抑制HIF-1α和STAT5转录因子的合成诱骗寡核苷酸及含有它的药物组合物

抑制hif-1
α
和stat5转录因子的合成诱骗寡核苷酸及含有它的药物组合物
技术领域
1.本发明涉及抑制hif-1α和stat5转录因子的合成诱骗寡核苷酸及含有它作为有效成分的特应性皮炎的预防或治疗用药物组合物。


背景技术：

2.特应性皮炎(atopic dermatitis：ad)作为慢性复发性湿疹疾病，特征为炎性皮炎、瘙痒症和严重的皮肤干燥症。
3.特应性皮炎的发病原因被推断为免疫系统的异常、遗传因素、皮肤屏障功能的丧失、环境因素等各种因素复杂地相互作用而产生，但并未明确查清。
4.已知特应性皮炎由于原发性免疫异常而引起对特定抗原的ige致敏(sensitization)，从而使血液中的ige升高，并且激活2型辅助性t细胞(th2 cell)、嗜酸性粒细胞、树突状细胞等。特别是，ige与存在于肥大细胞表面的高亲和力ige受体(fcεr
°
)错综相连而使肥大细胞活化。被活化的肥大细胞分泌包括组胺、趋化因子和细胞因子等在内的免疫介质等，这样的细胞因子促进th2-亚型t细胞反应，诱导痒症和炎症反应，从而使特应性皮炎发病。而且，肥大细胞脱颗粒后不消亡而再形成颗粒，从而可以重新被活化，因此在暴露于外来抗原时，可以在组织内持续提供刺激。随着肥大细胞的早期介导反应，发生酸性白细胞、碱性白细胞和淋巴细胞的流入，后期阶段的反应诱导组织的慢性炎症。因此，调节肥大细胞的消亡和活化被认为是治疗特应性皮炎的重要策略。
5.作为特应性皮炎的治疗剂，使用有外用皮质类固醇、抗组胺剂、免疫抑制剂等。但是，已知上述治疗剂的效果是暂时缓解症状，如果长期使用则效果下降且显示出副作用。特别是，外用类固醇制剂在长期使用时，可以引起皮肤萎缩、血管扩张、色素脱失和膨胀纹的发生等各种副作用。因此，要求开发用于特应性皮炎的治疗和预防的新的治疗剂。
6.在特应性皮炎中，诱导肥大细胞的生存和活化的蛋白质中的代表是hif-1α和stat5。就hif-1α而言，报道了抑制作为在特应性皮炎等炎症性疾病中诱导肥大细胞消亡的蛋白质的pparγ的研究结果，已知stat5蛋白质参与炎症反应，是一种通过诱导bcl2家族蛋白质的表达而典型参与肥大细胞的生长、生存和活化的转录因子。
7.基因治疗法是指通过将基因表达调节物质传递到患者的细胞、组织来调节特定基因的表达，从而治疗和预防疾病的技术。诱骗寡核苷酸(诱骗寡脱氧核苷酸(decoy oligodeoxynucleotide)，decoy odn)作为包含目标转录因子(transcription factor)结合而成的碱基序列的合成基因治疗剂，是一种通过抑制转录因子的作用而有效地抑制疾病相关基因的表达的工具。即，通过转录因子的dna结合位点与诱骗寡核苷酸结合，从而转录因子无法与目标基因的启动子结合，转录因子的活性受阻，从而特定基因的表达减少。
8.在韩国公开专利第2016-0089000号中，公开了同时抑制dna和rna的新型合成寡脱氧核苷酸及含有它作为有效成分的纤维化疾病预防和治疗用药物组合物，在韩国公开专利第101869308号中，公开了srebp-1诱骗寡脱氧核苷酸及含有它作为有效成分的脂肪肝疾病
预防或治疗用药物组合物，但没有公开本发明的抑制hif-1α和stat5转录因子的合成诱骗寡核苷酸及含有它作为有效成分的特应性皮炎预防或治疗用药物组合物。
9.现有技术文献
10.专利文献
11.(专利文献0001)韩国公开公报第10-1869308号(2018.06.14)


技术实现要素：

12.根据一具体例，提供一种诱骗寡核苷酸，其通过抑制作为转录因子的hif-1α和stat5，从而治疗特应性皮炎。
13.根据一具体例，提供一种包含诱骗寡核苷酸的特应性皮炎治疗剂，上述诱骗寡核苷酸通过抑制hif-1α和stat5，从而治疗特应性皮炎。
14.在一个方式中，提供由seq id no:1的碱基序列组成的hif-1α诱骗寡核苷酸。
15.上述seq id no:1中的8至12号碱基cacgt和23至27号碱基acgtg构成互补结合结构，与hif-1α结合，从而可以抑制它。(参考图1)
16.上述seq id no:1中的16至19号碱基aaaa可以形成环(loop)。
17.上述寡核苷酸的骨架可以为脱氧核糖、核糖或它们的变形体，但不特别限定。
18.在另一方式中，提供由seq id no:2的碱基序列组成的stat5诱骗寡核苷酸。
19.上述seq id no:2中的7至15号碱基ttcccggaa和24至32号碱基ttccgggaa构成互补结合结构，与stat5结合，从而可以抑制它。
20.上述seq id no:2中的18至21号碱基aaaa可以形成环。
21.在另一方式中，提供由seq id no:1的碱基序列组成的hif-1α诱骗寡核苷酸和由seq id no:2的碱基序列组成的stat5诱骗寡核苷酸连接而成的hif-1α/stat5诱骗寡核苷酸。
22.上述连接可以是通过连接酶(ligase)而连接(ligation)的。
23.上述hif-1α/stat5诱骗寡核苷酸可以包含2个环结构。
24.上述hif-1α/stat5诱骗寡核苷酸可以包含1个茎结构，在上述茎结构中，可以包含可以与hif-1α的dna结合位点结合的位点和可以与stat5的dna结合位点结合的位点。
25.上述hif-1α/stat5诱骗寡核苷酸可以通过将由seq id no:1的碱基序列组成的hif-1α诱骗寡核苷酸和由seq id no:2的碱基序列组成的stat5诱骗寡核苷酸进行变性(denature)和退火，使之连接(ligation)而制造。
26.在另一方式中，提供包含选自上述hif-1α诱骗寡核苷酸、stat5诱骗寡核苷酸、以及hif-1α/stat5诱骗寡核苷酸中的一种以上的诱骗寡核苷酸的特应性皮炎预防或治疗用组合物。
27.上述特应性皮炎预防或治疗用组合物可以为药物组合物。在上述组合物中，可以还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。此外，可以根据通常的方法以散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浊液、乳液、糖浆、气溶胶等口服制剂；外用剂；栓剂和灭菌注射液的形态剂型化而使用，但并不限定于此。可以包含在组合物中的载体、赋形剂和稀释剂例如可以为乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲
酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。在剂型化时，可以使用通常使用的填充剂、增量剂、结合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂进行制造。在用于口服给药的固体剂型中，可以包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这样的固体剂型可以通过在上述提取物中混合至少一种以上的赋形剂，例如淀粉、碳酸钙(calcium carbonate)、蔗糖(sucrose)或乳糖(lactose)、明胶等而制造。此外，除了简单的赋形剂以外，还可以使用硬脂酸镁、滑石等润滑剂。作为用于口服的液体剂型，可以为悬浮剂、内用液剂、乳剂、糖浆剂形态，除了经常使用的作为简单稀释剂的水、液体石蜡以外，可以包含各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。在用于非口服给药的剂型中，可以包括无菌水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂、栓剂。作为非水性溶剂、悬浮剂，可以使用丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、橄榄油等植物性油、油酸乙酯等可注射的酯等。作为栓剂的基质，可以使用维特普索尔(witepsol)、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可脂、月桂酸酯甘油明胶等。合适的药学上可接受的载体和剂型详细记载于雷明顿药物科学(remington'spharmaceutical sciences,19th ed.,1995)。
28.上述组合物的合适的给药量可以根据剂型化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、疾病状态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度和反应灵敏性等因素进行各种变更。包含在上述组合物中的有效成分的浓度可以考虑治疗目的、患者的状态、所需时间等来确定，不限定于特定范围的浓度。
29.发明效果
30.根据一具体例的诱骗寡核苷酸抑制hif-1α和/或stat5的表达，因此可以用于特应性皮炎的治疗。
附图说明
31.图1表示hif-1α/stat5诱骗odn的制作过程。
32.图2是确认在特应性皮炎动物模型中hif-1α/stat5诱骗odn对hif-1α和stat5表达的抑制效果的结果。
33.图3是确认在特应性皮炎动物模型中hif-1α/stat5诱骗odn对皮肤组织损伤、表皮和真皮的厚度增加、以及炎症细胞浸润的抑制效果的结果。
34.图4是确认在特应性皮炎动物模型中hif-1α/stat5诱骗odn对皮肤组织肥大细胞数和脱颗粒化增加的抑制效果的结果。
35.图5是通过免疫化学染色确认在特应性皮炎动物模型中hif-1α/stat5诱骗odn对皮肤组织内tnf-α表达的抑制效果的结果。
36.图6是通过蛋白质印迹确认在特应性皮炎动物模型中hif-1α/stat5诱骗odn对皮肤组织内tnf-α和il-1β表达抑制效果的结果。
37.图7是通过免疫化学染色确认在特应性皮炎动物模型中hif-1α/stat5诱骗odn对类胰蛋白酶(tryptase)表达的抑制效果的结果。
38.图8是通过蛋白质印迹确认在特应性皮炎动物模型中hif-1α/stat5诱骗odn对类胰蛋白酶(tryptase)表达的抑制效果的结果。
39.图9是确认在特应性皮炎动物模型中hif-1α/stat5诱骗odn对丝聚蛋白表达的恢复效果的结果。
具体实施方式
40.下面，通过实施例对一个以上的具体例更详细地进行说明。但是，这些实施例用于例示性地说明一个以上的具体例，本发明的范围不限定于这些实施例。
41.实施例1：hif-1α/stat5诱骗odn的制作
42.hif-1α/stat5诱骗寡核苷酸(寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide)，odn)和scr(序列打乱(scramble))odn的碱基序列如下述表1所示。scr odn作为没有任何效果的odn，被用作对照组。
43.[表1]
[0044]
seq id名称序列(5
’‑
》3’)1hif-1αodnaattcgtcacgtatgaaaacatacgtgacg2stat5 odnaattctttcccggaaacaaaagtttccgggaaag3scr odngaattccaggtacggcaaaaaattgccgtacctg
[0045]
hif-1αodn和stat5 odn各自构成茎环结构。使它们在95℃进行3分钟的变性后，一边将温度从80℃降低到25℃，一边进行退火(annealing)。经退火的hif-1α/stat5 odn加入t4连接酶(t4 ligase)，进行16至18小时的连接(ligation)，从而制作了球形的hif-1α/stat5诱骗odn。(参考图1)
[0046]
实施例2：利用dncb和屋尘螨提取物(dfe)诱导的特应性皮炎动物模型的制作
[0047]
为了制作特应性皮炎动物模型，购买体重20～25g的雌性balb/c小鼠并稳定约7天。稳定期间过后，去除小鼠们耳朵下部到尾巴上部的毛发，放置24小时使皮肤的微型创口自然愈合。然后，将200ul的1％dncb(2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene))溶液(丙酮:橄榄油＝3:1)涂覆于去毛部位，从而诱导了皮肤致敏。从初次dncb涂覆日经过1周后，反复进行4次每周再涂覆200ul的1％dncb，4天后涂覆200ul的dfe(dermatophagoides farinae extrate，屋尘螨提取物)的过程，从而诱发了特应性皮炎。在涂覆dfe期间，按照1周的间隔将scr odn、hif-1α诱骗odn、stat5诱骗odn、以及hif-1α/stat5诱骗odn分别以10μg的程度通过小鼠的尾静脉进行注入。(每一只都是将10μg的诱骗odn混合于600ul的transit溶液并通过尾静脉注射进行给药)
[0048]
实施例3：hif-1α/stat5诱骗odn的hif-1α和stat5表达抑制效果
[0049]
将scr odn、hif-1α诱骗odn、stat5诱骗odn、以及hif-1α/stat5诱骗odn分别注入到实施例2的特应性皮炎动物模型中。摘取动物模型的皮肤组织并实施蛋白印迹(western blot)，从而确认了目标蛋白质表达。
[0050]
根据图2，在将dncb dfe和scr进行给药的组中，与正常对照组(normal control(nc))相比，hif-1α和stat5的表达增加。(scr odn为没有任何效果的odn，因此可知由于将dncb和dfe进行给药，hif-1α和stat5的表达增加)在对将dncb和dfe进行给药的组注入hif-1α诱骗odn、stat5诱骗odn、或hif-1α/stat5诱骗odn时，它们的表达减少。特别是，可以确认将hif-1α/stat5诱骗odn进行给药的实验组与将hif-1α诱骗odn或stat5诱骗odn进行给药的实验组相比，hif-1α和stat5各自的表达进一步被抑制并存在协同效应。
[0051]
实施例4：hif-1α/stat5诱骗odn对由特应性皮炎导致的皮肤组织损伤和炎症细胞浸润的抑制效果
[0052]
摘取根据上述实施例2的特应性皮炎动物模型的皮肤并制作成石蜡切片，将其用
h&e染色，从而观察皮肤组织的变化和炎症细胞浸润。
[0053]
如图3所示，在涂覆dncb和dfe且注入scr odn的动物的皮肤组织中，皮肤组织损伤、表皮(epidermis)和真皮(dermis)的厚度、以及炎症细胞的浸润程度与正常对照组(normal control(nc))相比，显著增加。(在图3的a中，dncb dfe由d表示)
[0054]
相反，在涂覆dncb和dfe且注入hif-1α诱骗odn、stat5诱骗odn、或hif-1α/stat5诱骗odn的动物中，皮肤组织损伤、表皮和真皮的厚度、以及炎症细胞的浸润被抑制。特别是，hif-1α/stat5诱骗odn的效果最优异。
[0055]
实施例5：hif-1α/stat5诱骗odn在特应性皮炎动物模型的皮肤组织中对肥大细胞的浸润和脱颗粒化的抑制效果
[0056]
将从根据上述实施例2的特应性皮炎动物模型中摘取的皮肤制作成石蜡切片后，实施吉萨姆(giemsa)染色，从而观察皮肤组织内肥大细胞的浸润、增殖和脱颗粒化程度。
[0057]
如图4所示，在涂覆dncb和dfe并注入了scr odn的动物的皮肤中，肥大细胞的数量和脱颗粒化程度与nc组相比增加。(在图4的a中，dncb dfe由d表示)
[0058]
但是，在注入了hif-1α诱骗odn、stat5诱骗odn、或hif-1α/stat5诱骗odn的动物中，肥大细胞的数量和脱颗粒化的增加被抑制。特别是，可以确认在涂覆dncb和dfe并注入hif-1α/stat5诱骗odn的动物的皮肤组织中，肥大细胞的数量和脱颗粒化的增加显著被抑制。
[0059]
为了确认hif-1α/stat5诱骗odn是否可以抑制因特应性皮炎的发展导致的血清ige增加，用根据实施例2的特应性皮炎动物模型的血清实施elisa(酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay)，酶联免疫特异性试验(enzyme-linked immunospecific assay))，从而确认了ige的表达量。其结果，与nc组相比，涂覆dncb和dfe的组、以及涂覆dncb和dfe并注入scr odn的组的血液ige的数值增加。但是，注入hif-1α/stat5诱骗odn的实验组的血液ige数值明显减少。
[0060]
实施例6：在特应性皮炎动物模型中hif-1α/stat5诱骗odn对炎症相关因子的抑制效果
[0061]
基于上述实施例4的结果，观察了特应性皮炎动物模型的炎症相关因子的表达变化。将从实施例2的特应性皮炎动物模型中摘取的皮肤制作成石蜡切片后，进行免疫化学染色，从而确认了皮肤组织内的tnf-α的表达。
[0062]
根据图5，在涂覆dncb和dfe且注入scr odn的情况下，tnf-α的表达显著增加，但在涂覆dncb和dfe且注入hif-1α/stat5诱骗odn的组中，tnf-α的表达显著减少。
[0063]
另外，用从实施例2的特应性皮炎动物模型中摘取的皮肤组织实施蛋白印迹(western blot)，从而确认了作为炎症相关因子的tnf-α和il-1β的蛋白质表达。
[0064]
根据图6，由于涂覆dncb和dfe，tnf-α和il-1β的表达显著增加，但在hif-1α/stat5诱骗odn处理组中其表达显著减少。
[0065]
实施例7.在特应性皮炎动物模型中本发明的hif-1α/stat5诱骗odn导致的肥大细胞相关因子的表达变化
[0066]
在根据上述实施例2的特应性皮炎动物模型中观察了作为肥大细胞的脱颗粒化物质中的一种的类胰蛋白酶(tryptase)的表达。为了确认类胰蛋白酶(tryptase)的皮肤组织内的表达，实施了免疫化学染色，通过实施蛋白印迹(western blot)，对类胰蛋白酶
(tryptase)的蛋白质表达进行了确认。
[0067]
根据图7和图8，可以确认由于dncb和dfe，类胰蛋白酶(tryptase)的组织内表达和蛋白质表达显著增加，在注入hif-1α/stat5诱骗odn时，类胰蛋白酶(tryptase)的表达显著减少。
[0068]
实施例8.在特应性皮炎动物模型中本发明的hif-1α/stat5诱骗odn导致的皮肤屏障相关因子的表达变化
[0069]
在根据上述实施例2的特应性皮炎动物模型中观察了作为皮肤屏障的主要因子的丝聚蛋白(filaggrin)的表达。为了确认皮肤组织中丝聚蛋白(filaggrin)的表达，将从特应性皮炎动物模型中摘取的皮肤制作成石蜡切片后，实施了免疫荧光染色。
[0070]
根据图9，在涂覆dncb和dfe且注入scr odn的动物的皮肤组织中，由于丝聚蛋白(filaggrin)的表达而显示的绿色荧光显著减少。但是，在注入hif-1α/stat5诱骗odn的实验组中，由于丝聚蛋白(filaggrin)的表达而显示的绿色荧光恢复了与nc类似的水平。