一种脂肪间充质干细胞冻存保护液及冻存方法与流程

1.本发明涉及一种细胞冻存保护液，尤其涉及一种脂肪间充质干细胞冻存保护液及冻存方法。


背景技术：

2.间充质干细胞存在于骨髓、脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等多种组织中。研究发现，间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，有显著临床应用优势。
3.肪间充质干细胞是指来源于脂肪组织的一类间充质干细胞，具有自我更新和多向分化的能力，其能够向骨，软骨，脂肪，肌肉，神经，内皮等方向分化。同时，脂肪间充质干细胞来源广泛，脂肪组织可通过脂肪抽吸术或外科手术容易获取，对供者创伤较小且不涉及伦理问题，免疫原性低，且可以在体外条件下大量扩增，现已是组织工程领域最受欢迎的干细胞之一。
4.由于要得到大量的肪间充质干细胞往往需要较长的培养周期，并且细胞移植的供体与受体通常存在异地的可能性，很难保证细胞的及时使用，而充足的脂肪间充质干细胞数量是决定是否能达到临床疗效的重要因素之一。要实现随时为临床和基础研究提供足量脂肪间充质干细胞，需要对细胞在液氮中进行冻存。细胞冻存是指即使细胞暂时脱离生长状态而将细胞长时间保存起来，并维持细胞原有的生物学特性，在需要时经过快速复苏可正常使用。
5.在冻存过程中为了减少对细胞造成的损伤，通常会添加保护液，目前常用的有二甲基亚砜，二甲基亚砜是一种有毒试剂，与蛋白质的疏水基团发生作用，可导致蛋白质变性，存在一定的安全隐患，因此有必要提供一种安全稳定的保护液用于脂肪间充质干细胞的冻存。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种脂肪间充质干细胞冻存保护液，不添加dmso，成分安全稳定。
7.本发明的目的之二在于提供一种脂肪间充质干细胞的冻存方法。
8.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
9.一种脂肪间充质干细胞冻存保护液，包括基础培养基和添加在培养基中的以下成分：甘油、普鲁卡因微囊、香柑内酯、白藜芦醇、维生素c、胰岛素；各成分在培养基中的终浓度为：甘油20-30μg/ml、普鲁卡因微囊1-5ng/ml、香柑内酯3-8ng/ml、白藜芦醇5-10μg/ml、维生素c1-2mg/ml、胰岛素0.5-1mg/ml。
10.进一步地，各成分在培养基中的终浓度为：甘油25μg/ml、普鲁卡因微囊3ng/ml、香柑内酯5ng/ml、白藜芦醇8μg/ml、维生素c1.5mg/ml、胰岛素0.7mg/ml。
11.进一步地，所述基础培养基为dmem/f12。
12.进一步地，所述普鲁卡因微囊的制备方法如下：取壁材溶解于无水乙醇中，壁材的质量浓度为1-2％，加入芯材普鲁卡因粉末，混合均匀后经喷雾干燥得到普鲁卡因微囊。
13.进一步地，所述壁材为羧甲基纤维素钠，所述羧甲基纤维素钠和普鲁卡因粉末的质量比为1:0.2-0.3。
14.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
15.一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，采用上述保护液冻存。
16.进一步地，所述脂肪间充质干细胞的冻存方法包括以下过程：将待保存的脂肪间充质干细胞采用保护液重悬，程序降温至-80℃，在-80℃保存4-6h，然后转移至液氮中冻存。
17.进一步地，保护液中脂肪间充质干细胞的密度为10
6-107个/ml。
18.相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供脂肪间充质干细胞冻存保护液，保护液中添加普鲁卡因微囊、香柑内酯、白藜芦醇等成分，减少细胞经冻存后的损伤，提高细胞的存活率，经冻存后的脂肪间充质干细胞仍具有较好的增殖活性，保存液中各成分安全稳定，有助于脂肪间充质干细胞的长期保存。
19.本发明还提供一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，提高了脂肪间充质干细胞的保存效率，充分保证了脂肪间充质干细胞在各个领域的应用。
附图说明
20.图1为本发明实施例1，对比例1至对比例4中冻存3个月的脂肪间充质干细胞的增殖曲线。
具体实施方式
21.下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
22.实施例1
23.一种脂肪间充质干细胞冻存保护液，由dmem/f12培养基和添加在培养基中的以下成分组成：甘油、普鲁卡因微囊、香柑内酯、白藜芦醇、维生素c、胰岛素；各成分在培养基中的终浓度为：甘油25μg/ml、普鲁卡因微囊3ng/ml、香柑内酯5ng/ml、白藜芦醇8μg/ml、维生素c1.5mg/ml、胰岛素0.7mg/ml。
24.上述普鲁卡因微囊的制备方法如下：取壁材羧甲基纤维素钠溶解于无水乙醇中，壁材的质量浓度为1％，加入芯材普鲁卡因粉末，羧甲基纤维素钠和普鲁卡因粉末的质量比为1:0.2，混合均匀后经喷雾干燥得到普鲁卡因微囊。
25.实施例2
26.一种脂肪间充质干细胞冻存保护液，由dmem/f12培养基和添加在培养基中的以下成分组成：甘油、普鲁卡因微囊、香柑内酯、白藜芦醇、维生素c、胰岛素；各成分在培养基中的终浓度为：甘油20μg/ml、普鲁卡因微囊1ng/ml、香柑内酯3ng/ml、白藜芦醇5μg/ml、维生素c1mg/ml、胰岛素0.5mg/ml。
27.上述普鲁卡因微囊的制备方法如下：取壁材羧甲基纤维素钠溶解于无水乙醇中，
壁材的质量浓度为2％，加入芯材普鲁卡因粉末，羧甲基纤维素钠和普鲁卡因粉末的质量比为1:0.3，混合均匀后经喷雾干燥得到普鲁卡因微囊。
28.实施例3
29.一种脂肪间充质干细胞冻存保护液，由dmem/f12培养基和添加在培养基中的以下成分组成：甘油、普鲁卡因微囊、香柑内酯、白藜芦醇、维生素c、胰岛素；各成分在培养基中的终浓度为：甘油30μg/ml、普鲁卡因微囊5ng/ml、香柑内酯8ng/ml、白藜芦醇10μg/ml、维生素c 2mg/ml、胰岛素1mg/ml。
30.上述普鲁卡因微囊的制备方法如下：取壁材羧甲基纤维素钠溶解于无水乙醇中，壁材的质量浓度为1.5％，加入芯材普鲁卡因粉末，羧甲基纤维素钠和普鲁卡因粉末的质量比为1:0.25，混合均匀后经喷雾干燥得到普鲁卡因微囊。
31.对比例1
32.对比例1提供一种脂肪间充质干细胞冻存保护液，和实施例1的区别为：省去普鲁卡因微囊，其余均和实施例1相同。
33.对比例2
34.对比例2提供一种脂肪间充质干细胞冻存保护液，和实施例1的区别为：将普鲁卡因微囊调整为普鲁卡因粉末，其余均和实施例1相同。
35.对比例3
36.对比例3提供一种脂肪间充质干细胞冻存保护液，和实施例1的区别为：省去香柑内酯，其余均和实施例1相同。
37.对比例4
38.对比例4提供一种脂肪间充质干细胞冻存保护液，和实施例1的区别为：省去普鲁卡因微囊、香柑内酯，其余均和实施例1相同。
39.取脂肪样本加入pbs清洗两次，离心后收集脂肪组织分装在50ml离心管中，加入等体积的1％ⅱ型胶原酶震荡消化30min，在1200rpm离心10min，取底层的细胞沉淀加入培养基(dmem/f12 10％fbs)重悬，调整细胞密度为5
×
104个/ml，在t75培养瓶中进行培养，培养条件为37℃，5％co2的培养箱中，培养至细胞融合度达到80％后进行传代培养，取处于对数生长期的p3代细胞做冻存实验。
40.取上述培养实验得到的p3代脂肪间充质干细胞分别用实施例1，对比例1至4的保护液重悬，细胞密度为106个/ml，分装在2ml冻存管中，程序降温至-80℃，程序降温过程为：以4℃/min降温至-80℃，在-80℃保存4h，然后转移至液氮中冻存。
41.取上述培养实验得到的p3代脂肪间充质干细胞用实施例2的保护液重悬，细胞密度为5
×
106个/ml，分装在2ml冻存管中，程序降温至-80℃，程序降温过程为：以4℃/min降温至-80℃，在-80℃保存5h，然后转移至液氮中冻存。
42.取上述培养实验得到的p3代脂肪间充质干细胞用实施例3的保护液重悬，细胞密度为107个/ml，分装在2ml冻存管中，程序降温至-80℃，程序降温过程为：以4℃/min降温至-80℃，在-80℃保存6h，然后转移至液氮中冻存。
43.分别在上述细胞冻存前和冻存3个月后取样检测细胞的存活率，检测方法如下：将冻存管在37℃的水浴中温育解冻，加入等体积的dmem/f12培养基稀释后离心，弃去上清，加入dmem/f12培养基重悬，调整细胞密度为1
×
104个/ml。然后取10μl混合液和10μl台盼蓝混
合，采用全自动细胞计数仪countess进行细胞计数，统计细胞存活率。细胞存活率＝活细胞数量/总的细胞数量
×
100％。结果如表1所示。
44.表1
[0045][0046]
由表1可以看出实施例1至3中的脂肪间充质干细胞在冻存3个月后细胞存活率较高。对比例1至4中调整了保护液的成分，脂肪间充质干细胞的存活率和实施例1相比均有不同程度的下降。说明本发明的保存液能有效提高细胞冻存后的存活率，减少冻存造成的细胞损伤。
[0047]
取上述冻存3个月的p3代细胞加入pbs洗涤，离心后再分别加入培养基(dmem/f12 10％fbs)吹打成细胞悬液，调整细胞密度为1
×
104个/ml，分别接种于12孔板中，置于37℃、5％co2的培养箱中进行培养，在培养过程中每天各取3孔用台盼兰染色进行细胞计数，取平均值后绘制细胞增殖曲线，结果如图1所示。
[0048]
由图1可以看出实施例1中复苏得到的细胞增殖速度较快，在培养7天后收集的细胞数量最多，对比例1至对比例4中细胞的增殖速度和实施例1比均有不同程度的下降，对比例1至4中调整了保护液的成分。说明采用本发明的保护液冻存后的脂肪间充质干细胞增殖活性较好。
[0049]
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。