一种血浆中MMAE的液质联用检测方法与流程

一种血浆中mmae的液质联用检测方法
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种药物的测定方法，特别涉及一种血浆中mmae的液质联用检测方法。


背景技术：

2.一甲基澳瑞他汀e mmae)是(微管相关抑制剂)是合成的抗肿瘤剂。其化学名称(s)-2-(((3r,4s,5s)-1-((s)-2-((1r,2r)-3-(((1s,2r)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-n-(甲基-l-缬氨酰基)丁酰胺，分子式：c
39h67
n5o7，分子量：717.98，其化学结构式为：
[0003][0004]
mmae是海兔毒素10的合成衍生物，通过抑制微管蛋白聚合而起到有效的有丝分裂抑制作用其本身毒性很大，无法作为药物使用，但是它与单克隆抗体相连，后者将其导向癌细胞。因此，mmae广泛用作细胞毒性成分制作抗体药物偶联物(adcs)以治疗癌症。抗体偶联药物是指将具有高度靶向性的单克隆抗体，通过特定的一段连接片段，实现同具有细胞毒性抗肿瘤药物的偶联，从而将抗体的高度选择性与药物的抗肿瘤活性合二为一。目前市面上使用mmae作为毒性小分子药物的adc药物主要有2011年获批的针对cd30的adcetris(seattle)；2019年获批的针对cd77β的polivy(罗氏)；2019年获批的针对nectin-4的padcev(seattle)；2021年获批的针对her2的维迪西妥单抗(荣昌生物)；2021年获批的针对tf的tivdak(genmab/seagen)。在全球上市的14款adc药物中，就有5款药物使用mmae作为抗肿瘤毒性小分子药物，并且截至2022年全球有上百种在研的adc药物，很大部分选择mmae作为毒性小分子药物，足以体现mmae在肿瘤治疗领域的突出地位。由于adc药物具有靶向性，是肿瘤治疗中关键治疗手段，据不完全统计2021年，adc药物全球销售额约50亿美元，使用mmae作为毒性小分子药物的adc药物全球销售额超过16亿美元，展现出极大的经济和社会效应。
[0005]
mmae本身具有很强的毒性，在抗肿瘤治疗时，其对人体正常细胞也具有很强的杀
伤作用，由于adc药物本身在研发过程中也具有很强技术限制，对于游离的mmae的药物检测，不管是新药研发阶段还是药品上市后，药物临床监测阶段都具有极其重要的作用。
[0006]
由于adc药物的靶向性，通过细胞内吞进入细胞内，其游离的浓度极低，对于检测游离mmae的方法要求较高，因此需要建立一个具有快速、准确、可靠，同时具有高灵敏度、高选择性的方法。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是提供一种血浆中mmae的液质联用检测方法，解决上述现有技术问题中的一个或者多个。
[0008]
本发明提供的一种血浆中mmae的液质联用检测方法，包括以下步骤：
[0009]
s1、血浆样品预处理：将待测样品采用一步蛋白质沉淀法提取，以便得到待测提取液；
[0010]
s2、将所述待测提取液进行液质联用检测，以便确定所述待测样品中的mmae的浓度；
[0011]
其中：确定采用液质联用检测分析的参数条件，色谱条件包括：
[0012]
色谱柱：agilent hilic plus，3.5μm，柱规格为2.1*100mm；
[0013]
色谱柱温：40℃；
[0014]
流动相a：h2o/fa/1m hcoonh4＝100/0.1/1(v/v/v)；流动相b：乙腈；
[0015]
洗液：乙腈/水＝80/20(v/v)；
[0016]
自动进样器温度为4℃；
[0017]
梯度洗脱，流速为0.6ml/min，进样量为10μl，分析时间为4.2min；
[0018]
质谱条件：采用电喷雾离子源，以及采用多重反应检测的扫描方式。
[0019]
其中：选用血浆作为待测物具有如下优点，血浆是临床试验最常用的临床样品，易获得，且能准确地反映药物在体内的情况。
[0020]
在某些实施方案中，步骤s1具体包括以下步骤：
[0021]
以k2edta为抗凝剂，配制样品后取50μl于96深孔板中，加入450μl的乙腈涡旋混合2min，于4℃以2600g离心10min.，取上层清液300μl至96深孔板中，再精密加入10μl 1m甲酸铵，涡旋混合2min，作为测试样品待检测。
[0022]
在某些实施方案中，步骤s2中梯度洗脱的程序为：
[0023]
总时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0.2010901.8035652.2035652.2110904.201090
[0024]
其中：梯度洗脱可以使所述方法具有极高的灵敏度和分离度。
[0025]
在某些实施方案中，步骤s2中质谱测定条件为：
[0026]
离子源采用电喷雾离子源，喷雾电压为5500v，雾化温度为500℃，喷雾气压力为50psi，辅助加热气压力为50psi，气帘气压力为25psi，碰撞气压力为8psi，去簇电压分别为
30ev的mmae；
[0027]
碰撞室入口电压分别为10ev的mmae；
[0028]
碰撞电压分别为40ev的mmae；
[0029]
碰撞室出口电压分别为10ev的mmae；
[0030]
正离子方式检测；
[0031]
扫描方式为多重反应检测。
[0032]
在某些实施方案中，步骤s2中质谱测定条件为：
[0033]
mmae用于定量分析的离子对为：m/z718.5
→
m/z686.5；
[0034]
定性离子对m/z718.5
→
m/z506.4。
[0035]
其中：选择该离子对进行定量，具有高专属性和高灵敏度。
[0036]
在某些实施方案中，步骤s2中试样测定步骤为：
[0037]
取10μl测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中mmae的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中的mmae浓度。
[0038]
在某些实施方案中，步骤2中以mmae的峰面积带入标准曲线方程计算所述血浆样品中的mmae的浓度。
[0039]
在某些实施方案中，所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：
[0040]
分别取10μl标准样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中mmae的色谱峰，并据此得到标准曲线，以用于计算所述血浆中的mmae的浓度。
[0041]
在某些实施方案中，标准样品的制备方法包括以下步骤：
[0042]
取190μl空白血浆8份置于1.5ml离心管中，以储备液的形式添加10μl浓度分别为0.200ng/ml、0.400ng/ml、1.60ng/ml、4.00ng/ml、12.0ng/ml、40.0ng/ml、160ng/ml、200ng/ml的mmae溶液至标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、标样8中，分别取标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、标样8、零浓度样本50μl于96深孔板中，加入450μl的乙腈涡旋混合2min，于4℃以2600g离心10min.，取上层清液300μl至96深孔板中，再精密加入10μl 1m甲酸铵，涡旋混合2min，作为测试样品待检测。
[0043]
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0044]
(1)预处理方法简便，一步有机溶剂沉淀法，适用于常规测定；
[0045]
(2)专属性强：在本实验所采用的色谱条件下，mmae保留时间为1.999min左右。mmae的峰型良好，无杂峰干扰测定，基线平稳；
[0046]
(3)灵敏度高：血浆最低定量限为0.010ng/ml，能准确测定血浆中mmae的浓度，灵敏度高，特异性强；
[0047]
(4)本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为mmae的血药浓度测定提供依据。本方法的血浆标准曲线线性范围为0.010-10.0ng/ml，批内和批间精密度rsd小于
±
15％。
附图说明
[0048]
图1是hplc-ms/ms法测得的mmae在人血浆中的标准曲线；
[0049]
图2是人空白血浆的hplc-ms/ms图；
[0050]
图3是人空白血浆加入mmae的hplc-ms/ms图。
具体实施方式
[0051]
下面通过实施方式对本发明进行进一步详细的说明。
[0052]
实施例1实验材料与分析设备
[0053]
mmae(分析物)：zz standards或相同、更高等级的标准品
[0054]
使用试剂见下表1：
[0055]
表1试剂明细
[0056]
试剂名称级别制造商乙腈hplcfisher甲酸铵hplcfisher甲酸lc/ms阿拉丁dmso分析纯fisher
[0057]
注：亦可使用相同级别或更高级别的试剂
[0058]
使用分析设备见下表2：
[0059]
表2使用设备明细
[0060]
组件种类制造商binary pump(二元泵)ad pumpshimadzudegasser(脱气器)degassershimadzucolumn oven(恒温柱箱)ad column ovenshimadzuautosampler(自动取样器)ac autosamplershimadzusample rack(样本架)rack changershimadzumass spectrometer(质谱仪)triple quad 6500 sciexdata processor(数据处理器)analyst(software)sciex
[0061]
相同的lc-ms/ms系统亦可被使用。
[0062]
实施例2液质检测条件
[0063]
1、液相色谱条件
[0064]
色谱柱：agilent hilic plus，3.5μm，柱规格为2.1*100mm；色谱柱温：40℃；流动相a：h2o/fa/1m hcoonh4＝100/0.1/1(体积比)；流动相b：乙腈；洗液：乙腈/水的体积比为80/20；自动进样器温度为4℃；梯度洗脱，流速为0.6ml/min，进样量为10μl，分析时间为4.2min；
[0065]
表3梯度洗脱程序
[0066][0067][0068]
2、质谱条件
[0069]
离子源采用电喷雾离子源，喷雾电压为5500v，雾化温度为500℃，喷雾气压力为
50psi，辅助加热气压力为50psi，气帘气压力为25psi，碰撞气压力为8psi，去簇电压分别为30ev的mmae；碰撞室入口电压分别为10ev的mmae；碰撞电压分别为40ev的mmae；碰撞室出口电压分别为10ev的mmae；正离子方式检测；扫描方式为多重反应检测；
[0070]
mmae用于定量分析的离子对为：m/z718.5
→
m/z686.5；定性离子对m/z718.5
→
m/z506.4。
[0071]
实施例3试验过程
[0072]
1、mmae标准溶液的配制
[0073]
mmae标准溶液的配制：精密称取mmae(分析物)2.000mg，加入dmso溶解至1.00mg/ml，50％乙腈水溶液溶依次稀释配制mmae标准溶液，具体稀释浓度见下表4：
[0074]
表4mmae标准溶液配制浓度
[0075]
来源溶液(ng/ml)来源溶液体积(μl)溶剂体积(μl)最终浓度(ng/ml)100000010499020002000200180020020001601840160200040196040.0160150185012.01605019504.0040.08019201.6040.02019800.4004.0010019000.200
[0076]
mmae标准溶液于不使用时储存于棕色玻璃容器及冰箱(-20℃)保存，体积可视需要依比例增加或减少。
[0077]
2、线性试验
[0078]
将空白血浆于室温环境放入水浴解冻；转移190μl的空白血浆10份至96深孔板中(每一个标准曲线样本、空白样本-00及零浓度样本-0)，依下表5所列，分别精密加入不同浓度的mmae标准溶液10μl或稀释溶液配制每一个样本并混匀，配成不同浓度的含药血浆，按“血浆样品预处理”操作。以峰面积值y对血药浓度x作回归计算，结果见图1和表6。以y对血药浓度x做回归计算，得回归方程y＝691000x-770,相关系数(r)为0.9996，拟合度(r2)为0.99920016。权重系数w＝1/x2，按该方法测得的mmae的血药浓度的最低定量限为：0.010ng/ml。
[0079]
表5mmae标准曲线配制浓度
[0080][0081]
a：分析物的稀释溶液：50％乙腈水溶液
[0082]
表6hplc-ms/ms法测得的mmae在人血浆中的标准曲线(n＝5)
[0083][0084][0085]
3、准确度和精密度
[0086]
将空白血浆于室温环境放入水浴解冻；转移适当体积的空白血浆至适当的容器并添加mmae标准溶液制备5种不同浓度的含药血浆质控样品(lloq qc、lqc、gmqc、mqc、hqc)及一条随行标准曲线，按“血浆样品预处理”操作，质控样品制备如下表7所示。每天做一批及一条随行标准曲线，连续做5天，共5批，第一批、第二批、第三批、第四批和第五批每个浓度
分别做6份样品，计算mmae峰面积，代入当天的标准曲线中求得实测浓度，由实测浓度计算批内于批间精密度，实测浓度与理论浓度的比值即为准确度，结果见表8。mmae血浆样品批间、批内精密度、准确度在
±
15％之间符合要求。
[0087]
表7质控样品配制浓度
[0088][0089]
依每一分析批所需，分装足够的体积至已标示的样本瓶瓶中并储存于理论温度-20℃。体积可视需要依比例增加或减少。
[0090]
表8hplc-ms/ms法测定血浆中mmae的批内、批间精度和准确度
[0091]
[0092]
[0093]
[0094][0095]
4、干扰性
[0096]
将6个不同来源的空白血浆样品，3个不同来源的高脂血浆和3个不同来源的溶血血浆用于同一分析批依样本制备步骤制备及分析，来评价不同空白血浆对mmae分析物的干扰。
[0097]
12个不同来源空白血浆样本制备分析后，在符合mmae保留时间处的干扰峰响应均低于该分析批的标准曲线中定量下限样本的mmae响应的20.0％，结果见表9。结果表明该分析方法对mmae的分析具有专属性。
[0098]
表9 12个不同来源空白血浆对mmae分析物的干扰性数据对比表
[0099][0100]
从表9中可以看出，不同人体的空白血浆对mmae的检测结果没有造成干扰。因此，该方法可以用于检测不同人体血浆中的mmae浓度。
[0101]
5、回收率
[0102]
将使用混合血浆配制的lqc、mqc和hqc来计算分析物的回收率。对于lqc、mqc和hqc
的各6个平行样品和18个db进行提取。db提取后加入分析物，使它们在提取后加入的db提取物中的浓度与提取的lqc、mqc和hqc样品相同。通过比较来自于qc的分析物和内标的峰面积与db提取后加入的分析物和内标的平均峰面积来计算提取回收率，结果见表10，在分析物的每个浓度水平，分析物峰面积的％cv和总体％cv均在
±
15.0％之间，回收率为101.1％，表明使用该前处理方法mmae的提取回收率高。
[0103]
表10mmae分析物的提取回收率
[0104][0105]
6、基质效应
[0106]
处理来自至少6个不同来源的空白基质样品。在提取db后加入分析物，确保它们在处理后db中的浓度(每个浓度每个来源1个样品)与处理后的lqc、mqc和hqc样品浓度相同；准备包含分析物的溶液，使最终浓度与处理后的lqc、mqc和hqc样品浓度相同，每个浓度6个平行，结果见表11，分析物峰面积比％cv均在
±
15％之间，表明不存在基质效应问题。
[0107]
表11mmae分析物的基质效应
[0108]
[0109][0110]
综上所述：本发明提供了一种预处理方法简便的血浆中mmae浓度的测定方法，采用一步有机溶剂沉淀法，适用于常规测定；同时，在本实验所采用的色谱条件下，mmae保留时间为1.999min左右，峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳；本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中mmae的浓度，灵敏度较高，血浆最低定量限为0.0100ng/ml；同时，本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为mmae的血药浓度测定提供依据。本方法的血浆标准曲线线性范围0.0100～10.0ng/ml，批内和批间精密度rsd在
±
15％之间，分析物提取回收率高且不存在基质效应。
[0111]
以上表述仅为本发明的优选方式，应当指出，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些也应视为发明的保护范围之内。