一种测定透明质酸钠含量的方法

1.本发明属于多糖类分析检测领域，涉及一种测定透明质酸钠含量的方法。


背景技术：

2.透明质酸(hyaluronic acid，ha)，又名玻璃酸、玻尿酸，是一种以d-葡萄糖醛酸和n-乙酰氨基葡萄糖胺为双糖单位交替连接而成的直链线性阴离子粘多糖。ha最早是由美国科学家从牛眼玻璃体中分离得到，因其具有良好的润滑性、保湿性和黏弹性，并具有极佳的生物相容性而广泛应用于化妆品、食品和医药行业中。由于透明质酸本身溶解性较差，在使用时常将其转化为钠盐，即透明质酸钠（sodium hyaluronate，简称sh）。sh是一种白色粉末状固体，有时也呈纤维状，具有较好的保湿性，能溶于水，不溶于乙醚、丙酮和乙醇等有机溶剂，无臭味，是一种链状的天然高分子多糖类物质，目前已被广泛应用于多个领域，因此建立其准确定量分析方法具有重要意义。
3.目前，测定透明质酸钠含量的方法有：硫酸-咔唑法、ctab浊度法、凝胶色谱法、elson-morgan法、免疫法、共振瑞利散射法等。硫酸-咔唑法是用强酸将透明质酸钠降解成葡糖醛酸，葡糖醛酸与咔唑反应形成有机络合物并显示特有的紫色，其吸光度和糖醛酸的浓度成正比，通过葡萄糖醛酸的含量来确定透明质酸钠的含量。但该方法在用于检测配方较为复杂的样品时，样品中一些结构复杂的防腐剂、乳化剂、稳定剂等也可能与硫酸咔唑试剂反应，结果偏差大，因此专属性不强。ctab浊度法测定发酵液中透明质酸钠的含量是利用ha可同十六烷基三甲基溴化铵（ctab）等阳离子表面活性剂发生络合反应，产生混浊现象，并在一定浓度范围内遵循朗伯-比尔定律，但该方法的缺点是不适合实时检测。利用凝胶色谱法测定透明质酸钠含量，该方法操作复杂，分析速度慢，价格昂贵，对人员操作水平要求高。此外，调查发现，目前常用的sh含量测定方法主要是通过降解后显色，结合可见-紫外分光光度计，根据吸光度测定其中葡萄糖醛酸或者氨基葡萄糖的含量，进而推算sh的含量。这种方法操作比较复杂，条件苛刻，显色剂的引入干扰测定的准确度。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种测定透明质酸钠含量的方法。
5.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种测定透明质酸钠含量的方法，将待检测透明质酸钠样品在酸性条件下进行水解，检测水解产物的含量，进而转化计算得出透明质酸钠的含量。
6.透明质酸钠结构式
所述透明质酸钠在酸性条件下水解形成盐，将水解后的盐进行高效液相色谱测定，得其含量，利用其转化计算得出透明质酸钠的含量。
7.所述高效液相色谱法采用透明质酸钠在酸性条件下水解形成盐为标准品，加去离子水溶解，配制浓度分别为0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml、2.0 mg/ml、2.5 mg/ml、3.0 mg/ml的一系列标准溶液，hplc色谱条件进样检测，而后以透明质酸钠在酸性条件下水解形成盐浓度对数值为横坐标，对应的峰面积积分对数值为纵坐标，绘制标准曲线。
8.所述水解液试样的测定：取制备的待测水解液试样溶液适量，过0.45μm有机滤膜，hplc色谱条件进样检测，由标准曲线计算得到透明质酸钠在酸性条件下水解形成盐的浓度，并经公式（1）转化计算得到透明质酸钠的含量；(1)公式（1）中，w ——透明质酸钠含量，%；m——透明质酸钠粉末固体质量，g；c ——由标准曲线获得的透明质酸钠在酸性条件下水解形成盐的浓度，mg/ml；v ——酸水解待测溶液体积，ml；mr1——透明质酸钠在酸性条件下水解形成盐的摩尔质量，g/mol；mr2——透明质酸钠单元的摩尔质量，g/mol。
9.所述酸为浓盐酸，取透明质酸钠固体粉末，加入浓盐酸和去离子水，升温至20-55℃反应0.5-3.0h，反应后升温至55-85℃反应0.5-3.0h，而后再升温至85-120℃反应2-16h；反应去除剩余盐酸，加去离子水溶解、定容，得透明质酸钠水解待测试样溶液；其中，透明质酸钠固体粉末的加入量与加入的浓盐酸和去离子水的用量比值为10:4:1~80:9:2（mg: ml: ml）。所述浓盐酸为浓度为12 mol/ml的盐酸。
10.所述水解所用酸除盐酸外，还可使用硫酸或磷酸。
11.所述梯度升温酸降解得水解成盐产率最高的优选反应条件为50 ℃时反应1.5 h，升温至80 ℃反应1.5 h，而后再升温至100 ℃反应10 h。
12.所述高效液相色谱条件为：采用syneronis amino糖分析色谱柱，检测器为蒸发光散射检测器，流动相为乙腈-水溶液（60:40，v/v），流速为0.1-1.5 ml/min，进样量为10-80 μl，柱温为20-60 ℃；所述蒸发光散射检测器的载气流速为0.5-3.0 l/min，漂移管温度为30-100 ℃。
13.与现有技术相比，本发明有益效果在于：1. 本发明测定方法先将透明质酸钠进行酸水解，得到水解溶液，而后对水解溶液中的氨基葡萄糖盐酸盐进行hplc检测，准确定量，进而通过氨基葡萄糖盐酸盐的含量，转化计算得到透明质酸钠的含量，避免了透明质酸钠分子量不同对含量测定的影响，简便易行，操作简单，适用性强。
14.2. 本发明采用增发光散射检测器，为通用型检测器，避免了常用紫外检测器存在的不足，即待测物质在没有紫外吸收或紫外吸收较弱的情况下也可被测定，因此透明质酸钠的酸水解产物可直接进样hplc进行检测，无需先引入显色剂进行柱前修饰，避免了杂质
的引入，简化操作步骤，节省实验材料，降低实验成本。
15.3. 本发明方法通过测定酸水解溶液中氨基葡萄糖盐酸盐的含量来转化计算得到透明质酸钠的含量，代替目前市面上常用的测定降解产物乙醛酸进行定量透明质酸钠的方法；并对酸水解液中的氨基葡萄糖盐酸盐直接测定，未经任何生化柱前修饰，未引入干扰成分，使测定得到的透明质酸钠含量更接近于实际含量，测定结果更加准确，为透明质酸钠含量测定提供了新的思路和方法，具有较好的应用前景和较高的实际意义。
16.4. 本发明采用高效液相色谱法测定壳聚糖含量，并采用蒸发光散射检测器，hplc具有专属性较强、灵敏度高、检出限低、准确性好、快速高效、分离效果明显等优势，具有较好的应用前景；elsd检测器属于通用型质量检测器，抗环境干扰性强，对流速、温度无苛刻要求，可进行梯度洗脱，对紫外吸收弱或无紫外吸收的糖类物质有较好的分析效果，在高效液相色谱上具有广泛的应用。
附图说明
17.图1为透明质酸钠酸水解方程式；图2为实施例1所得的氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线；图3为实施例1所得的氨基葡萄糖盐酸盐标准品hplc色谱图；图4为实施例1所得的透明质酸钠酸水解试样溶液hplc色谱图。
具体实施方式
18.以下实施实例是对本发明的进一步说明，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
19.本发明把透明质酸钠水解成单糖，再根据氨基葡萄糖盐酸盐单糖的含量计算得到透明质酸钠的含量，未引入其他干扰成分，使测定结果更加准确。另外，该测定方法采用了蒸发光散射检测器
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高效液相色谱法，不仅准确性好、灵敏度高、检出限低、分离效果明显，可以排除透明质酸钠分子量差异带来的干扰，而且克服了透明质酸钠本身不具有发光基团，紫外吸收弱，不易被检测的困难，是现代应用较为广泛的一种检测方法，可为实现透明质酸相关产品的质量控制提供参考依据，对于推动透明质酸产业发展具有重要的理论和现实意义。
20.实施例1一种酸水解联合高效液相色谱测定透明质酸钠含量的方法：hplc色谱条件：采用syneronis amino糖分析色谱柱，流动相为乙腈-水溶液（85:15，v/v），进样量为50μl，流速为1.2 ml/min，柱温为35℃，检测器为蒸发光散射检测器，载气流速为2.0l/min，漂移管温度为70℃。
21.标准曲线的绘制：精密称取氨基葡萄糖盐酸盐标准品0.25 g，加去离子水溶解并转移至25 ml容量瓶中，清洗转移三次，定容，摇匀，配制成浓度为10 mg/ml的标准品储备液，备用。分别取储备液适量，稀释配制成浓度为0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml、2.0 mg/ml、2.5 mg/ml、3.0 mg/ml、3.5 mg/ml的一系列标准溶液。分别取上述不同浓度的标准溶液适量，过0.22 μm有机滤膜，按照既定hplc色谱条件进样检测（参见图3），以氨基葡萄糖盐酸盐浓度的对数值x为横坐标，对应的峰面积积分值的对数值y为纵坐标绘制标准曲线，
得标准曲线的线性方程为y=1.043x 4.002，相关系数r2为0.9999。所得氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线如图2所示。从图中可以看出，当氨基葡萄糖盐酸盐在0.5~3.5 mg/ml浓度范围内时，标准曲线呈现较好的相关性。
22.水解液样品制备：取透明质酸钠固体粉末55 mg，加入7 ml浓盐酸、2 ml去离子水，在40 ℃条件下水解2.5 h，75 ℃条件下水解2.5 h，95℃条件下水解12 h，反应结束后，减压浓缩去除剩余盐酸，用25 ml容量瓶加去离子水配制，定容，得到透明质酸钠酸水解试样溶液（水解方程式参见图1）。
23.而后，取透明质酸钠酸水解试样溶液适量，过0.22 μm有机滤膜，按照上述记载条件通过hplc色谱条件进样检测（参见图4），即得酸水解成盐的峰面积；而后依据线性方程y=1.043x 4.002可得氨基葡萄糖盐酸盐的浓度为0.624 mg/ml，而后再按照公式（1）计算，c=0.624 mg/ml，v=25 ml，mr1=215.63 mg/mol，mr2=403 mg/mol， m= 58.2 g即可准确得到透明质酸钠的含量99.8%。
24.实施例2取透明质酸钠固体粉末70 mg，加入10 ml浓盐酸、3 ml去离子水，在35 ℃条件下水解3.5 h，70 ℃条件下水解3.5 h，110℃条件下水解9 h，反应结束后，减压浓缩去除剩余盐酸，用50 ml容量瓶加去离子水配制，定容，得到透明质酸钠酸水解试样溶液。而后，取透明质酸钠酸水解试样溶液适量，过0.22 μm有机滤膜，按照实施例1记载既定hplc色谱条件进样检测，即得酸水解成盐的峰面积；而后依据线性方程可得氨基葡萄糖盐酸盐的浓度为0.397 mg/ml，而后再按照公式（1）计算，即可准确得到透明质酸钠的含量99.6%。
25.实施例3对本发明高效液相方法进行了方法学验证，开展了稳定性实验。取氨基葡萄糖盐酸盐标准样品溶液（1.5 mg/ml）适量，过0.22 μm有机滤膜，分别在0、2、8、12、24 h进样检测，观察峰面积变化，rsd为1.68%。稳定性实验表明，在4℃保存条件下，氨基葡萄糖盐酸盐样品溶液24 h之内稳定性良好。结果如表1所示。
26.表1 稳定性实验结果实施例4
对本发明高效液相方法进行了方法学验证，开展了重现性实验。取氨基葡萄糖盐酸盐55 mg，5份，配制氨基葡萄糖盐酸盐水溶液，hplc进样，测定氨基葡萄糖盐酸盐的峰面积，利用外标法计算其浓度，计算出rsd为1.35%，表明该方法具有良好的重现性，结果如表2所示。
27.表2 重现性实验结果实施例5对本发明高效液相方法进行了方法学验证，开展了精密度实验。取氨基葡萄糖盐酸盐标准样品溶液（1.5 mg/ml）适量，过0.22 μm有机滤膜，hplc进样，重复5次，测定氨基葡萄糖盐酸盐峰面积积分值，外标法测定氨基葡萄糖盐酸盐的浓度，rsd为0.98%，表明仪器的精密度和进样方法良好。结果如表3所示。
28.表3 精密度实验结果综上所述，本发明通过测定透明质酸钠双糖单位之一的n-乙酰氨基葡萄糖胺的含量来得到透明质酸钠的含量，具体是采用酸水解透明质酸钠，得到水解成盐产物，然后结合高效液相色谱技术测定得到水解产物积分峰面积，进而通过计算得到透明质酸钠的含量，准确度高，操作简单，成本较低，实用性强，具有很高的实际意义和经济意义。