改进的含有盐水的硅藻土组合物的制作方法

改进的含有盐水的硅藻土组合物
1.本发明涉及一种含有盐水的硅藻土组合物。另一方面，本发明涉及一种制造根据本发明所述的硅藻土组合物的方法。另一方面，本发明涉及根据本发明所述的硅藻土组合物在生物制药应用中作为用于预涂层过滤(precoat filtration)或动态体进料过滤(dynamic body feed filtration)的试剂的用途。
2.在生物制药过程中，产生诸如抗体的产物的细胞通常在发酵罐中繁殖。在发酵过程结束时，必须将细胞以及细胞碎片从产物中分离出来，以获得含有所需产物的澄清上清液。
3.通常，为了实现这种分离，进行离心并随后进行除菌过滤。然而，除菌过滤经常导致滤器在一定时间后堵塞，这使得发酵罐的处理不可避免地使用多个滤器。预先未离心的除菌过滤将立即导致滤器堵塞，从而甚至使过滤无法进行。包括离心和除菌过滤在内的整个分离工序需要相当长的时间，并与复杂的工作步骤相连，因此提高了成本。
4.可以避开离心步骤和滤器堵塞的一种方式是使用硅藻土(de)进行预涂层过滤。为此目的，将一定量的硅藻土添加到细胞培养液中，然后过滤。在此预涂层过滤期间，硅藻土在除菌滤器上形成粗孔滤饼，细胞和细胞碎片被结合在其中，因此能够不再贡献于滤器的堵塞。或者，可以应用动态体进料过滤。
5.简而言之，硅藻土是一种天然存在的软质硅质沉积岩，由也被称为金藻的硅藻这种硬壳原生生物的化石残骸组成。从化学角度来看，硅藻土主要由无定形二氧化硅组成，但也含有相当量的结晶二氧化硅。取决于其天然矿床及其进一步加工例如煅烧，硅藻土可能含有高达15质量％的方石英和1质量％的石英。
6.对于在实验室使用硅藻土来说，例如通过漏斗的开放式剂量是优选的，因为必须应对各种不同的发酵罐形状和通常为多个的样品。在工业规模上，可以使用专门开发的封装解决方案，其使得能够实现几乎无粉尘的连通性。
7.在实验室使用硅藻土产生的一个主要问题是粉尘粒子的释放量极高，尤其是在使用具有粉末形态的干燥材料时更是如此。结果，呈纯形式的硅藻土不适合在配有通风柜的安全工作台之外工作。特别地，由于存在相当量的具有很强可吸入性的结晶二氧化硅(就方石英和石英而言)，因此吸入从硅藻土释放的粉尘粒子对肺部有害，引起矽肺。此外，结晶二氧化硅也被认为是人类致癌物。与此相反，无定形二氧化硅被认为具有低毒性。然而，其长时间吸入可能导致肺部的改变。除了上述对健康问题的考虑之外，粉尘的产生还导致与工作环境中的总体卫生要求有关的其他问题。
8.通过使用粘合剂形成硅藻土颗粒的尝试并没有显著减少粉尘粒子的释放，因为这种颗粒也通过摩擦产生粉尘粒子，其然后在以开放的方式处理时释放出来。此外，这种方法的缺点还在于粘合剂本身被引入到样品溶液中，从而污染样品并可能干扰其后续分析。
9.用水润湿硅藻土减少了粉尘粒子的释放。此外，它使得能够进行开放式处理，并且不会向水性样品添加任何新物质。取决于硅藻土与水的质量比，得到了从疏松到结实形状的产品。然而，这些产品通常难以处理，因为它们不再自由流动，特别是当质量比约为1:3以下时更是如此。此外，向硅藻土添加大量水导致样品被进一步不合需要地稀释。由额外输入
的水导致的另一个问题是促进微生物生长和与其相关的内毒素形成，导致样品污染。
10.就此而言，ep 3 473 336a1描述了当利用水的硅藻土润湿被优化时，得到的硅藻土组合物表现出特别低的粉尘粒子释放。例如，如图1中所示，与干燥的硅藻土相比，硅藻土与水的质量比在1:1至1:2的范围内的硅藻土组合物使得释放的粉尘粒子的数目减少超过80％。这种硅藻土组合物可以以开放的方式处理而没有显著的健康风险。
11.出人意料的是，将干燥的硅藻土与水混合不利地影响硅藻土的过滤性质。特别地，当在生物制药应用中使用硅藻土组合物作为用于预涂层过滤或动态体进料过滤的试剂时，用水将干燥的硅藻土润湿导致过滤性能劣化。不利的是，与干燥的硅藻土相比，处理特定过滤体积所需的过滤时间增加。
12.综上所述，本发明的技术问题是提供一种硅藻土组合物，所述硅藻土组合物应表现出显著减少的粉尘粒子释放，并且对硅藻土的过滤性质、特别是其过滤性能没有不利影响。
13.上述技术问题通过提供权利要求书中表征的实施方式得以解决。
14.具体来说，根据本发明，提供了一种硅藻土组合物，其包含煅烧硅藻土粒子、水和至少一种无机盐的团聚混合物，其中所述煅烧硅藻土粒子与水的质量比在1:1.0至1:2.0的范围内，并且其中所述至少一种无机盐的含量基于100质量份的水等于或大于0.25质量份。
15.正如本发明人所发现的，在用水润湿时，硅藻土的机械稳定性降低，并且在混合工序期间产生的剪切力改变了硅藻土粒子的表面特性。这种表面特性的改变可被视为过滤性能劣化的根源。令人吃惊的是，通过在将干燥硅藻土和水混合的过程中存在至少一种无机盐，能够克服这些问题。
16.特别地，由于存在基于100质量份的水为等于或大于0.25质量份含量的至少一种无机盐，根据本发明所述的硅藻土组合物当在生物制药应用中用作预涂层过滤用或动态体进料过滤用的试剂时，维持了与使用干燥硅藻土相当的优异过滤性能。同时，由于硅藻土与水的质量比被优化，根据本发明所述的硅藻土组合物与干燥硅藻土相比显示出减少的粉尘粒子释放，从而使得能够容易地进行处理并最小化吸入粉尘粒子的风险。
17.正如上文提到的，根据本发明所述的硅藻土组合物包含煅烧硅藻土粒子、水和至少一种无机盐的团聚混合物。
18.在本文中，使用的硅藻土粒子可以通过本领域中已知的任何方法煅烧。由于煅烧，所述硅藻土粒子不含水，产生了干燥的硅藻土。因此，由于所述煅烧硅藻土粒子并不添加额外量的水，可以精确地调节所述煅烧硅藻土粒子与水的质量比。
19.此外，所述煅烧硅藻土粒子优选地不含源自于它们的藻类来源的有机残留物。为此，所述硅藻土粒子在煅烧之前和/或之后可以经历广泛的(酸性)清洗程序。
20.优选地，用于上文定义的硅藻土组合物的水不含内毒素并且不含细菌，后者被认为是内毒素的来源。由此可以容易地确保所述硅藻土组合物中的低内毒素含量。因此，正如下文进一步更详细描述的，在本发明的特定实施方式中，上文定义的硅藻土组合物优选地具有等于或小于0.5eu/ml的内毒素含量。也正如下文进一步更详细描述的，不含内毒素并且不含细菌的水可以例如通过γ射线灭菌来获得。
21.在本技术中适用的任何地方，术语“不含”不被认为是按字面解释的，即它应该意味着“基本上不含”。因此，术语“不含”可以涵盖微量，只要它不会对本发明的有益效果产生
不利影响即可。
22.根据本发明，所述煅烧硅藻土粒子与水的质量比在1:1.0至1:2.0的范围内。因此，通过在所述至少一种无机盐存在下将所述煅烧硅藻土粒子与水以上述质量比混合而形成了团聚体，所述团聚体基于所述煅烧硅藻土粒子和水的总质量计含有量为33.3质量％至50.0质量％的煅烧硅藻土粒子，并含有量为50.0质量％至66.7质量％的水。此外并且正如上文提到的，所述团聚体含有基于100质量份的水为等于或大于0.25质量份的所述至少一种无机盐。
23.在上文定义的硅藻土组合物的优选实施方式中，所述煅烧硅藻土粒子与水的质量比在1:1.1至1:1.7的范围内。也就是说，在这个优选实施方式中，形成的团聚体基于所述煅烧硅藻土粒子和水的总质量计含有量为37.0质量％至47.6质量％的煅烧硅藻土粒子，并含有量为52.4质量％至63.0质量％的水。在如上所定义的硅藻土组合物的更优选实施方式中，所述煅烧硅藻土粒子与水的质量比在1:1.2至1:1.4的范围内。也就是说，在这个更优选实施方式中，形成的团聚体基于所述煅烧硅藻土粒子和水的总质量计含有量为41.7质量％至45.5质量％的所述煅烧硅藻土粒子，并含有量为54.5质量％至58.3质量％的水。在所述煅烧硅藻土粒子与水的质量比落入如上所定义的范围内的情况下，根据本发明所述的包含煅烧硅藻土粒子、水和至少一种无机盐的呈团聚混合物形式的硅藻土组合物表现出特别低的粉尘粒子释放。
24.正如上文提到的，根据本发明，所述至少一种无机盐的含量基于100质量份的水等于或大于0.25质量份。当所述至少一种无机盐的含量满足上述下限时，所述硅藻土粒子的表面特性不显著改变，并且能够维持优异的过滤性能。
25.就此而言应该理解，含有基于100质量份的水为0.25质量份的所述至少一种无机盐意味着水性溶液中所述至少一种无机盐的含量为0.25/(100 0.25)质量％，即0.249质量％。正如本领域技术人员所认识到的，上述值可以容易地相互转换。为方便起见，在后文中转换成质量％的相应值被提供在括号中。
26.当所述至少一种无机盐不存在或其含量不充足，即低于上述0.25质量份(对应于0.249质量％)的下限时，所述硅藻土粒子的机械稳定性降低，导致过滤性能劣化。其原因在于在混合工序期间出现的剪切力，其改变了所述硅藻土粒子的表面特征。所述至少一种无机盐的含量基于100质量份的水优选地等于或大于0.5质量份(对应于0.498质量％)，更优选地等于或大于1质量份(对应于0.990质量％)，更优选地等于或大于1.5质量份(对应于1.478质量％)，但不限于此。
27.对于所述至少一种无机盐的含量的上限而言，本发明没有特别限制。只要所述至少一种无机盐在水中完全可溶，则所述至少一种无机盐的含量基于100质量份的水可以等于或小于100质量份(对应于50质量％)、等于或小于75质量份(对应于42.86质量％)、等于或小于50质量份(对应于33.33质量％)、等于或小于25质量份(对应于20质量％)、等于或小于20质量份(对应于16.67质量％)、等于或小于15质量份(对应于13.04质量％)或等于或小于10质量份(对应于9.09质量％)。所述至少一种无机盐的含量甚至可以使其对应于所述至少一种无机盐在例如25℃下在水中的饱和溶液。
28.然而，将所述至少一种无机盐的含量提高到基于100质量份的水为超过5质量份，对过滤性能没有进一步的显著影响，正如由过滤体积与过滤时间之间的关系所表示的。因
此，所述至少一种无机盐的含量基于100质量份的水优选地等于或小于5质量份(对应于4.76质量％)，更优选地等于或小于4质量份(对应于3.85质量％)，更优选地等于或小于3质量份(对应于2.91质量％)，甚至更优选地等于或小于2质量份(对应于1.96质量％)，但不限于此。
29.例如但非限制性的，所述至少一种无机盐的含量基于100质量份的水可以在0.25至5质量份、0.5至4质量份、1至3质量份或1.5至2质量份的范围内。
30.当将根据本发明所述的硅藻土组合物在过滤介质中、即在待过滤的样品中用作过滤助剂时，在与所述过滤介质接触后所述硅藻土组合物中存在的所述至少一种无机盐被强烈稀释，这意味着它基本上不影响其性能。在其中尤其不希望存在外部添加的盐的发酵和蛋白质溶液的过滤过程中，所述至少一种无机盐通常被稀释20倍。例如，当使用其中所述至少一种无机盐的含量基于100质量份的水为1.8质量份(对应于1.77质量％)的硅藻土组合物时，在最终得到的滤液中所述至少一种无机盐的含量基于2000质量份的水将仅为1.8质量份(对应于0.0899质量％)，这不太可能影响滤液的质量。
31.就所述至少一种无机盐本身而言，本发明没有特别限制，只要所述至少一种无机盐在水中足够可溶并且不显著改变其ph即可。在如上所定义的硅藻土组合物的优选实施方式中，所述至少一种无机盐选自碱金属卤化物例如碱金属氯化物、碱土金属卤化物例如碱土金属氯化物或其混合物。在碱金属卤化物中，氯化钠(nacl)和氯化钾(kcl)是特别适合的，但不限于此。在碱土金属卤化物中，氯化镁(mgcl2)和氯化钙(cacl2)是特别适合的，但不限于此。有利的是，钠、钾、镁和钙的氯化物在水中显示出优异的溶解性，并且在水溶液中是中性的。此外，它们是无毒的。根据需要，它们可以单独或组合使用。
32.除了碱金属卤化物和碱土金属卤化物之外，碱金属硫酸盐和碱土金属硫酸盐原则上也可以使用。
33.就所述煅烧硅藻土粒子的平均粒度而言，本发明没有特别限制。例如，所述平均粒度可以在0.1至800μm例如0.1至600μm、0.1至400μm、0.1至200μm或0.2至200μm的范围内，但不限于此。在上文定义的硅藻土组合物的特定实施方式中，所述煅烧硅藻土粒子的平均粒度在0.5至10μm的范围内。为了调节平均粒度，可以将煅烧后获得的硅藻土粒子使用本领域中已知的任何机械分离程序进行分级。在所述煅烧硅藻土粒子的平均粒度落入上文定义的范围内的情况下，可以获得其中所述煅烧硅藻土粒子可以充分自由流动的团聚混合物。在本文中，煅烧硅藻土粒子的平均粒度使用常规的粒度仪(mastersizer 2000,malvern instruments公司)通过激光衍射(精度：
±
1％)来测量。
34.在本发明的另一个特定实施方式中，如上所定义的硅藻土组合物还包含不透水且可γ射线灭菌的封装物，所述封装物密封所述煅烧硅藻土粒子、水和至少一种无机盐的团聚混合物，即所述封装物以密封方式包封所述团聚混合物，使得与环境的物质交换几乎不能发生。
35.由于所述封装物的不透水性，可以确保在上文定义的硅藻土组合物的储存期间所述煅烧硅藻土粒子与水的质量比得以维持，即使是在较长的时间段例如数月直至三年后也是如此。也就是说，所述硅藻土组合物在被封装时不容易变回易于释放粉尘粒子的干燥形式。有利的是，在上文定义的硅藻土组合物被封装的情况下，它可以容易地以不同的量储存和运输。在除去所述封装物后，可以以几乎无粉尘的方式给料所需的量。
36.此外，由于所述封装物是可γ射线灭菌的，即所述封装物本身及其内含物能够通过用γ射线辐照来灭菌，因此可以在所述硅藻土组合物中获得等于或小于0.5eu/ml的内毒素含量，正如下文进一步描述的。
37.从化学角度来看，内毒素是脂多糖。它们是革兰氏阴性细菌细胞壁的组分，已知在人类中例如当注射到血液中时引起发烧。如果免疫应答严重增强，则血液中内毒素的存在(也被称为内毒素血症)会导致脓毒性休克。不利的是，细菌内毒素是热稳定的，并且它们的毒性不依赖于细菌细胞的存在。
38.在本文中，硅藻土组合物的内毒素含量根据被简称为lal测试的鲎变形细胞裂解物测试来测量，所述测试是本领域中已知用于内毒素测试的最常用方法。简而言之，构成lal测试的基础的测定法是基于鲎的生物学特性，鲎在血细胞(变形细胞)中产生lal酶以结合并失活来自于入侵细菌的内毒素。具体来说，lal充当原始免疫系统。通过使内毒素失活形成凝块，其可以进一步保护鲎免受感染。通过将lal试剂添加到待测试的样品并测定凝块的形成，lal测试利用这种酶的作用。这可以通过光学手段来实现，因为凝块的形成使样品变得混浊。内毒素含量根据每体积的“内毒素单位”(eu)的浓度，例如以eu/ml为单位来表示，其大约相当于每毫升样品体积0.1至0.2ng内毒素。
39.正如专业技术人员所知，内毒素含量也可以使用基于重组因子c(rfc)的内毒素测试来测量，所述测试已被认可作为上述常规lal测试的替选方法，同时保护濒临灭绝的鲎。基于重组因子c的内毒素测试是内毒素特异性的，并且可以消除假阳性葡聚糖反应。具体来说，在基于重组因子c的内毒素测试中，合成形式的因子c与内毒素结合，从而激活凝血级联反应。典型的基于rfc的测定法是终点荧光测试，其中未结合的因子c切割产荧光底物，从而释放出可检测的荧光物质。
40.在本文中，根据本发明所述的硅藻土组合物的内毒素含量根据上述lal测试来测量。
41.根据本发明，如上所定义的硅藻土组合物的内毒素含量优选地等于或小于0.5eu/ml，更优选地等于或小于0.2eu/ml，更优选地等于或小于0.1eu/ml。通常，根据本发明，所述内毒素含量的下限没有特别限制。例如，所述下限可以对应于lal测试的检测下限，其约为0.01eu/ml。因此，具有0.01eu/ml的内毒素含量的样品可以被认为是不含内毒素的。
42.为了测量内毒素含量，将根据本发明所述的硅藻土组合物分散在1l水中。在这里，将要分散在1l水中的硅藻土组合物的量总是使得在最终得到的分散体中包含40g的煅烧硅藻土粒子。例如，在硅藻土组合物中所述煅烧硅藻土粒子与水的质量比为1:1.0的情况下，将80g硅藻土组合物分散在1l水中，并且在硅藻土组合物中所述煅烧硅藻土粒子与水的质量比为1:2.0的情况下，将120g硅藻土组合物分散在1l水中。在这两种示例性情况下，所述至少一种无机盐的质量尚未包括在内，即必须将它分别添加至80g和120g的质量。在任何情况下，使用上述lal测试测量的根据本发明的内毒素含量基于最终得到的分散体的体积计优选地等于或小于0.5eu/ml，更优选地等于或小于0.2eu/ml，更优选地等于或小于0.1eu/ml。这大致分别对应于基于煅烧硅藻土粒子的质量计优选地等于或小于12.5eu/g、更优选地等于或小于5eu/g、更优选地等于或小于2.5eu/g的内毒素含量。
43.在根据本发明所述的硅藻土组合物被封装的情况下，用于密封所述硅藻土组合物的封装物没有特别限制，可以是例如袋子或容器，只要它是不透水、特别是不透水蒸气并且
可γ射线灭菌的即可。通常，可以使用由不同的聚合物和金属层组成的层压物作为所述封装物的材料。
44.在如上所定义的硅藻土组合物的特定实施方式中，所述不透水且可γ射线灭菌的封装物由四层层压物组成，所述层压物从所述封装物的内侧到外侧，即从与所述煅烧硅藻土粒子、水和至少一种无机盐的团聚混合物的接触侧向周围环境包含下述层(i)至(iv)：
45.(i)聚乙烯(pe)或聚丙烯(pp)层，其厚度在30至150μm的范围内，优选地在50至120μm的范围内，例如75μm或100μm；
46.(ii)聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)或取向聚酰胺(oriented polyamide,opa)层，其厚度在5至20μm的范围内，优选地在8至15μm的范围内，例如12μm；
47.(iii)铝(alu)层，其厚度在5至20μm的范围内，优选地在8至15μm的范围内，例如12μm；和
48.(iv)聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)层，其厚度在5至20μm的范围内，优选地在8至15μm的范围内，例如12μm。
49.在上文定义的四层层压物中，所述封装物内侧上的pe或pp被用作可蒸煮的热密封层的材料。所述pe或pp层的厚度主要影响层压物机械强度、密封强度和刚度，对于确保紧密密封来说是至关重要的。中间的pet或opa层提供机械强度例如耐穿刺性和耐跌落性以及密封强度，从而保护与作为阻挡层的alu层的粘合。也就是说，铝主要用作阻隔氧气、光和水的阻挡材料。由于alu层的存在，如上所定义的四层层压物具有至多0.05g/m2·
天、例如至多0.03g/m2·
天或至多0.02g/m2·
天的透水率，因此在本发明的意义上可以被认为是不透水的。最后，外侧上的pet层充当保护层，提供刚度和拉伸强度，并根据需要充当所述封装物的印刷用耐密封(sealing-resistant)基材。通常，所述四个层(i)至(iv)的厚度可根据袋子尺寸、充填机器以及机械强度和刚度要求适合地设定。
50.在不透水方面优异、特别是在不透水蒸气方面优异的上文定义的四个层(i)至(iv)的典型组合包括pe(100μm)/pet(12μm)/alu(12μm)/pet(12μm)以及pe(75μm)/opa(12μm)/alu(12μm)/pet(12μm)，但不限于此。上述四层层压物可以被容易地暴露于γ辐照而不被损坏，因此使得能够进行密封所述煅烧硅藻土粒子、水和至少一种无机盐的团聚混合物的封装物的γ射线灭菌。
51.另一方面，本发明涉及一种使得能够制造上文定义的硅藻土组合物的方法。就此而言，上文为根据本发明所述的硅藻土组合物提供的所有限定和定义均同等地适用于根据本发明的制造所述硅藻土组合物的方法，反之亦然。
52.具体来说，根据本发明的制造硅藻土组合物的方法包括下述步骤(a)至(e)：
53.(a)提供至少一种无机盐的水溶液和煅烧硅藻土粒子，其中所述至少一种无机盐的含量基于100质量份的水等于或大于0.25质量份；
54.(b)将所述至少一种无机盐的水溶液与所述煅烧硅藻土粒子混合，其中所述煅烧硅藻土粒子与水的质量比在1:1.0至1:2.0的范围内，由此获得煅烧硅藻土粒子、水和至少一种无机盐的团聚混合物；
55.(c)任选地将在步骤(b)中获得的所述煅烧硅藻土粒子、水和至少一种无机盐的团聚混合物密封在不透水且可γ射线灭菌的封装物中，由此获得密封的煅烧硅藻土粒子、水和至少一种无机盐的团聚混合物；
56.(d)任选地将在步骤(c)中获得的所述密封的煅烧硅藻土粒子、水和至少一种无机盐的团聚混合物通过暴露于γ辐照进行灭菌，由此获得内毒素含量等于或小于0.5eu/ml的硅藻土组合物；以及
57.(e)任选地从在步骤(c)或(d)中获得的所述硅藻土组合物除去所述封装物。
58.在后文中，更详细地描述根据本发明的制造硅藻土组合物的方法的步骤(a)至(e)。
59.在如上所定义的方法的步骤(a)中，提供了煅烧硅藻土粒子。正如上文提到的，在步骤(a)中提供的所述硅藻土粒子预先已经历过煅烧，以便确保它们不含水，从而使得能够在后面的步骤(b)中精确调节质量比。此外，在如上所定义的方法的步骤(a)中提供了至少一种无机盐的水溶液，其中所述至少一种无机盐的含量基于100质量份的水等于或大于0.25质量份。由于煅烧硅藻土粒子不含水，因此通过所述制造硅藻土组合物的方法最终获得的硅藻土组合物中包含的水的量对应于在步骤(a)中随着所述至少一种无机盐的水溶液提供的水的量。
60.在如上所定义的方法的步骤(b)中，将所述至少一种无机盐的水溶液与所述煅烧硅藻土粒子混合，其中所述煅烧硅藻土粒子与水的质量比在1:1.0至1:2.0的范围内。由此获得煅烧硅藻土粒子、水和至少一种无机盐的团聚混合物。在混合后，得到的团聚体基于煅烧硅藻土粒子和水的总质量计含有量为33.3至50.0质量％的煅烧硅藻土粒子，并含有量为50.0至66.7质量％的水。此外，得到的团聚体含有所述至少一种无机盐，使得所述至少一种无机盐的含量基于100质量份的水等于或大于0.25质量份。在这种情形中，假定包含在所述硅藻土组合物中的所述至少一种无机盐的量完全来自于在步骤(a)中提供的所述至少一种无机盐的水溶液。对用于提供步骤(a)中的溶液的水而言，它优选地不含内毒素且不含细菌，以便于在步骤(d)中任选地进行的γ射线灭菌。
61.在本文中，所述至少一种无机盐的水溶液与所述煅烧硅藻土粒子的混合可以通过本领域中已知的任何混合技术来进行。在上文定义的方法的特定实施方式中，在步骤(b)中将所述至少一种无机盐的水溶液与所述煅烧硅藻土粒子通过喷雾润湿进行混合。通常，喷雾润湿包括将所述煅烧硅藻土粒子流化，并在流化期间在其上喷雾所述至少一种无机盐的水溶液，导致团聚体的形成，直至实现所需的煅烧硅藻土粒子与水的质量比。或者，可以将所述至少一种无机盐的水溶液和所述煅烧硅藻土粒子在常规混合机例如犁铧混合机中在搅拌的同时混合。为此，优选地将所述煅烧硅藻土粒子装入混合机中，然后添加所述至少一种无机盐的水溶液。由于所述至少一种无机盐的存在，在混合工序期间出现的剪切力不引起所述硅藻土粒子的表面特性的实质性改变。也就是说，无论使用何种混合方法，都可以获得优异的过滤性能。
62.为了防止可能导致内毒素形成的细菌污染，在任选地进行步骤(c)之前，可以将在上文定义的方法的步骤(b)中获得的煅烧硅藻土粒子、水和至少一种无机盐的团聚混合物根据需要在例如0℃至15℃、0℃至10℃或5℃至10℃的温度下冷却。
63.在如上所定义的方法的步骤(c)中，将在步骤(b)中得到的煅烧硅藻土粒子、水和至少一种无机盐的团聚混合物任选地密封在不透水且可γ射线灭菌的封装物中。由此获得密封的煅烧硅藻土粒子、水和至少一种无机盐的团聚混合物。在所述密封之前，通过本领域中已知的任何手段，通常在室温(25℃)下，将在步骤(b)中得到的团聚混合物转移到所述封
装物中，其是例如袋子或容器。然后可以通过施加热来实现密封，这也被称为热密封。然而，本发明不限于任何特定的密封程序。
64.正如上文提到的，所述封装物没有特别限制，只要它是不透水、特别是不透水蒸气的以及可γ射线灭菌的即可。此外，在步骤(c)中为密封所述煅烧硅藻土粒子、水和至少一种无机盐的团聚混合物而提供的封装物可单次使用或多次使用，即它可以是也可以不是可重复密封的。
65.在上文定义的方法的步骤(c)中得到的所述密封的煅烧硅藻土粒子、水和至少一种无机盐的团聚混合物可以以与上文关于步骤(b)解释的相同方式冷却。由此可以确保该密封的团聚混合物不被可能导致内毒素形成的细菌进一步污染。
66.在如上所定义的方法的步骤(d)中，将在步骤(c)中得到的所述密封的煅烧硅藻土粒子、水和至少一种无机盐的团聚混合物任选地通过暴露于γ辐照进行灭菌。由此得到内毒素含量等于或小于0.5eu/ml的硅藻土组合物。
67.正如专业技术人员所知，通过暴露于γ辐照将样品灭菌是一种除去微生物例如细菌的有力工具。由于在革兰氏阴性细菌分解后释放出内毒素，因此此类细菌的去除确保了灭菌样品中低的内毒素含量。
68.在上文定义的方法的特定实施方式中，在步骤(d)中用于将所述密封的煅烧硅藻土粒子、水和至少一种无机盐的团聚混合物灭菌的γ辐照的剂量在25至100kgy、例如40至80kgy、50至70kgy的范围内，例如至少25kgy，但不限于此。取决于在步骤(d)中使用的具体辐照剂量，所述γ射线灭菌进行2至10小时、3至8小时或4至6小时范围内的时段，例如5小时，但不限于此。
69.如果已进行步骤(d)，则通过上文定义的方法得到的硅藻土组合物具有低的内毒素含量，即优选地等于或小于0.5eu/ml、更优选地等于或小于0.2eu/ml、更优选地等于或小于0.1eu/ml的内毒素含量，其可以如上所述使用lal测试来评价。在步骤(d)中的γ射线灭菌完成后，可以将所述硅藻土组合物在室温下储存，即不需要进一步冷却。
70.在如上所定义的方法的步骤(e)中，任选地从在步骤(c)中或者如果进行的话在步骤(d)中得到的硅藻土组合物除去将煅烧硅藻土粒子、水和至少一种无机盐的团聚混合物密封的所述封装物。优选地，所述封装物在即将使用之前才被除去。
71.另一方面，本发明涉及上文定义的硅藻土组合物在生物制药应用中作为预涂层过滤用或动态体进料过滤用的试剂的用途，并且具体来说涉及其如下用途，用于水性介质中真核和/或原核细胞的预涂层过滤或动态体进料过滤。
72.当使用硅藻土作为过滤助剂时，重要的是确保硅藻土的无粉尘施用，并在同时维持优异的过滤性能。当使用根据本发明所述的硅藻土组合物时，这些要求得到满足。
附图说明
73.图1示出了对于煅烧硅藻土粒子与水的不同质量比所测量的粒子计数速率(粒子数/分钟)。
74.图2示出了三种不同混合方法的过滤体积与过滤时间之间的关系，在每种情况下使用超纯水来润湿干燥的硅藻土。
75.图3示出了所述三种混合方法之一的过滤体积与过滤时间之间的关系，使用超纯
水以及不同量的氯化钠在超纯水中的溶液来润湿干燥的硅藻土。
76.图4示出了所述三种混合方法之一的过滤体积与过滤时间之间的关系，使用超纯水以及恒定量的不同无机盐在超纯水中的溶液来润湿干燥的硅藻土。
实施例
77.本发明通过下述实施例进一步说明。然而，本发明不应被解释为限于这些实施例。
78.硅藻土组合物通过将煅烧硅藻土粒子分别与在后文中被简称为润湿介质的超纯水或至少一种无机盐在超纯水中的溶液进行混合来获得。在每种情况下，通过混合得到的硅藻土组合物包含4g煅烧硅藻土粒子和5g水(质量比1:1.25)。
79.然后将相应的硅藻土组合物添加至100ml模拟细胞培养液的包含卡罗咖啡(caro coffee)和阿华田的过滤介质(每100ml水0.60g卡罗咖啡和0.15g阿华田)，以获得硅藻土组合物与所述过滤介质的混合物。然后将由此得到的混合物转移到与真空泵(e.jet)相连的真空滤器(rf 150，过滤面积：18cm2)的漏斗中。过滤在漏斗中的相应混合物到达过滤区时开始，并在全部过滤介质通过所述滤器时或在所述滤器在全部过滤介质能够通过滤器之前被堵塞时停止。
80.然后对过滤性能、即对每次过滤运行期间测量到的过滤体积与过滤时间之间的关系进行评价。
81.在图2中，示出了三种不同混合方法(手动混合、振摇筛分混合以及用搅拌件混合)的过滤体积与过滤时间之间的关系，在每种情况下使用超纯水(水)来润湿干燥硅藻土。所述混合方法的差异在于它们的强度，这意味着在混合工序期间存在的剪切力不同。正如可以从图2看到的，在本文中使用的三种混合方法中，引起最小剪切力的混合方法1(手动混合)导致最佳的过滤性能，即以低的过滤时间实现高的过滤体积，而引起最大剪切力的混合方法3(用搅拌件混合)导致最差的过滤性能，即以高的过滤时间实现低的过滤体积。对于每种混合方法来说，图2示出了分别基于两个独立数据集的最佳拟合曲线。
82.具体来说，本文中使用的三种混合方法如下所述：
83.混合方法1(手动混合)
84.对于手动混合来说，将相应量的煅烧硅藻土粒子和润湿介质一起置于容器中。然后用抹刀进行手动混合以粉碎润湿的硅藻土粒子的大块并将它们相互混合。当得到的硅藻土组合物外观均匀时，手动混合完成。
85.混合方法2(振摇筛分混合)
86.对于振摇筛分混合来说，将相应量的煅烧硅藻土粒子和润湿介质一起置于容器中。将容器封闭并振摇一分钟，以粗略混合所述硅藻土粒子和润湿介质。然后，打开容器并将其内含物置于筛上。取决于它们的尺寸，所述内含物要么直接通过筛，要么必须进行摩擦以使内含物通过筛。收集过筛的内含物并略微搅拌，以得到外观均匀的硅藻土组合物。
87.混合方法3(用搅拌件(stirring picks)混合)
88.对于用搅拌件混合来说，将相应量的煅烧硅藻土粒子和润湿介质一起置于容器中。将搅拌件在最高功率水平下运行五分钟进行混合，由此得到外观均匀的硅藻土组合物。
89.在图3中，示出了混合方法3(用搅拌件混合)的过滤体积与过滤时间之间的关系，
使用超纯水(水)以及不同量的氯化钠在超纯水中的溶液来润湿干燥硅藻土。正如可以从图3看到的，当润湿介质含有逐渐增加量的氯化钠时，过滤性能提高。对于每种润湿介质来说，图3示出了分别基于两个独立数据集的最佳拟合曲线。
90.在图4中，示出了混合方法2(振摇筛分混合)的过滤体积与过滤时间之间的关系，使用超纯水(水)以及恒定量的不同无机盐在超纯水中的溶液来润湿干燥硅藻土。正如可以从图4看到的，与超纯水相比，使用氯化钠、氯化钾、氯化镁和氯化钙的水溶液作为润湿介质导致过滤性能提高。
91.通过元素分析，发现超纯水在很小程度上分散硅藻土，并以二氧化硅的形式洗脱硅，正如可以从下面的表1看到的。
92.表1
[0093][0094]
表1中示出的值通过icp(电感耦合等离子体)测量来确定。在本文以及附图中，以“％”给出的值意味着“质量％”。也就是说，0.9％nacl对应于基于(100-0.9)质量份的水为0.9质量份的nacl(即基于100质量份的水为0.908质量份的nacl)，并且2.0％nacl对应于基于(100-2.0)质量份的水为2.0质量份的nacl(即基于100质量份的水为2.04质量份的nacl)。
[0095]
尽管当使用超纯水时可以观察到洗脱的二氧化硅的量相对小，但它显著降低了硅藻土粒子针对剪切力的机械强度，改变了其表面特性。结果，过滤性能劣化，正如通过过滤体积与过滤时间之间的关系所表示的。
[0096]
另一方面，本发明人发现，当使用无机盐的水溶液例如氯化钠水溶液来润湿所述煅烧硅藻土粒子时，能够显著减少洗脱的二氧化硅的量，正如可以从上面的表1看到的。于是与使用超纯水相比，所述煅烧硅藻土粒子维持它们针对剪切力的机械强度，并且其表面特性没有显著改变。结果维持了优异的过滤性能。
[0097]
根据本发明所述的硅藻土组合物显示出减少的粉尘粒子释放，并在同时维持优异的过滤性能。因此，它可能适合在生物制药应用中用作预涂层过滤用或动态体进料过滤用的试剂，特别是用于水性介质中真核和/或原核细胞的预涂层过滤或动态体进料过滤。