用于涂覆和干燥异源干细胞衍生的细胞外囊泡的方法与流程

1.本发明涉及一种涂覆和保存从异源(heterogenous)供体的干细胞获得的细胞外囊泡(ev)的方法，促进药品生产与运输，使之随时可用。
2.产品的异源性(heterogenicity)主要是指从不同的来源/供体(人类、动物、鸟类、卵类、原代胚胎细胞)获得的ev，而不仅仅是细胞外溶液中天然存在的不同类型/大小的细胞或囊泡。异种(xenogenous)是指在另一种物种/属的接受者上使用异源产品。


背景技术：

3.细胞外囊泡(ev)包含从干细胞中自然释放的所有脂质双层界定的颗粒，包括在各种过程中参与细胞间通讯、免疫调节、衰老、增殖和分化的外泌体和微囊泡(nassar,2014extracellular vesicles(evs)；basic science,clinical relevance and applications)。
4.衍生自干细胞的ev具有很强的再生能力，因为它含有干细胞分泌的主要有益的细胞因子和生长因子(katsuda and ochiya,2015molecular signatures of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicle-mediated tissue repair)。
5.研究表明，ev与受损的组织上的原始细胞具有相同的再生作用。
6.ev有助于克服细胞治疗的问题，如：肿瘤形成和由于接受者的身体的不希望的免疫反应引起的排斥(sabin,k；kikyo,n 2014:microvesicles as mediators of tissue regeneration)。
7.它尚未在相同物种的不同个体之间或不同的物种和属之间进行测试(fuster等,2015:acellular approaches for regenerative medicine:on the verge of clinical trials with extracellular membrane vesicles？)。
8.此外，本发明的实验研究表明，包括对内源性干/祖细胞产生积极刺激在内，还具有抗凋亡、抗纤维化和血管生成活性，从而产生了再生环境。


技术实现要素：

9.技术问题
10.没有即时、即用型产品。
11.目前，ev从一种个体制备并且用于相同个体。
12.从相同个体制备新制剂需要3-6周，并且需要可以使用特殊的实验室工具。
13.新鲜产品不能在标准室温下保存，并且不能保存超过7天而维持存活(viable)。
14.先前的制剂仅以液体形式存在。
15.先前的制剂应用仅限于通过注射施用。
16.解决问题的技术方案
17.本发明可以随时立即使用。
18.性质(异源/异种)：从个体中提取并保存高等级ev，并且将它们用于相同或不同的
物种/属的另一个个体。
19.节省制备的时间。
20.保质期长，在室温和自然条件下保存。
21.所述制剂能够以各种形式制造。
22.所述制剂能够通过各种途径施用。
23.本发明的有益效果
24.易于收集和制备产品，节省时间和精力。
25.能够在许多天然和合成载体上安全承载。
26.控制硬度/粘度的程度的可能性。
27.本发明具有鉴定的蛋白质含量并且能够以不同浓度和所有可能的药物形式生产。
28.所述产品能够在正常室温下保存，并且比新鲜制备的产品保存时间更长。
29.施用根据药物形式和治疗的靶位点的不同而改变。
30.立即干预避免了在进行性疾病治疗中至关重要的培养和处理的延迟。
31.ev与原始细胞实施相同的工作，尽管被脱水，但是与新鲜制备的一样有效。
32.刺激/加速软/硬组织的愈合，例如，治疗皮肤问题/伤口、心脏问题、肌肉骨骼退行性疾病、肝肾退行性疾病、免疫刺激/调节和组织移植。
33.ev与原始细胞实施相同的工作，尽管被脱水，但是与新鲜制备的一样有效。
34.能够用于体内和体外研究，用于评估如细胞信号传导、蛋白质组学、细胞增殖等生物学实验。
35.不产生免疫反应。
具体实施方式
36.本发明涉及(compromise)一种制备和保存干细胞衍生ev的方法，以获得生长因子和细胞因子的即用型高等级浓缩物，以促进软/硬组织的愈合，并且能够用于不同的药物形状/形式，保质期长。并且详述如下：
37.产品从供体(人/动物)制备，并且用于另一个接受者(人/动物)而没有任何免疫反应。它能够在不同的物种和属之间使用，并且不像先前的制剂那样受到限制。
38.ev被加载到不同细胞相容性质的涂覆材料上。
39.将加载有囊泡的涂覆材料暴露于干燥过程以从其中提取水颗粒并将其转化为固体/粉末。
40.在室温下保存而不会损坏/减少囊泡的有效性。
41.最终产品能够根据所需的使用方法(例如，不限于：通过不同途径注射的流体，或以片剂、丸剂、糖浆等形式口服)进行制备/成型。以及作为滴剂、软膏或凝胶局部使用，或包含在其它化合物中，如外用敷料。
42.可以在没有免疫反应的情况下使用它，这保证了用于人类和动物的商业数量的生产。
43.此外，囊泡的涂覆和干燥有助于：(a)在干燥过程中保护囊泡，(b)给予囊泡一定程度的粘性，该粘性使得囊泡在治疗伤口或根据使用目的稀释时能够保持在一起并与组织结合，(c)当复原干燥的材料时，它立即恢复到原来的形状，而粘性的程度没有显著改变，(d)
涂覆确保了外层细胞囊泡被保存而没有改变它们的治疗有效性，(e)易于将本发明制成适于待治疗部位的不同药物形式(液体/粉末/片剂
……
)，(f)干燥使其易于生产、运输和治疗和商业应用。
44.实验室实验：
45.对表皮伤口的复原的ev的动物研究(i)证明：(a)增加伤口愈合的速度。(b)愈合的组织具有较好的质量(纤维组织较少)，无疤痕。(c)与商业化的皮肤愈合产品相比，它在愈合时间和质量方面具有优异的治愈能力。(d)组合物的体外分析表明，干燥的ev的物理或生物学性质没有显著改变。
46.用于评估干细胞衍生的ev在狗模型中修复诱导的软骨缺损中的效果的动物研究(ii)表明，ev的施用对受伤的软骨的功能和形态恢复有效，并且可以被利用作为再生医疗中的无细胞治疗方法，以实现在3个月内恢复软骨的组织形态学图像，并且在组织病理学评估方面具有成熟的胶原纤维，这与对照关节相反，对照关节随着时间的推移显示出劣化与缺陷填充，只有纤维组织形成纤维软骨。
47.副作用：本发明没有已知的副作用。
48.利用的方法(a)加载有ev的干燥产品用蒸馏水或类似溶剂复溶(reconstitute)。(b)产品立即恢复到其原始形式，而没有任何显著改变和所需的流动性/粘性。(c)本发明能够以片剂/胶囊或类似的口服形式或用于待治疗部位的形式(软膏/注射剂/口腔/
……
)制备和包装。
49.有效性：
50.ev与原始细胞实施相同的工作，尽管被脱水，但是与新鲜制备的一样有效。
51.刺激/加速软/硬组织的愈合，例如，治疗皮肤问题/伤口、心脏问题、肌肉骨骼退行性疾病、肝肾退行性疾病、免疫刺激/调节和组织移植。
52.能够用于体内和体外研究，用于评估如细胞信号传导、蛋白质组学、细胞增殖等生物学实验。
53.不产生免疫反应。
54.预期的结果：
55.与干细胞移植相比，本发明具有类似的愈合质量。
56.与传统药物相比，本发明能够用于实现更快和更好的软组织/骨骼的愈合质量。
57.没有副作用，如细胞毒性、感染、免疫反应或免疫排斥。