归曲线，得到回归方程为：y＝0.0488x
2-1.8964x 19.297(r2＝0.999)，从而构建得到鉴别陈皮年份的数学模型，拟合多项式回归曲线如图2所示。
63.实施例7
64.验证实施例6数学模型的准确性。
65.取三年陈皮、七年陈皮，按照实施例1-3分别提取得到游离酚酸待测液、酯化酚酸待测液、绑定酚酸待测液；然后按照实施例4-5分别检测各年份陈皮中酯化酚酸在总酚酸中的质量分数；再将质量分数的结果带入实施例6所述的回归方程中，算得陈皮的年份，结果如表1所示。
66.表1验证准确性能结果
[0067][0068][0069]
由表1可以看出，利用本发明所述鉴别陈皮年份的数学模型，可以准确的判断陈皮的陈化年份。
[0070]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。