一种牙髓间充质干细胞保存用添加剂及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种细胞保存用添加剂，尤其涉及一种牙髓间充质干细胞保存用添加剂及其应用。


背景技术：

2.牙髓间充质干细胞是存在于牙髓组织中的一类具有自我更新及多向分化能力的间充质干细胞。牙髓间充质干细胞增殖能力强，具有多向分化的潜能，它除了能形成矿化结节能力的细胞外，经过不同细胞因子的诱导，还能够分化为多种类型的细胞。在牙髓组织损伤时，牙髓组织中的牙髓间充质干细胞会发生增殖、迁移于牙齿的损伤部位分化为牙本质细胞，修复牙本质，保护牙髓。所以牙髓干细胞的研究对修复和再生牙齿带来了可行性。牙髓间充质干细胞来源丰富，小孩自然脱落的牙齿、成人需要拔掉的智齿中都含有丰富的牙髓间充质干细胞。
3.在牙髓间充干细胞的应用中，由于直接分离得到的牙髓间充质干细胞数量有限，不能满足使用需求，往往需要体外大量扩增以得到足够数量的牙髓间充质干细胞。由于扩增培养需要一定的时间周期，为了保证牙髓间充质干细胞能被及时应用，会对培养得到的细胞进行保存，常见的细胞保存方式为：将正常培养的细胞添加营养成分及防冻保护剂dmso，然后降温后保存在液氮中。使用时将细胞迅速解冻到常温，同时确保恢复细胞的生物学特征。液氮中保存可以延长细胞的保存时间，但是对于仅需要短时间保存的细胞，采用液氮冻存操作复杂，增加保存成本。并且冻存过程会显著改变细胞的热力学和物理环境，会对牙髓干细胞造成一定的损伤，无法保证细胞的活力，细胞增殖率较低，影响牙髓间充干细胞的临床应用。因此，有必要对牙髓间充质干细胞的保存做出改进，探索在非超低温环境下保存牙髓间充质干细胞的可能性，为临床应用提供更多便利。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种牙髓间充质干细胞保存用添加剂，成分简单，无需超低温环境，实现了牙髓间充质干细胞在2-6℃条件下的保存。
5.本发明的目的之二在于提供了一种上述添加剂在保存牙髓间充质干细胞的具体应用。
6.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
7.一种牙髓间充质干细胞保存用添加剂，由以下成分组成：金丝皇菊蛋白多肽、谷朊粉、透明质酸、葡萄糖、l-谷氨酰胺、d-甘露醇。
8.进一步地，各成分的用量如下：金丝皇菊蛋白多肽3.5-5.8份、谷朊粉2.3-4.5份、透明质酸4.2-6.0份、葡萄糖5.5-8.5份、l-谷氨酰胺7.5-10.0份、d-甘露醇5.4-7.6份。
9.进一步地，各成分的用量如下：金丝皇菊蛋白多肽4.7份、谷朊粉3.5份、透明质酸5.4份、葡萄糖7.0份、l-谷氨酰胺8.5份、d-甘露醇6.8份。
10.进一步地，所述金丝皇菊蛋白多肽的分子量≤3kda。所用金丝皇菊蛋白多肽采用
专利202110458702.4中的方法制备得到。
11.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
12.所述添加剂的应用，将所述添加剂加入至基础培养基中得保存用混合液，将上述混合液用于牙髓间充质干细胞的保存。
13.进一步地，保存温度为2-6℃。
14.进一步地，所述基础培养基为dmem/f12培养基。
15.进一步地，所述添加剂和基础培养基的重量份比为1:80-90。
16.进一步地，所述混合液中牙髓间充质干细胞的密度为2-5
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105个/ml。
17.相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供了一种牙髓间充质干细胞保存用的添加剂，该添加剂中包括植物蛋白金丝皇菊蛋白多肽和谷朊粉，以及能维持牙髓间充质干细胞稳定的透明质酸、葡萄糖、l-谷氨酰胺、d-甘露醇，各组分协同作用，实现了牙髓间充质干细胞在2-6℃下的保存，经保存后的牙髓间充质干细胞仍具有活率高，活性好的特点，对牙髓间充质干细胞在临床上推广应用具有重大意义。
18.本发明还提供一种上述添加剂的具体应用，将上述添加剂和基础培养基混合后用于牙髓间充干细胞的保存，为牙髓间充质干细胞的保存提供了一种简便、高效的方法。
附图说明
19.图1为本发明为牙髓间充质干细胞在保存不同时间时细胞的存活率；
20.图2为保存72h的牙髓间充质干细胞在培养时的贴壁时间。
具体实施方式
21.下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
22.实施例1至3以及对比例中所用的牙髓间充质干细胞均为实验室通过常规培养方法得到的传代细胞。
23.实施例1
24.一种牙髓间充质干细胞保存用添加剂，由以下重量份的原料组成：分子量≤3kda的金丝皇菊蛋白多肽4.7份、谷朊粉3.5份、透明质酸5.4份、葡萄糖7.0份、l-谷氨酰胺8.5份、d-甘露醇6.8份。
25.上述添加剂的应用，将上述添加剂加入至dmem/f12培养基中得到保存用混合液降温至2℃备用，添加剂和dmem/f12培养基的重量份比为：1:80，将传代培养得到的p3代牙髓间充质干细胞加入上述混合液中，细胞密度为2
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105个/ml，分装在2ml的保存管中，每管1.5ml，在2℃条件下保存。
26.实施例2
27.一种牙髓间充质干细胞保存用添加剂，由以下重量份的原料组成：分子量≤3kda的金丝皇菊蛋白多肽3.5份、谷朊粉2.3份、透明质酸4.2份、葡萄糖5.5份、l-谷氨酰胺7.5份、d-甘露醇5.4份。
28.上述添加剂的应用，将上述添加剂加入至dmem/f12培养基中得到保存用混合液降
温至4℃备用，添加剂和dmem/f12培养基的重量份比为：1:85，将传代培养得到的p4代牙髓间充质干细胞加入上述混合液中，细胞密度为3
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105个/ml，分装在2ml的保存管中，每管1.5ml，在4℃条件下保存。
29.实施例3
30.一种牙髓间充质干细胞保存用添加剂，由以下重量份的原料组成：分子量≤3kda的金丝皇菊蛋白多肽5.8份、谷朊粉4.5份、透明质酸6.0份、葡萄糖8.5份、l-谷氨酰胺10.0份、d-甘露醇7.6份。
31.上述添加剂的应用，将上述添加剂加入至dmem/f12培养基中得到保存用混合液降温至6℃备用，添加剂和dmem/f12培养基的重量份比为：1:90，将传代培养得到的p5代牙髓间充质干细胞加入上述混合液中，细胞密度为5
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105个/ml，分装在2ml的保存管中，每管1.5ml，在6℃条件下保存。
32.对比例1
33.对比例1提供一种牙髓间充质干细胞保存用添加剂，和实施例1的区别为：省去金丝皇菊蛋白多肽，其余均和实施例1相同。
34.对比例2
35.对比例2提供一种牙髓间充质干细胞保存用添加剂，和实施例1的区别为：省去谷朊粉，其余均和实施例1相同。
36.对比例3
37.对比例3提供一种牙髓间充质干细胞保存用添加剂，和实施例1的区别为：省去金丝皇菊蛋白多肽，将谷朊粉的用量调整为8.2份，其余均和实施例1相同。
38.对比例4
39.对比例4提供一种牙髓间充质干细胞保存用添加剂，和实施例1的区别为：省去谷朊粉，将金丝皇菊蛋白多肽的用量调整为8.2份，其余均和实施例1相同。
40.对比例5
41.对比例5提供一种牙髓间充质干细胞保存用添加剂，和实施例1的区别为：省去金丝皇菊蛋白多肽、谷朊粉，其余均和实施例1相同。
42.分别在保存0h、24h、48h、72h取样，采用0.2％台盼蓝染色细胞，然后用血细胞计数器统计活细胞和死细胞的数量，计算细胞存活率，结果如图1所示。
43.由图1可以看出，实施例1至实施例3，对比例1至对比例5中的牙髓间充质干细胞随着保存时间的延长，细胞的存活率均呈下降趋势。其中对比例1至对比例5中的牙髓间充质干细胞存活率下降趋势更为明显。实施例1至实施例3中的细胞在保存72h后存活率仍在90％以上。对比例1至对比例5中调整了添加剂的原料组成，牙髓间充质干细胞的存活率不及实施例1。如实施例1中省去了金丝皇菊蛋白多肽，实施例2中省去了谷朊粉，细胞的存活率均不及实施例1。对比例3和对比例4中在省去金丝皇菊蛋白多肽和谷朊粉后增加了剩余成分的用量，细胞的存活率也均不及实施例1，并且和对比例1、对比例2相比也有一定程度的下降。对比例5中同时省去了金丝皇菊蛋白多肽和谷朊粉，牙髓间充质干细胞的存活率最低，不能满足临床上对牙髓间充质干细胞活性的要求。
44.取实施例1，对比例1至5保存72h的牙髓间充质干细胞，在37℃水浴中迅速复苏，离心去除保存液，加入pbs清洗两次，加入培养基(α-mem，10％fbs)重悬，调整细胞密度为1
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104个/ml，接种于12孔板中，在37℃，5％co2的培养箱中培养，观察统计各组牙髓间充质干细胞的贴壁时间，结果如图2所示。
45.由图2可以看出：实施例1中保存的牙髓间充质干细胞贴壁时间最短，说明实施例1中的牙髓间充质干细胞活性最好，对比例1至对比例5中调整了添加剂的组成，贴壁时间均长于实施例1，说明对比例1至5中牙髓间充质干细胞活性均有不同程度的下降。
46.综上可知，本发明的添加剂实现了牙髓间充质干细胞在2-6℃条件下的保存，并且经保存后的牙髓间充质干细胞存活率高，牙髓间充质干细胞仍具有较好的活性，保证临床的应用效果。无需超低温环境，为临床保存提供了极大便利。
47.上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。