再生功能神经元以用于治疗神经病症的制作方法

再生功能神经元以用于治疗神经病症
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年10月17日提交的美国专利申请序列第62/916,702号的权益。在先申请的公开内容被视为本技术的公开内容的一部分(并且通过引用并入本技术的公开内容中)。
3.政府支持
4.本发明是根据国立卫生研究院(national institutes of health)授予的授权号ag045656在政府支持下进行的。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
5.本文档涉及参与治疗患有脑神经病症(例如，阿尔茨海默氏病(alzheimer's disease))的哺乳动物的方法和材料。例如，本文档提供了用于向患有脑神经病症的哺乳动物施用含有编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸的组合物的方法和材料。


背景技术：

6.包含阿尔茨海默氏病(ad)在内的神经病症的特征在于认知功能障碍和记忆缺陷(querfurth和laferla,《新英格兰医学杂志(new engl.j.med.)》,362:329-344(2010))。对死后组织的研究发现，与健康脑相比，ad患者的脑更轻且体格更小，这表明在ad进展中具有严重神经元和组织丧失(gomez-isla等人,《神经科学杂志(j.neuroscience),16:4491-4500(1996))。星形胶质细胞在转运神经营养因子和代谢细胞因子、维持神经元与其它类型的细胞之间的相互作用和支持神经元回路中发挥作用(burda和sofroniew,《神经元(neuron)》,81:229-248(2014))。这些功能的破坏促进神经炎症并且导致更严重的ad病理学进展(qin和benveniste,《分子生物学方法(methods mol.biol.)》,814:235-249(2012))。这种在细胞和分子水平上的逐渐和进行性扰动的下游效应是学习和记忆系统的损伤以及行为异常(huang和mucke,《细胞(cell)》,148:1204-1222(2012)；以及kunz等人,《科学(science)》,350:430-433(2015))。星形胶质细胞是分布在脑和脊髓中的星形状胶质细胞。在正常脑中，星形胶质细胞维持具有正常形态和最小gfap免疫反应性的静息状态。小胶质细胞是在脑中普遍分布的脑驻留巨噬细胞。小胶质细胞与其它组织驻留巨噬细胞群体在发育上不同(ginhoux等人,《科学》,330:841-845(2010)；以及sheng等人,《免疫力(immunity)》,43:382-393(2015))。有新证据突出了小胶质细胞在ad病理学中的作用的重要性。事实上，新的见解表明，一旦小胶质细胞检测到胞外刺激，小胶质细胞就可以形成并分泌含有c端胱天蛋白酶募集结构域(asc)斑点的凋亡相关斑点样蛋白；此类asc斑点促进ad脑中淀粉样蛋白沉积的接种和进展(venegas等人,《自然(nature)》,552:355-361(2017))。目前对于患有ad的人没有有效的治疗方法。


技术实现要素：

7.本文档涉及参与治疗患有神经病症(例如，阿尔茨海默氏病)的哺乳动物的方法和
材料。例如，本文档提供了用于向患有脑神经病症的哺乳动物施用含有编码neurod11多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸的组合物的方法和材料。
8.通常，本文档的一个方面的特征在于用于治疗患有脑神经病症的哺乳动物的方法。所述方法包括(或基本上由以下组成或由以下组成)：向所述哺乳动物的脑施用包括编码神经源性分化1(neurod1)多肽或其生物活性片段的外源性核酸的组合物。所述哺乳动物可以是人。所述神经病症可以是阿尔茨海默氏病。所述施用步骤可以包括向脑递送包括编码neurod1的核酸的表达载体。所述施用步骤可以包括向脑递送包括编码neurod1的核酸的重组病毒表达载体。所述施用步骤可以包括向脑递送包括编码neurod1的核酸的重组腺相关病毒表达载体。所述腺相关病毒可以是aav.php.eb。所述施用步骤可以包括施用包括编码neurod1蛋白的核酸序列的重组表达载体，其中所述编码neurod1蛋白的核酸序列包括选自由以下组成的组的核酸序列：编码seq id no:2或其功能片段的核酸序列；编码seq id no:4或其功能片段的核酸序列；seq id no:1或其功能片段；seq id no:3或其功能片段；以及编码与seq id no:2或seq id no:4或其功能片段具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的蛋白质的核酸序列。所述施用步骤可以包括立体定向颅内注射。所述施用步骤可以包括两次或更多次立体定向颅内注射。所述施用步骤可以包括颅外注射。所述施用步骤可以包括两次或更多次颅外注射。所述施用步骤可以包括眶后注射。
9.另一方面，本文档的特征在于一种治疗患有阿尔茨海默氏病的哺乳动物的方法。所述方法包括(或基本上由以下组成或由以下组成)：向所述哺乳动物的脑施用包括含有腺相关病毒颗粒的药学上可接受的载体的药物组合物，所述腺相关病毒颗粒包括编码neurod1多肽或其生物活性片段的核酸。所述药物组合物可以包括约1μl到约500μl的药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体含有浓度为10
10-10
14
个腺相关病毒颗粒/毫升载体的腺相关病毒颗粒。可以将所述药物组合物以约0.1微升/分钟到约5微升/分钟的受控流速注射到所述哺乳动物的脑中。
10.另一方面，本文档的特征在于一种用于在患有阿尔茨海默氏病并且需要(1)减少过度磷酸化tau蛋白的神经原纤维缠结；(2)减少胞外淀粉样蛋白斑的聚集；(3)减少神经炎症；(4)减少白介素1β(il-1β)；(5)产生新的谷氨酸能神经元；(6)增加gaba能神经元的存活率；(7)产生新的非反应性星形胶质细胞；(8)减少反应性星形胶质细胞的数量；或(9)改善记忆的哺乳动物体内进行所述(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)或(9)的方法。所述方法包括(或基本上由以下组成或由以下组成)：向所述哺乳动物施用包括编码neurod1多肽或其生物活性片段的外源性核酸的组合物，其中所述(1)过度磷酸化神经原纤维缠结得以减少；(2)胞外淀粉样蛋白斑的聚集得以减少；(3)神经炎症得以减少；(4)白介素1β(il-1β)水平得以降低；(5)新的谷氨酸能神经元得以产生；(6)gaba能神经元的存活率得以增加；(7)新的非反应性星形胶质细胞得以产生；(8)反应性星形胶质细胞的数量得以减少；或(9)所述记忆得以改善。所述哺乳动物可以是人。所述施用步骤可以包括递送包括编码neurod1多肽的核酸的表达载体。所述施用步骤可以包括递送包括编码neurod1多肽的核酸的重组病毒表达载体。所述施用步骤可以包括递送包括编码neurod1多肽的核酸的重组腺相关病毒表达载体。所述重组腺相关病毒表达载体可以是aav.php.eb表达载体。所述施用步骤可以
包括施用包括编码neurod1多肽的核酸序列的重组表达载体，其中所述编码neurod1多肽的核酸序列包括选自由以下组成的组的核酸序列：编码seq id no:2或其功能片段的核酸序列；编码seq id no:4或其功能片段的核酸序列；seq id no:1或其功能片段；seq id no:3或其功能片段；以及编码与seq id no:2或seq id no:4或其功能片段具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的蛋白质的核酸序列。所述施用步骤可以包括立体定向颅内注射。所述施用步骤可以包括两次或更多次立体定向颅内注射。所述施用步骤可以包括颅外注射。所述施用步骤可以包括两次或更多次颅外注射。所述施用步骤可以包括眶后注射。
11.除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明涉及的领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管类似或等效于本文所述的方法和材料的方法和材料可以用于实践或测试本发明，但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过引用整体并入本文。在冲突的情况下，将以本说明书(包含定义)为准。另外，所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在进行限制。
12.本发明的其它特征和优点将根据以下具体实施方式以及权利要求书而变得显而易见。
附图说明
13.图1a-1h：neurod1过表达使得能够在5xfad皮质中将反应性星形胶质细胞体内重编程为功能神经元。(图1a)在反应性星形胶质细胞中在10cre-loxp调节系统下构建表达靶基因的aav9载体的示意图。(图1b)在小鼠皮质内的立体定向注射使得能够在体内准确递送靶基因。(图1c)neurod1过表达在注射后30天(dpi)以高效率实现皮质中星形胶质细胞到神经元的转化。右图示出了左图上虚线所圈出区域的放大图像。注意，在反应性星形胶质细胞中仅具有gfp过表达的对照组中，仍保持典型的胶质细胞形态；neurod1过表达细胞已经具有神经元样形态。比例尺＝30μm。(图1d)在注射后30天，aav9-gfap-cre和aav9-cag-gfp感染的细胞(当在颜色方面观察时，染色为绿色)对于反应性星形胶质细胞标志物gfap(当在颜色方面观察时，染色为品红色)是免疫阳性的。aav9-gfap-cre和aav9-cag-neurod1-p2a-gfp感染的细胞(当在颜色方面观察时，染色为绿色)对于neurod1(当在颜色方面观察时，染色为红色)是免疫阳性的，但对于反应性星形胶质细胞标志物gfap是免疫阴性的。比例尺＝30μm。(图1e)在注射后30天，aav9-gfap-cre和aav9-cag-gfp感染的细胞(当在颜色方面观察时，染色为绿色)对于成熟神经元标志物neun(当在颜色方面观察时，染色为品红色)是免疫阴性的。aav9-gfap-cre和aav9-cag-neurod1-p2a-gfp感染的细胞(当在颜色方面观察时，染色为绿色)对于成熟神经元标志物neun是免疫阳性的，并且这些细胞具有neurod1的高表达水平(当在颜色方面观察时，染色为红色)。比例尺＝30μm。(图1f)示出了在5xfad小鼠脑(26dpi)的皮质区域中的经转化神经元的全细胞记录的典型相衬图像。比例尺＝10μm。(图1g)示出了皮质切片记录中的经neurod1转化的神经元(26dpi)中的重复动作电位的代表性迹线。(图1h)示出了皮质切片记录中的经neurod1转化的神经元(26dpi)中的自发突触事件的代表性迹线。在此图的底部放大了sepsc和sipsc的代表性迹线。
14.图2a-2f：neurod1介导的星形胶质细胞到神经元转化改善了5xfad小鼠皮质中的活动过度的反应性星形胶质细胞。(图2a)在4月龄时，通过aav9病毒递送系统借助于gfp或neurod1处理5xfad小鼠，并且在60dpi时进一步解剖进行免疫染色和分析。示出了反应性星形胶质细胞的代表性图像在5xfad小鼠皮质中的neurod1介导的转化之后减少。注意，在gfp对照中，大量的反应性星形胶质细胞(其表现为白色)存在于注射核心和周围区域两者中。然而，反应性星形胶质细胞(其表现为白色)在neurod1组的注射核心中减少，伴随着大量神经元形态细胞(其表现为黄色)原位再生。(图2b)示出了gfp对照组和neurod1介导的细胞转化组中的反应性星形胶质细胞(gfap，当在颜色方面观察时，染色为品红色)之间的差异(形态和数量)的放大的代表性图像。比例尺表示30μm。(图2c)在5xfad皮质中反应性星形胶质细胞标志物gfap(当在颜色方面观察时，染色为红色)和淀粉样蛋白斑(当在颜色方面观察时，染色为蓝色，硫黄素-s染料)的共标记。比例尺表示30μm。n＝8只经gfp处理的5xfad小鼠以及8只经neurod1处理的5xfad小鼠。数据呈现为平均值
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平均数标准误差，*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；斯图登氏t测试(student's t-test)。(图2d)对反应性星形胶质细胞数量的定量分析。(图2e)对反应性星形胶质细胞覆盖区域百分比的定量分析。(图2f)对反应性星形胶质细胞标志物gfap强度的定量分析。
15.图3a-3d：neurod1诱导的星形胶质细胞到神经元转化可以恢复5xfad小鼠皮质中的神经元丧失。(图3a)在4月龄时，通过aav9病毒递送系统借助于gfp或neurod1处理5xfad小鼠，并且在60dpi时进一步解剖进行免疫染色和分析。示出了神经元密度(neun，当在颜色方面观察时，染色为红色)的代表性图像在注射后60天在neurod1转化组中增加。(图3b)示出了在neurod1组中增加的成熟神经元(neun，当在颜色方面观察时，染色为红色)的数量的放大图像。注意，gfp (当在颜色方面观察时，染色为绿色)和neun (当在颜色方面观察时，染色为红色)细胞是通过neurod1新转化的神经元(合并为黄色)。比例尺表示30μm。n＝6只经gfp处理的5xfad小鼠以及6只经neurod1处理的5xfad小鼠。数据呈现为平均值
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平均数标准误差，*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；斯图登氏t测试。(图3c)定量结果表明neurod1组中成熟神经元(neun 细胞)显著增加。(图3d)神经元和星形胶质细胞比率的定量。
16.图4a-4c：gaba能神经元可以通过neurod1介导的5xfad小鼠皮质中的星形胶质细胞到神经元的转化而再生。(图4a)在4月龄时，通过aav9病毒递送系统借助于gfp或neurod1处理5xfad小鼠，并且在60dpi时进一步解剖进行分析。示出了经neurod1处理的5xfad小鼠皮质中的gaba能神经元(gaba 和neun 细胞)和所有经转化的神经元(gfp 和neun 细胞)的分布的代表性图像。注意，gfp 、neun 和gaba 三重免疫阳性细胞是经转化的gaba能神经元。(图4b)示出了5xfad皮质中的现有gaba 神经元(箭头、gaba 和neun 细胞)和经转化的gaba 神经元(箭头状物、gfp 、gaba 和neun 细胞)的放大图像。比例尺表示30μm。n＝8只经neurod1处理的5xfad小鼠(60dpi)。(图4c)示出了5xfad皮质中的现有gad67 神经元(箭头、gad67 和neun 细胞)和经转化的gad67 神经元(箭头状物、gfp 、gaba 和neun 细胞)的放大图像。比例尺表示30μm。n＝8只经neurod1处理的5xfad小鼠(60dpi)。
17.图5：neurod1组在5xfad小鼠皮质中具有较少的异常gfp聚集体。在4月龄时，通过aav9病毒递送系统借助于gfp或neurod1处理5xfad小鼠，并且在60dpi时进一步解剖进行分析。在gfp对照组(顶行)中的经处理脑区中主要观察到gfp聚集体；这种现象在经neurod1处理组中大大减少(底行)。比例尺表示30μm。
18.图6a-e：neurod1介导的星形胶质细胞到神经元转化缓解了5xfad皮质神经元中的胞内aβ水平。(图6a)在4月龄时，通过aav9病毒递送系统借助于gfp或neurod1处理5xfad小鼠，并且在60dpi时进一步解剖进行免疫染色和分析。示出了5xfad小鼠脑皮质区域中的aβ水平(aβ42，当在颜色方面观察时，染色为天蓝色)的代表性共聚焦显微照片。仔细测量和定量来自脑样品的感染核心的所有神经元的胞内aβ42水平(neun 区域中的aβ42强度)。箭头：预先存在的神经元箭头状物：经转化神经元。比例尺表示30μm。(图6b)gfp对照组和neurod1组的感染核心中的神经元数量的定量结果。n＝3只经gfp处理的5xfad小鼠以及3只经neurod1处理的5xfad小鼠。数据呈现为平均值
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平均数标准误差，*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；斯图登氏t测试。(图6c)gfp对照组的感染核心中的预先存在的神经元数量、neurod1组的感染核心中的预先存在的神经元数量以及neurod1组的感染核心中的经转化神经元数量的定量结果。注意，gfp对照组和neurod1组中的预先存在的神经元数量之间没有观察到差异。n＝3只经gfp处理的5xfad小鼠以及3只经neurod1处理的5xfad小鼠。数据呈现为平均值
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平均数标准误差，*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；当与多个组比较时，使用图基事后测试进行单向anova。(图6d)gfp组和neurod1组中的感染核心内部的所有神经元中的胞内aβ42的强度的定量结果。来自用gfp对照处理的三只5xfad小鼠的感染核心的神经元数量＝662；来自用neurod1处理的三只5xfad小鼠的感染核心的神经元数量＝1357。数据呈现为平均值
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平均数标准误差，*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；斯图登氏t测试。(图6e)示出了gfp组和neurod1组的感染核心中的所有神经元中的胞内aβ42的强度的定量数据。黑色条形：来自gfp对照组中的三只5xfad小鼠的感染核心的预先存在的神经元数量＝662；白色条形：来自neurod1组中的三只5xfad小鼠的感染核心的预先存在的神经元数量＝714；以及灰色条形：来自neurod1组中的三只5xfad小鼠的感染核心的经转化神经元数量＝643。数据呈现为平均值
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平均数标准误差，*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；当与多个组比较时，使用图基事后测试(tukey's post-hoc test)进行单向anova。
19.图7a-7d：neurod1介导的星形胶质细胞到神经元转化使得能够缓解促炎性小胶质细胞。(图7a)在4月龄时，通过aav9病毒递送系统借助于gfp或neurod1处理5xfad小鼠，并且在60dpi时进一步解剖进行免疫染色和分析。示出了一般小胶质细胞(iba1，当在颜色方面观察时，染色为灰色)和促炎性小胶质细胞亚型(inos，当在颜色方面观察时，染色为红色)的变化的代表性共聚焦图像。比例尺表示30μm。(图7b)示出了gfp对照组与neurod1组之间的iba1强度没有显著差异的定量数据。在gfp组中n＝8只5xfad小鼠并且在neurod1组中8只5xfad小鼠。数据呈现为平均值
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平均数标准误差，斯图登氏t测试。(图7c)示出了gfp和neurod1组之间的iba1 小胶质细胞覆盖面积百分比没有显著差异的定量结果。在gfp组中n＝8只5xfad小鼠并且在neurod1组中8只5xfad小鼠。数据呈现为平均值
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平均数标准误差，斯图登氏t测试。(图7d)neurod1组中的促炎性小胶质细胞亚型(inos 小胶质细胞)的强度大大缓解。在gfp组中n＝8只5xfad小鼠并且在neurod1组中8只5xfad小鼠。数据呈现为平均值
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平均数标准误差，*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；斯图登氏t测试。
20.图8a-8b：在5xfad皮质中在neurod1介导的细胞转化之后，促炎性细胞因子il-1β减少。(图8a)在4月龄时，通过aav9病毒递送系统借助于gfp或neurod1处理5xfad小鼠，并且在60dpi时进一步解剖进行免疫染色和分析。示出了在neurod1处理后反应性星形胶质细胞(当在颜色方面观察时，染色为品红色)和白介素-1β(当在颜色方面观察时，染色为红色)的
减少的代表性共聚焦图像。比例尺表示30μm。(图8b)示出了在neurod1诱导的细胞转化之后il-1β的强度显著降低的定量分析。在gfp组中n＝8只5xfad小鼠并且在neurod1组中8只5xfad小鼠。数据呈现为平均值
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平均数标准误差，*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；斯图登氏t测试。
21.图9a-9d：5xfad脑中的经neurod1转化的神经元可以存活超过8个月，同时具有良好形态。(图9a)在6月龄时，通过aav9病毒递送系统借助于gfp或neurod1处理5xfad小鼠，并且在注射后8个月时进一步解剖进行免疫染色和分析。示出了gfp对照组和neurod1组中的受感染细胞的代表性图像。注意，在neurod1组中，经转化神经元(gfp ，当在颜色方面观察时，染色为绿色)均匀地分布在整个5xfad小鼠的皮质区域中。(图9b到图9d)示出了星形胶质细胞、经转化神经元和皮质区域中的感染核心中的neurod1表达水平的典型显微照片。在gfp对照组中，星形胶质细胞(gfap ，当在颜色方面观察时，染色为品红色)仍是活动过度的，并且观察到大量的异常gfp聚集体(当在颜色方面观察时，染色为绿色)。在neurod1组中，受感染星形胶质细胞已经成功地转化为具有高neurod1表达水平的成熟神经元(neun ，当在颜色方面观察时，染色为红色)和具有强神经突的健康形态(当在颜色方面观察时，染色为绿色)。比例尺表示30μm。
22.图10a-10f：在长期作用后，在5xfad皮质中的neurod1介导的细胞转化之后，轴突、树突和突触增加。(图10a)在6月龄时，通过aav9病毒递送系统借助于gfp或neurod1处理5xfad小鼠，并且在注射后8个月时进一步解剖进行免疫染色和分析。代表性图像揭示了在受感染皮质中的neurod1诱导的转化之后轴突(nf200，当在颜色方面观察时，染色为天蓝色)和突触(突触素，当在颜色方面观察时，染色为红色)增加。比例尺表示30μm。n＝3。数据呈现为平均值
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平均数标准误差，*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；斯图登氏t测试。(图10b)轴突标志物nf200的强度的定量分析。(图10c)突触标志物突触素的强度的定量分析。(图10d)代表性图像揭示了在注射后8个月(mpi)，在neurod1治疗之后树突(map2，当在颜色方面观察时，染色为天蓝色)和兴奋性突触(vglut1，当在颜色方面观察时，染色为红色)增加。比例尺表示30μm。(图10e)树突标志物map2的强度的定量分析。(图10f)兴奋性突触标志物vglut1的强度的定量分析。
23.图11a-11d：neurod1介导的星形胶质细胞到神经元转化保护了5xfad脑皮质中的血管完整性。(图11a)示出了5xfad脑中的血管上的血管区段(ly6c，当在颜色方面观察时，染色为红色)和星形胶质细胞末端足(aqp4，当在颜色方面观察时，染色为品红色)的典型图像。在6月龄时，通过aav9病毒递送系统借助于gfp或neurod1处理5xfad小鼠，并且在注射后8个月时进一步解剖进行免疫染色和分析。(图11b)在neurod1或gfp干预后8个月，5xfad小鼠皮质中的血管区段(ly6c，当在颜色方面观察时，染色为红色)和星形胶质细胞末端足(aqp4，当在颜色方面观察时，染色为天蓝色)的代表性图像。比例尺表示30μm。(图11c)aqp4 区段的长度的定量分析。n＝三只完整wt小鼠，gfp对照组中三只5xfad小鼠，neurod1组中三只5xfad小鼠，年龄和性别匹配。数据呈现为平均值
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平均数标准误差，*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；斯图登氏t测试。(图11d)ly6c 血管区段的长度的定量分析。
24.图12a-12h：用于全局感染的多次颅内显微注射。(图12a到图12b)用于激活gfp或neurod1表达的aav cre-flex系统的图谱。(图12c到图12d)示出了小鼠脑中的多个颅内注射位点的示意图。四个注射窗口由小鼠头骨上的四个点标记(图12c)，并且注射位点由箭头
和十字表示(图12d)。(图12e到图12f)gfp病毒注射的gfap::cre转基因小鼠脑15dpi的矢状和冠状视图。(图12g到图12h)neurod1-p2a-gfp病毒注射的gfap::cre转基因小鼠脑15dpi的矢状和冠状视图。星形胶质细胞由s100β(当在颜色方面观察时，染色为红色)标记，并且神经元由neun(当在颜色方面观察时，染色为青色)标记。(图12f)和(图12h)中的虚线1和2表示底部图中示出的相对冠状截面位置。
25.图13a-13b：gfap::cre转基因小鼠脑中的neurod1介导的全局转化。(图13a)gfp对照病毒注射(15dpi)在gfap::cre转基因小鼠脑中的综述，不同区域的高放大率图像显示在数字1到9图中。注意，几乎所有gfp阳性细胞与星形胶质细胞标志物s100β(当在颜色方面观察时，染色为红色)共标记。(图13b)neurod1-p2a-gfp病毒注射(15dpi)在gfap::cre转基因小鼠脑中的综述，不同区域的高放大率图像显示在数字1到9图中。注意，皮质区域(1，3)、海马体(4-6)、脑下脚(7)和中脑(9)中的大部分gfp阳性细胞与神经元标志物neun(当在颜色方面观察时，染色为青色)共标记。低放大率矢状图像指示了数字1到9图的相对区域。
26.图14a-14b：直接比较对照与经neurod1处理的小鼠之间的形态差异。(图14a)对照和经neurod1处理的小鼠中在不同区域的gfp阳性细胞。15dpi，对照组中几乎所有gfp阳性细胞仍显示典型的星形胶质细胞形态。然而，经neurod1处理的小鼠的大部分gfp阳性细胞已经显示出典型的神经元形态。(图14b)通过经nd1-p2a-gfp处理的小鼠脑中的gfp阳性细胞中的免疫染色揭示强neurod1表达(当在颜色方面观察时，染色为红色，箭头)，并且neurod1阳性细胞也与neun(当在颜色方面观察时，染色为青色，箭头)共定位。在对照组中，没有gfp阳性细胞含有neurod1或与neun共定位(顶部)。
27.图15a-15c：5xfad小鼠脑中的全局星形胶质细胞到神经元转化。(图15a)研究的工作流程。(图15b)在5xfad小鼠脑中观察到广泛的感染区域。通过硫黄素-s染色(当在颜色方面观察时，染色为蓝色)来揭示aβ斑。(图15c)在不同的脑区中，几乎所有gfp阳性细胞与神经元标志物neun(当在颜色方面观察时，染色为红色)共标记。
28.图16a-16b：5xfad大脑皮质中的经neurod1转化的神经元的表征。(图16a)经neurod1处理的5xfad小鼠脑的矢状视图。(图16b)示出了一些经neurod1转化的神经元在额皮质(fcx)和顶皮质(pcx)中具有tbr1信号(当在颜色方面观察时，染色为红色)的高放大率图像。
29.图17a-17b：aav.php.eb-pgfap::gfp的眶后注射。(图17a)注射后第17天的示出了整个大脑的有效感染的矢状图像。(图17b)示出了星形胶质细胞中gfp特异性表达的脑的不同区域的高放大率图像。比例尺：100μm。
30.图18a-18b：aav.php.eb-pgfap::cre flex-gfp的眶后注射。(图18a)注射后第14天的示出了整个大脑的有效感染的矢状图像。(图18b)脑的不同区域的示出了星形胶质细胞和神经元两者中gfp的表达的高放大率图像。比例尺：100μm。
31.图19a-19b：aav.php.eb-pgfap::cre flex-neurod1-gfp的眶后注射。(图19a)注射后第14天的示出了整个大脑的有效感染的矢状图像。(图19b)gfp和neurod1信号在脑的不同区域的高放大率图像，示出了与神经元标志物neun的共定位。比例尺：100μm。
32.图20：用于全局靶向星形胶质细胞的病毒(例如，aav.php.eb-cag::flex-gfp)的眶后(r.o.)注射以及cre 77.6小鼠与5xfad小鼠之间的杂交以产生双基因小鼠(5xfad
/-/gfap::cre77.6
/-小鼠)的图。
33.图21a-21b：生物源(5xfad
/-/gfap::cre77.6
/-)小鼠的星形胶质细胞的全局靶向的证明。(图21a)用于靶向星形胶质细胞的方法的图。(图21b)眶后(r.o.)注射aav.php.eb-cag::flex-gfp 11dpi的2.0
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到3.0
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个基因组拷贝/小鼠后的小鼠脑的图像。
34.图22：显微镜图像显示在眶后(r.o.)注射2.0
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到3.0
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个基因组拷贝/小鼠之后，aav.php.eb-cag::flex-gfp 11dpi对脊髓细胞的病毒感染。
35.图23：显微镜图像显示在眶后注射aav.php.eb-cag::flex-gfp(2.0
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到3.0
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个基因组拷贝/小鼠)后，在其它器官11dpi中未检测到明显的gfp信号。
36.图24：显微镜图像显示在眶后(r.o.)注射aav.php.eb-cag::flex-gfp(2.0
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到3.0
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个基因组拷贝/小鼠)后，通过aav.php.eb-cag::flex-gfp 11dpi对脑的不同区域中的星形胶质细胞的全局靶向。ob＝嗅球；pif＝梨状皮质；mo＝运动皮质；str＝纹状体；ss＝体感皮质；vis＝视觉皮质；sub＝脑下脚；hip＝海马体；th＝丘脑；mb＝中脑；cb＝小脑；以及bs＝脑干。
37.图25a：显微镜图像显示星形胶质细胞通过眶后注射(约2.0
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个基因组拷贝/小鼠)转化为aav.php.eb-cag::flex-nd1-p2a-gfp的大脑30dpi内的神经元。图25b：显微镜图像显示通过眶后注射(约2.0
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个基因组拷贝/小鼠)在aav.php.eb-cag::flex-nd1-p2a-gfp的脊髓30dpi内没有经转化神经元。
38.图26：显微镜图像显示在眶后(r.o.)注射aav.php.eb-cag::flex-nd1-p2a-gfp(约2.0
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个基因组拷贝/小鼠)后，通过aav.php.eb-cag::flex-nd1-p2a-gfp 30dpi对脑的不同区域中的星形胶质细胞的全局转化。ob＝嗅球；pif＝梨状皮质；mo＝运动皮质；str＝纹状体；ss＝体感皮质；vis＝视觉皮质；sub＝脑下脚；hip＝海马体；th＝丘脑；mb＝中脑；cb＝小脑；以及bs＝脑干。
39.图27：显微镜图像显示在眶后(r.o.)注射后，接受指定为gfp对照(顶部)的对照病毒(aav.php.eb-cag::flex-gfp；约2.0
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个基因组拷贝/小鼠)或接受指定为neurod1(底部)30dpi的表达neurod1的病毒(aav.php.eb-cag::flex-nd1-p2a-gfp；约2.0
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个基因组拷贝/小鼠)的小鼠(5xfad
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/-小鼠)的不同脑区的直接比较。对照病毒清楚地感染星形胶质细胞，而驱动neurod1表达的病毒感染星形胶质细胞并且将星形胶质细胞转化为独特的神经元。ob＝嗅球；pif＝梨状皮质；mo＝运动皮质；str＝纹状体；ss＝体感皮质；vis＝视觉皮质；sub＝脑下脚；hip＝海马体；th＝丘脑；mb＝中脑；cb＝小脑；以及bs＝脑干。
40.图28：用于证实被设计成表达neurod1的病毒用于在ad中改善记忆的能力的实验设计的示意图。
41.图29a-29b：提供了用于评估ad的小鼠模型的记忆的y迷宫的照片。图29a是对照组的y迷宫。图29b是neurod1组的y迷宫。
42.图30：通过眶后注射约2.0
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个基因组拷贝/小鼠接受对照病毒(aav.php.eb-cag::flex-gfp病毒，指定为gfp)或表达neurod1的病毒(aav.php.eb-cag::flex-nd1-p2a-gfp，指定为neurod1)的雄性和雌性5xfad
/-/gfap::cre77.6
/-小鼠的小鼠手臂进入(顶部)和改变(底部)的条形图。
43.图31：线形图提供了气味1、2、3和4的标准化气味调查时间。使用通过眶后注射约2.0
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个基因组拷贝/小鼠接受对照病毒(aav.php.eb-cag::flex-gfp病毒，指定为gfp)
或表达neurod1的病毒(aav.php.eb-cag::flex-nd1-p2a-gfp，指定为neurod1)的5xfad
/-/gfap::cre77.6
/-小鼠，由从如别处(wesson等人,《神经科学杂志》,30(2):505-514(2010))所述进行的气味习惯化测定产生的结果。
44.图32：条形图显示使用通过眶后注射约2.0
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个基因组拷贝/小鼠接受对照病毒(aav.php.eb-cag::flex-gfp病毒，指定为gfp)或表达neurod1的病毒(aav.php.eb-cag::flex-nd1-p2a-gfp，指定为neurod1)的5xfad
/-/gfap::cre77.6 /-小鼠，来自如别处(choi等人,《分子与脑(mol.brain)》,9:72(2016))所述进行的恐惧条件记忆测试的僵直百分比。
45.图33：用于评估空间学习和记忆的morris水迷宫图。
46.图34a-34d：使用通过眶后注射约2.0
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个基因组拷贝/小鼠接受对照病毒(aav.php.eb-cag::flex-gfp病毒，指定为gfp)或表达neurod1的病毒(aav.php.eb-cag::flex-nd1-p2a-gfp，指定为neurod1)的5xfad
/-/gfap::cre77.6
/-小鼠进行的morris水迷宫评估的结果。移动路径图(图34a)。与neurod1小鼠相比，对照小鼠(gfp)在目标象限中的时间的条形图(图34b)。与neurod1小鼠相比，对照小鼠(gfp)在1、2、3、4和5天内的潜伏期的线形图(图34c)。对照小鼠(gfp)与neurod1小鼠之间的所进行交叉的数量的条形图(图34d)。
47.图35a-35d：经neurod1转化的神经元有助于ad小鼠的记忆改善。(图35a)用于测试经转化神经元是否直接负责恐惧记忆恢复的化学遗传策略的示意图。(图35b)示出了dreadd受体(hm4di)在经转化神经元中特异性表达(neurod1行中的箭头)的免疫染色结果。比例尺：20μm。(图35c)恐惧条件记忆测试的范例。在aav注射后2个月进行记忆测试。底部图展示了通过注射氯氮平-n-氧化物(cno)来快速抑制经转化神经元。(图35d)示出了经neurod1处理的5xfad小鼠(neurod1，盐水组)的恐惧调节记忆增强通过cno施用(neurod1，cno组)而消除的总结图。数据显示为平均值
±
sem。***p《0.001，使用图基事后测试进行单向anova。
具体实施方式
48.本文档提供了参与治疗患有脑神经病症(例如，阿尔茨海默氏病)的哺乳动物的方法和材料。例如，本文档提供了用于向患有脑神经病症的哺乳动物施用含有编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸的组合物的方法和材料。
49.任何适合的哺乳动物可以被鉴定为患有脑神经病症(例如，阿尔茨海默氏病)。例如，人和如猴等其它灵长类动物可以被鉴定为患有阿尔茨海默氏病。
50.在一些情况下，向受脑神经病症(例如，阿尔茨海默氏病)影响的受试者施用治疗有效量的编码neurod1多肽的外源性核酸介导：通过将反应性星形胶质细胞转化为谷氨酸能神经元来产生新的谷氨酸能神经元；反应性星形胶质细胞的数量的减少；包含gaba能神经元和谷氨酸能神经元在内的受损神经元的存活率；新的非反应性星形胶质细胞的产生；未转化的反应性星形胶质细胞的反应性的降低；以及将血管再整合到受损区域中。在一些实施例下，向受脑神经病症(例如，阿尔茨海默氏病)影响的受试者施用治疗有效量的编码neurod1多肽的外源性核酸介导：(1)过度磷酸化tau蛋白的神经原纤维缠结的减少；(2)胞外淀粉样蛋白斑的聚集的减少；(3)神经炎症的减少；(4)白介素1β(il-1β)水平的降低；(5)
产生新的谷氨酸能神经元；(6)增加gaba能神经元的存活率；(7)产生新的非反应性星形胶质细胞；(8)减少反应性星形胶质细胞的数量；以及(9)改善记忆。
51.在一些情况下，在施用本文所提供的组合物之后，本文所提供的方法或组合物使过度磷酸化tau蛋白的神经原纤维缠结减少介于约1％与100％之间的量。在一些情况下，在本文所提供的组合物之后，本文所提供的方法或组合物使过度磷酸化tau蛋白的神经原纤维缠结减少介于约1％与约10％之间、介于1％与约20％之间、介于1％与约30％之间、介于10％与约20％之间、介于10％与约30％之间、介于约10％与约40％之间、介于约20％与约30％之间、介于约20％与约40％之间、介于约20％与约50％之间、介于约30％与约40％之间、介于约30％与约50％之间、介于约30％与约60％之间、介于约40％与约50％之间、介于约40％与约60％之间、介于约40％与约70％之间、介于约50％与约60％之间、介于约50％与约70％之间、介于约50％与约80％之间、介于约60％与约70％之间、介于约60％与约80％之间、介于约60％与约90％之间、介于约70％与约80％之间、介于约70％与约90％之间、介于约70％与约100％之间、介于约80％与约90％之间、介于约80％与约100％之间或介于约90％与约100％之间的量。
52.在一些情况下，在施用本文所提供的组合物之后，本文所提供的方法或组合物使胞外淀粉样蛋白斑的聚集减少介于约1％与100％之间的量。在一些情况下，在施用本文所提供的组合物之后，本文所提供的方法或组合物使胞外淀粉样蛋白斑的聚集减少介于约1％与约10％之间、介于1％与约20％之间、介于1％与约30％之间、介于10％与约20％之间、介于10％与约30％之间、介于约10％与约40％之间、介于约20％与约30％之间、介于约20％与约40％之间、介于约20％与约50％之间、介于约30％与约40％之间、介于约30％与约50％之间、介于约30％与约60％之间、介于约40％与约50％之间、介于约40％与约60％之间、介于约40％与约70％之间、介于约50％与约60％之间、介于约50％与约70％之间、介于约50％与约80％之间、介于约60％与约70％之间、介于约60％与约80％之间、介于约60％与约90％之间、介于约70％与约80％之间、介于约70％与约90％之间、介于约70％与约100％之间、介于约80％与约90％之间、介于约80％与约100％之间或介于约90％与约100％之间的量。
53.在一些情况下，在施用本文所提供的组合物之后，本文所提供的方法或组合物使神经炎症减少约1％与100％之间。在一些情况下，在施用本文所提供的组合物之后，此处所提供的方法或组合物使神经炎症减少约1％与约10％之间、1％与约20％之间、1％与约30％之间、10％与约20％之间、10％与约30％之间、约10％与约40％之间、约20％与约30％之间、约20％与约40％之间、约20％与约50％之间、约30％与约40％之间、约30％与约50％之间、约30％与约60％之间、约40％与约50％之间、约40％与约60％之间、约40％与约70％之间、约50％与约60％之间、约50％与约70％之间、约50％与约80％之间、约60％与约70％之间、约60％与约80％之间、约60％与约90％之间、约70％与约80％之间、约70％与约90％之间、约70％与约100％之间、约80％与约90％之间、约80％与约100％之间或约90％与约100％之间。
54.在一些情况下，在施用本文所提供的组合物之后，本文所提供的方法或组合物使脑中的白介素1β(il-1β)减少介于约1％与100％之间的量。在一些情况下，在施用本文所提供的组合物之后，本文所提供的方法或组合物使脑中的白介素1β(il-1β)减少介于约1％与约10％之间、介于1％与约20％之间、介于1％与约30％之间、介于10％与约20％之间、介于
10％与约30％之间、介于约10％与约40％之间、介于约20％与约30％之间、介于约20％与约40％之间、介于约20％与约50％之间、介于约30％与约40％之间、介于约30％与约50％之间、介于约30％与约60％之间、介于约40％与约50％之间、介于约40％与约60％之间、介于约40％与约70％之间、介于约50％与约60％之间、介于约50％与约70％之间、介于约50％与约80％之间、介于约60％与约70％之间、介于约60％与约80％之间、介于约60％与约90％之间、介于约70％与约80％之间、介于约70％与约90％之间、介于约70％与约100％之间、介于约80％与约90％之间、介于约80％与约100％之间或介于约90％与约100％之间的量。
55.在一些情况下，在施用本文所提供的组合物之后，本文所提供的方法或组合物产生新的谷氨酸能神经元，谷氨酸能神经元的数量相对于基线水平增加约1％与500％之间。在一些情况下，在施用本文所提供的组合物之后，本文所提供的方法或组合物产生新的谷氨酸能神经元，谷氨酸能神经元的数量相对于基线水平增加约1％与50％之间、约1％与100％之间、约1％与150％之间、约50％与100％之间、约50％与150％之间、约50％与200％之间、约100％与150％之间、约100％与200％之间、100％与250％之间、约150％与200％之间、约150％与250％之间、约150％与300％之间、200％与250％之间、200％与300％之间、200％与350％之间、250％与300％之间、250％与350％之间、约250％与400％之间、约300％与350％之间、约300％与400％之间、约300％与450％之间、约350％与400％之间、约350％与450％之间、约350％与500％之间、约400％与450％之间、约400％与500％之间或约450％与500％之间。
56.在一些情况下，在未施用相比，在施用本文所提供的组合物之后，本文所提供的方法或组合物使gaba能神经元的存活率增加约1％与100％之间。在一些情况下，在未施用相比，在施用本文所提供的组合物之后，本文所提供的方法或组合物使gaba能神经元的存活率增加约1％与约10％之间、1％与约20％之间、1％与约30％之间、10％与约20％之间、10％与约30％之间、约10％与约40％之间、约20％与约30％之间、约20％与约40％之间、约20％与约50％之间、约30％与约40％之间、约30％与约50％之间、约30％与约60％之间、约40％与约50％之间、约40％与约60％之间、约40％与约70％之间、约50％与约60％之间、约50％与约70％之间、约50％与约80％之间、约60％与约70％之间、约60％与约80％之间、约60％与约90％之间、约70％与约80％之间、约70％与约90％之间、约70％与约100％之间、约80％与约90％之间、约80％与约100％之间或约90％与约100％之间。可以使用任何适合的方法来评估gaba能神经元的存活率的增加。例如，可以对γ-氨基丁酸(gaba)、gaba合成酶谷氨酸脱羧酶67(gad67)和/或小清蛋白(pv)进行免疫染色，以测量gaba能神经元的数量。gaba能神经元数量的减少可以指示gaba能神经元的丧失。当数量保持不变，其可以指示gaba能神经元存活。gaba能神经元数量的增加可以指示gaba能再生的发生。
57.在一些情况下，在施用本文所提供的组合物之后，本文所提供的方法或组合物产生新的非反应性星形胶质细胞，新的非反应性星形胶质细胞的数量相对于基线水平增加约1％与100％之间。在一些情况下，本文所提供的方法或组合物产生新的非反应性星形胶质细胞，新的非反应性星形胶质细胞的数量相对于基线水平增加约1％与约10％之间、1％与约20％之间、1％与约30％之间、10％与约20％之间、10％与约30％之间、约10％与约40％之间、约20％与约30％之间、约20％与约40％之间、约20％与约50％之间、约30％与约40％之间、约30％与约50％之间、约30％与约60％之间、约40％与约50％之间、约40％与约60％之
间、约40％与约70％之间、约50％与约60％之间、约50％与约70％之间、约50％与约80％之间、约60％与约70％之间、约60％与约80％之间、约60％与约90％之间、约70％与约80％之间、约70％与约90％之间、约70％与约100％之间、约80％与约90％之间、约80％与约100％之间或约90％与约100％之间。
58.在一些情况下，在施用本文所提供的组合物之后，本文所提供的方法或组合物使反应性星形胶质细胞的数量减少约1％与100％之间。在一些情况下，在施用本文所提供的组合物之后，本文所提供的方法或组合物使反应性星形胶质细胞的数量减少约1％与约10％之间、1％与约20％之间、1％与约30％之间、10％与约20％之间、10％与约30％之间、约10％与约40％之间、约20％与约30％之间、约20％与约40％之间、约20％与约50％之间、约30％与约40％之间、约30％与约50％之间、约30％与约60％之间、约40％与约50％之间、约40％与约60％之间、约40％与约70％之间、约50％与约60％之间、约50％与约70％之间、约50％与约80％之间、约60％与约70％之间、约60％与约80％之间、约60％与约90％之间、约70％与约80％之间、约70％与约90％之间、约70％与约100％之间、约80％与约90％之间、约80％与约100％之间或约90％与约100％之间。
59.在一些情况下，在施用本文所提供的组合物之后，本文所提供的方法或组合物将哺乳动物的记忆评估特性提高约1％与100％之间。在一些情况下，在施用本文所提供的组合物之后，本文所提供的方法或组合物将哺乳动物的记忆评估特性提高约1％与约10％之间、1％与约20％之间、1％与约30％之间、10％与约20％之间、10％与约30％之间、约10％与约40％之间、约20％与约30％之间、约20％与约40％之间、约20％与约50％之间、约30％与约40％之间、约30％与约50％之间、约30％与约60％之间、约40％与约50％之间、约40％与约60％之间、约40％与约70％之间、约50％与约60％之间、约50％与约70％之间、约50％与约80％之间、约60％与约70％之间、约60％与约80％之间、约60％与约90％之间、约70％与约80％之间、约70％与约90％之间、约70％与约100％之间、约80％与约90％之间、约80％与约100％之间或约90％与约100％之间。
60.在一些情况下，向受脑神经病症(例如，阿尔茨海默氏病)影响的受试者施用治疗有效量的编码neurod1多肽的外源性核酸可以重新引入内稳态，有助于清除斑和/或改善脑血管化和血流。
61.在一些情况下，向受脑神经病症(例如，阿尔茨海默氏病)影响的受试者施用治疗有效量的编码neurod1多肽的外源性核酸介导：减少损伤位点处的炎症；降低损伤位点处的神经抑制；重建损伤位点处的正常小神经胶质形态；重建损伤位点处的神经回路；增加损伤位点处的血管；重建损伤位点处的血脑屏障；重建损伤位点处的正常组织结构；以及改善由于正常血流的中断而引起的运动缺陷。
62.在一些情况下，在施用于反应性星形胶质细胞时，施用治疗有效量的编码neurod1多肽的外源性核酸以改善有需要的个体受试者的脑神经病症(例如，阿尔茨海默氏病)的效果比在施用于静态星形胶质细胞时具有更大的有益效果。
63.可以向如通过mri诊断的损伤区域施用neurod1治疗。电生理学可以评估由神经细胞死亡或损伤引起的神经放电的功能变化。测定神经损伤的非侵入性方法包含脑电图(eeg)。至损伤点的血流的中断可以通过近红外光谱和功能磁共振成像(fmri)进行非侵入性地测定。区域内的血流量可以增加(如在动脉瘤中所见)或减少(如在缺血中所见)。由血
流的中断引起的对cns的损伤另外引起了可以用于诊断损伤点的组织结构的短期和长期变化。从短期来看，损伤将引起局部肿胀。从长期来看，细胞死亡将引起组织点丧失。用于测定由组织死亡引起的结构变化的非侵入性方法包含磁共振成像(mri)、正电子发射断层扫描(pet)、计算机轴向断层扫描(cat)或超声。这些方法可以单独地使用或以任何组合使用，以精准确定损伤的焦点。
64.如上所述，用于测定由组织死亡引起的结构变化的非侵入性方法包含mri、cat扫描或超声。功能测定可以包含eeg记录。
65.在如本文所述的用于治疗神经病症的方法的一些实施例中，neurod1作为含有编码neurod1的dna序列的表达载体施用。
66.在如本文所述的用于治疗神经病症的方法的一些实施例中，将包含编码neurod1的核酸的病毒载体(例如，aav)通过注射递送到受试者的脑中，如立体定向颅内注射或眶后注射。在一些情况下，在脑中的同一位置处使用两次或更多次颅内注射向脑施用含有编码neurod1的腺相关病毒的组合物。在一些情况下，在脑中的两个或更多个不同位置处使用两次或更多次颅内注射向脑施用含有编码neurod1的腺相关病毒的组合物。
67.术语“表达载体”是指用于将编码neurod1的核酸体外或体内引入到宿主细胞中的重组载体，其中核酸被表达以产生neurod1。在特定实施例中，表达包含seq id no:1或3或基本上相同的核酸序列的表达载体，以在含有表达载体的细胞中产生neurod1。术语“重组”用于指示两个或更多个核酸连接并且在自然界中未发现连接的核酸构建体。表达载体包含但不限于质粒、病毒、bac和yac。特定的病毒表达载体说明性地包含源自腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和慢病毒的病毒表达载体。
68.本文档描述了根据所描述的方法用于治疗有需要的受试者的神经病症(例如，阿尔茨海默式病)的材料和方法，所述方法包含提供包括编码neurod1的核酸的病毒载体；以及将病毒载体递送到受试者的脑中，由此病毒载体分别感染中枢神经系统的胶质细胞，从而产生受感染的胶质细胞，并且由此外源性neurod1多肽(例如，编码neurod1多肽的外源性核酸)在受感染的胶质细胞中以治疗有效水平表达，其中与患有同一神经病状的未经治疗的受试者相比，neurod1在受感染细胞中的表达在受试者中产生更多数量的神经元，由此治疗神经病症。除了产生新的神经元之外，减少反应性胶质细胞的数量也将减少，从而导致所释放的神经抑制因子更少、神经炎症更少并且还均匀分布的血管更多，由此使局部环境更允许神经元生长或轴突渗透，因此减轻神经病状。
69.在一些情况下，腺相关载体在本文所述的方法中是特别有用的，并且将在注射位点处感染分裂细胞和非分裂细胞两者。腺相关病毒(aav)是细小病毒科家族的ssdna动物病毒的普遍存在的、非细胞病变的、无复制能力的成员。根据一些方面，可以如本文所述使用如血清型1-9等各种重组腺相关病毒中的任何重组腺相关病毒。在一些情况下，使用aav-php.eb来施用编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸。
70.根据本文所述的一些方面，“flex”转换方法用于在受感染细胞中表达neurod1。术语“flex”和“翻转切除(flip-excision)”可互换使用，以表示将两对异型的反平行loxp型重组位点安置在反向neurod1编码序列的任一侧的方法，所述反向neurod1编码序列首先经历编码序列的反向，随后切除两个位点，从而导致每个正交重组位点之一相反地定向并且不能进一步重组，从而实现稳定的反向，参见例如schnutgen等人,《自然
·
生物技术
(nature biotechnology)》,21:562-565(2003)；以及atasoy等人,《神经科学杂志》,28:7025-7030(2008)。由于在胶质细胞特异性启动子控制下的位点特异性重组酶将在包含反应性星形胶质细胞在内的胶质细胞中强烈表达，因此neurod1也将在包含反应性星形胶质细胞在内的胶质细胞中表达。然后，当从重组中去除neurod1前面的终止密码子时，组成型或神经元特异性启动子将驱动neurod1的高表达，从而使反应性星形胶质细胞转化成功能神经元。
71.根据特定方面，通过施用以下向有需要的受试者施用neurod1：(1)包含在如gfap或s100b或aldh1l1等星形胶质细胞特异性启动子的转录控制下编码位点特异性重组酶的dna序列在内的腺相关病毒表达载体；以及(2)包含在普遍存在的(组成型)启动子或神经元特异性启动子的转录控制下编码neurod1的dna序列在内的腺相关病毒表达载体，其中编码neurod1的dna序列被反向并且以错误的定向进行neurod1的表达，直到位点特异性重组酶使编码neurod1的反向dna序列反向，从而允许neurod1的表达。
72.位点特异性重组酶及其识别位点包含例如cre重组酶连同识别位点loxp和lox2272位点或flp-frt重组或其组合。
73.可以向哺乳动物施用包含编码neurod1多肽(例如，编码neurod1多肽的aav)的外源性核酸序列的组合物一次或多次(例如，两次、三次、四次、五次或更多次)。
74.包含编码neurod1多肽的外源性核酸序列(例如，编码neurod1多肽的aav)的组合物可以被调配成药物组合物，以便向哺乳动物施用。例如，治疗有效量的包含编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸的组合物可以与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起调配。包含外源性neurod1(例如，编码neurod1的aav)的药物组合物可以被配制成用于各种施用途径，例如，作为胶囊、液体等口服施用。在一些情况下，肠胃外施用，优选地通过静脉内注射或静脉内输注具有编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸的病毒载体(例如，aav)。施用可以是例如通过静脉内输注进行，例如持续60分钟、30分钟或15分钟。在一些情况下，施用可以介于1分钟与60分钟之间。在一些情况下，施用可以介于1分钟与5分钟之间、介于1分钟与10分钟之间、介于1分钟与15分钟之间、介于5分钟与10分钟之间、介于5分钟与15分钟之间、介于5分钟与20分钟之间、介于10分钟与15分钟之间、介于10分钟与20分钟之间、介于10分钟与25分钟之间、介于15分钟与20分钟之间、介于15分钟与25分钟之间、介于15分钟与30分钟之间、介于20分钟与25分钟之间、介于20分钟与30分钟之间、介于20分钟与35分钟之间、介于25分钟与30分钟之间、介于25分钟与35分钟之间、介于25分钟与40分钟之间、介于30分钟与35分钟之间、介于30分钟与40分钟之间、介于30分钟与45分钟之间、介于35分钟与40分钟之间、介于35分钟与45分钟之间、介于35分钟与50分钟之间、介于40分钟与45分钟之间、介于40分钟与50分钟之间、介于40分钟与55分钟之间、介于45分钟与50分钟之间、介于45分钟与55分钟之间、介于45分钟与60分钟之间、介于50分钟与55分钟之间、介于50分钟与60分钟或介于55分钟与60分钟之间。在一些情况下，病毒载体(例如，编码neurod1的aav)在外科手术期间通过注射局部地施用到脑。适于通过注射和/或输注施用的组合物包含溶液和分散体以及可以由其制备对应溶液和分散体的粉末。此类组合物将包括病毒载体和至少一种合适的药学上可接受的载体。用于静脉内施用的合适的药学上可接受的载体包含但不限于抑菌水、林格氏溶液(ringer's solution)、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(pbs)和cremophor el
tm
。用于注射和/或输注的无菌
组合物可以通过将所需量的病毒载体(例如，编码neurod1的aav)引入到适当的载体中，并且然后通过过滤灭菌来制备。用于通过注射或输注施用的组合物在其制备后在储存条件下应当在延长的时间段内保持稳定。出于此目的，组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂包含但不限于氯丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞。
75.药物组合物可以被配制成用于以固体或液体形式施用，所述固体或液体形式包含但不限于无菌溶液、悬浮液、缓释调配物、片剂、胶囊、丸剂、粉末和颗粒。所述调配物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶，并且可以储存在仅需要紧接着在使用之前添加无菌液体载体(例如，注射用水)的冷冻干燥(冻干)条件下。可以由无菌粉末、微粒和片剂制备临时注射溶液和悬浮液。
76.可以用于本文所述的药物组合物中的另外的药学上可接受的载体、填充剂或媒剂包含但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、如人血清白蛋白等血清蛋白、如磷酸盐等缓冲物质、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐等电解质、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙二醇-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
77.如本文所使用的，术语“腺相关病毒颗粒”是指将其核酸基因组传递到细胞的aav病毒的包装衣壳形式。
78.含有编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸的组合物的有效量可以是改善哺乳动物(例如，人)体内的神经病症的症状而不对哺乳动物产生严重毒性的任何量。例如，编码neurod1多肽的腺相关病毒的有效量可以是为约10
10
到10
14
个腺相关病毒颗粒/毫升的浓度。在一些情况下，编码neurod1多肽的腺相关病毒的有效量可以介于10
10
个腺相关病毒颗粒/毫升与10
11
个腺相关病毒颗粒/毫升之间、介于10
10
个腺相关病毒颗粒/毫升与10
12
个腺相关病毒颗粒/毫升之间、介于10
10
个腺相关病毒颗粒/毫升与10
13
个腺相关病毒颗粒/毫升之间、介于10
11
个腺相关病毒颗粒/毫升与10
12
个腺相关病毒颗粒/毫升之间、介于10
11
个腺相关病毒颗粒/毫升与10
13
个腺相关病毒颗粒/毫升之间、介于10
11
个腺相关病毒颗粒/毫升与10
14
个腺相关病毒颗粒/毫升之间、介于10
12
个腺相关病毒颗粒/毫升与10
13
个腺相关病毒颗粒/毫升之间、介于10
12
个腺相关病毒颗粒/毫升与10
14
个腺相关病毒颗粒/毫升之间或介于10
13
个腺相关病毒颗粒/毫升与10
14
个腺相关病毒颗粒/毫升之间。如果特定哺乳动物对特定量没有反应，则可以增加编码neurod1多肽的aav的量。与待施用的病毒载体(例如，具有编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸的aav)的量相关的因素是例如病毒载体的施用途径、疾病的性质和严重性、所治疗的患者的疾病史以及待治疗的患者的年龄、体重、身高和健康状况。在一些情况下，实现治疗效果所需的转基因的表达水平、患者的免疫应答以及基因产物的稳定性与待施用的量相关。在一些情况下，病毒载体(例如，具有编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸的aav)的施用以导致脑中的功能障碍或疾病完全或基本上完全愈合的量发生。
79.在一些情况下，含有编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸的组合物的有效量可以是以约0.1微升/分钟到约5微升/分钟的受控流速施用的任何量。
80.在一些情况下，所述受控流速介于0.1微升/分钟与0.2微升/分钟之间、介于0.1微升/分钟与0.3微升/分钟之间、介于0.1微升/分钟与0.4微升/分钟之间、介于0.2微升/分钟
与0.3微升/分钟之间、介于0.2微升/分钟与0.4微升/分钟之间、介于0.2微升/分钟与0.5微升/分钟之间、介于0.3微升/分钟与0.4微升/分钟之间、介于0.3微升/分钟与0.5微升/分钟之间、介于0.3微升/分钟与0.6微升/分钟之间、介于0.4微升/分钟与0.5微升/分钟之间、介于0.4微升/分钟与0.6微升/分钟之间、介于0.4微升/分钟与0.7微升/分钟之间、介于0.5微升/分钟与0.6微升/分钟之间、介于0.5微升/分钟与0.7微升/分钟之间、介于0.5微升/分钟与0.8微升/分钟之间、介于0.6微升/分钟与0.7微升/分钟之间、介于0.6微升/分钟与0.8微升/分钟之间、介于0.6微升/分钟与0.9微升/分钟之间、介于0.7微升/分钟与0.8微升/分钟之间、介于0.7微升/分钟与0.9微升/分钟之间、介于0.7微升/分钟与1.0微升/分钟之间、介于0.8微升/分钟与0.9微升/分钟之间、介于0.8微升/分钟与1.0微升/分钟之间、介于0.8微升/分钟与1.1微升/分钟之间、介于0.9微升/分钟与1.0微升/分钟之间、介于0.9微升/分钟与1.1微升/分钟之间、介于0.9微升/分钟与1.2微升/分钟之间、介于1.0微升/分钟与1.1微升/分钟之间、介于1.0微升/分钟与1.2微升/分钟之间、介于1.0微升/分钟与1.3微升/分钟之间、介于1.1微升/分钟与1.2微升/分钟之间、介于1.1微升/分钟与1.3微升/分钟之间、介于1.1微升/分钟与1.4微升/分钟之间、介于1.2微升/分钟与1.3微升/分钟之间、介于1.2微升/分钟与1.4微升/分钟之间、介于1.2微升/分钟与1.5微升/分钟之间、介于1.3微升/分钟与1.4微升/分钟之间、介于1.3微升/分钟与1.5微升/分钟之间、介于1.3微升/分钟与1.6微升/分钟之间、介于1.4微升/分钟与1.5微升/分钟之间、介于1.4微升/分钟与1.6微升/分钟之间、介于1.4微升/分钟与1.7微升/分钟之间、介于1.5微升/分钟与1.6微升/分钟之间、介于1.5微升/分钟与1.7微升/分钟之间、介于1.5微升/分钟与1.8微升/分钟之间、介于1.6微升/分钟与1.7微升/分钟之间、介于1.6微升/分钟与1.8微升/分钟之间、介于1.6微升/分钟与1.9微升/分钟之间、介于1.7微升/分钟与1.8微升/分钟之间、介于1.7微升/分钟与1.9微升/分钟之间、介于1.7微升/分钟与2.0微升/分钟之间、介于1.8微升/分钟与1.9微升/分钟之间、介于1.8微升/分钟与2.0微升/分钟之间、介于1.8微升/分钟与2.1微升/分钟之间、介于1.9微升/分钟与2.0微升/分钟之间、介于1.9微升/分钟与2.1微升/分钟之间、介于1.9微升/分钟与2.2微升/分钟之间、介于2.0微升/分钟与2.1微升/分钟之间、介于2.0微升/分钟与2.2微升/分钟之间、介于2.0微升/分钟与2.3微升/分钟之间、介于2.1微升/分钟与2.2微升/分钟之间、介于2.1微升/分钟与2.3微升/分钟之间、介于2.1微升/分钟与2.4微升/分钟之间、介于2.2微升/分钟与2.3微升/分钟之间、介于2.2微升/分钟与2.4微升/分钟之间、介于2.2微升/分钟与2.5微升/分钟之间、介于2.3微升/分钟与2.4微升/分钟之间、介于2.3微升/分钟与2.5微升/分钟之间、介于2.3微升/分钟与2.6微升/分钟之间、介于2.4微升/分钟与2.5微升/分钟之间、介于2.4微升/分钟与2.6微升/分钟之间、介于2.4微升/分钟与2.7微升/分钟之间、介于2.5微升/分钟与2.6微升/分钟之间、介于2.5微升/分钟与2.7微升/分钟之间、介于2.5微升/分钟与2.8微升/分钟之间、介于2.6微升/分钟与2.7微升/分钟之间、介于2.6微升/分钟与2.8微升/分钟之间、介于2.6微升/分钟与2.9微升/分钟之间、介于2.7微升/分钟与2.8微升/分钟之间、介于2.7微升/分钟与2.9微升/分钟之间、介于2.7微升/分钟与3.0微升/分钟之间、介于2.8微升/分钟与2.9微升/分钟之间、介于2.8微升/分钟与3.0微升/分钟之间、介于2.8微升/分钟与3.1微升/分钟之间、介于2.9微升/分钟与3.0微升/分钟之间、介于2.9微升/分钟与3.1微升/分钟之间、介于2.9微升/分钟与3.2微升/分钟之间、介于3.0微升/分钟与3.1微升/分钟之间、介于3.0微升/分钟与3.2微升/分钟之间、介于3.0微
升/分钟与3.3微升/分钟之间、介于3.1微升/分钟与3.2微升/分钟之间、介于3.1微升/分钟与3.3微升/分钟之间、介于3.1微升/分钟与3.4微升/分钟之间、介于3.2微升/分钟与3.3微升/分钟之间、介于3.2微升/分钟与3.4微升/分钟之间、介于3.2微升/分钟与3.5微升/分钟之间、介于3.3微升/分钟与3.4微升/分钟之间、介于3.3微升/分钟与3.5微升/分钟之间、介于3.3微升/分钟与3.6微升/分钟之间、介于3.4微升/分钟与3.5微升/分钟之间、介于3.4微升/分钟与3.6微升/分钟之间、介于3.4微升/分钟与3.7微升/分钟之间、介于3.5微升/分钟与3.6微升/分钟之间、介于3.5微升/分钟与3.7微升/分钟之间、介于3.5微升/分钟与3.8微升/分钟之间、介于3.6微升/分钟与3.7微升/分钟之间、介于3.6微升/分钟与3.8微升/分钟之间、介于3.6微升/分钟与3.9微升/分钟之间、介于3.7微升/分钟与3.8微升/分钟之间、介于3.7微升/分钟与3.9微升/分钟之间、介于3.7微升/分钟与4.0微升/分钟之间、介于3.8微升/分钟与3.9微升/分钟之间、介于3.8微升/分钟与4.0微升/分钟之间、介于3.8微升/分钟与4.1微升/分钟之间、介于3.9微升/分钟与4.0微升/分钟之间、介于3.9微升/分钟与4.1微升/分钟之间、介于3.9微升/分钟与4.2微升/分钟之间、介于4.0微升/分钟与4.1微升/分钟之间、介于4.0微升/分钟与4.2微升/分钟之间、介于4.0微升/分钟与4.3微升/分钟之间、介于4.1微升/分钟与4.2微升/分钟之间、介于4.1微升/分钟与4.3微升/分钟之间、介于4.1微升/分钟与4.4微升/分钟之间、介于4.2微升/分钟与4.3微升/分钟之间、介于4.2微升/分钟与4.4微升/分钟之间、介于4.2微升/分钟与4.5微升/分钟之间、介于4.3微升/分钟与4.4微升/分钟之间、介于4.3微升/分钟与4.5微升/分钟之间、介于4.3微升/分钟与4.6微升/分钟之间、介于4.4微升/分钟与4.5微升/分钟之间、介于4.4微升/分钟与4.6微升/分钟之间、介于4.4微升/分钟与4.7微升/分钟之间、介于4.5微升/分钟与4.6微升/分钟之间、介于4.5微升/分钟与4.7微升/分钟之间、介于4.5微升/分钟与4.8微升/分钟之间、介于4.6微升/分钟与4.7微升/分钟之间、介于4.6微升/分钟与4.8微升/分钟之间、介于4.6微升/分钟与4.9微升/分钟之间、介于4.7微升/分钟与4.8微升/分钟之间、介于4.7微升/分钟与4.9微升/分钟之间、介于4.7微升/分钟与5.0微升/分钟之间、4.8微升/分钟与4.9微升/分钟之间、介于4.8微升/分钟与5.0微升/分钟之间或介于4.9微升/分钟与5.0微升/分钟之间。
81.病毒载体(例如，具有编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的核酸的aav)可以以对应于在约1.0
×
10
10
到约1.0
×
10
14
vg/kg(病毒基因组每kg体重)范围内的病毒剂量的量施用。在一些情况下，病毒载体(例如，具有编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的核酸的aav)可以以对应于在约1.0
×
10
11
到约1.0
×
10
12
vg/kg范围内、约5.0
×
10
11
到约5.0
×
10
12
vg/kg范围内或约1.0
×
10
12
到约5.0
×
10
11
范围内的病毒剂量的量施用。在一些情况下，病毒载体(例如，具有编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的核酸的aav)以对应于约2.5
×
10
12
vg/kg的剂量的量施用。在一些情况下，病毒载体(例如，具有编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的核酸的aav)的有效量可以是约1μl到约500μl的体积，对应于本文所述的vg/kg(病毒基因组每kg体重)剂量的体积。
82.在一些情况下，病毒载体的所施用的有效体积介于1μl与25μl之间、介于1μl与50μl之间、介于1μl与75μl之间、介于25μl与50μl之间、介于25μl与75μl之间、介于25μl与100μl之间、介于50μl与75μl之间、介于50μl与100μl之间、介于50μl与125μl之间、介于75μl与100μl之间、介于75μl与125μl之间、介于75μl与150μl之间、介于100μl与125μl之间、介于100μl与150μl之间、介于100μl与175μl之间、介于125μl与150μl之间、介于125μl与175μl之间、介
于125μl与200μl之间、介于150μl与175μl之间、介于150μl与200μl之间、介于150μl与225μl之间、介于175μl与200μl之间、介于175μl与225μl之间、介于175μl与250μl之间、介于200μl与225μl之间、介于200μl与250μl之间、介于200μl与275μl之间、介于225μl与250μl之间、介于225μl与275μl之间、介于225μl与300μl之间、介于250μl与275μl之间、介于250μl与300μl之间、介于250μl与325μl之间、介于275μl与300μl之间、介于275μl与325μl之间、介于275μl与350μl之间、介于300μl与325μl之间、介于300μl与350μl之间、介于300μl与375μl之间、介于325μl与350μl之间、介于325μl与375μl之间、介于325μl与400μl之间、介于350μl与375μl之间、介于350μl与400μl之间、介于350μl与425μl之间、介于375μl与400μl之间、介于375μl与425μl之间、介于375μl与450μl之间、介于400μl与425μl之间、介于400μl与450μl之间、介于400μl与475μl之间、介于425μl与450μl之间、介于425μl与475μl之间、介于425μl与500μl之间、介于450μl与475μl之间、介于450μl与500μl之间或介于475μl与500μl之间。
83.在一些情况下，待施用的病毒载体(例如，具有编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸的aav)的量是根据一个或多个转基因(例如，neurod1)的表达的强度来调整的。
84.在一些情况下，通过在普遍存在的(组成型)启动子或神经元特异性启动子的转录控制下将包含编码neurod1的核酸的腺相关病毒载体连同编码位点特异性重组酶的腺相关病毒一起通过立体定向注射递送到受试者的脑中，其中编码neurod1的dna序列被反向并且以错误的定向进行neurod1的表达，并且进一步包含位点特异性重组酶的重组酶活性的位点，直到所述位点特异性重组酶使编码neurod1的反向dna序列反向，由此允许neurod1的表达。
85.在一些情况下，通过在普遍存在的(组成型)启动子或神经元特异性启动子的转录控制下将包含编码neurod1的核酸的腺相关病毒载体连同根据一些方面的编码cns中的正常血流的中断区域中或中断位点处的位点特异性重组酶的腺相关病毒一起通过立体定向注射递送到受试者的脑中，其中编码neurod1的dna序列被反向并且以错误的定向进行neurod1的表达，并且进一步包含位点特异性重组酶的重组酶活性的位点，直到所述位点特异性重组酶使编码neurod1的反向dna序列反向，由此允许neurod1的表达。任选地，立体定向注射的位点位于由cns中的正常血流的中断引起的胶质瘢痕中或附近。
86.在一些情况下，位点特异性重组酶是cre重组酶，并且重组酶活性的位点是识别位点loxp和lox2272位点。
87.在一些情况下，在治疗期间或之后监测受试者的neurod1治疗，从而监测治疗的进展和/或最终结果。通过恢复或接近恢复正常的电生理学、血流、组织结构和功能来诊断用于成功的神经元细胞整合和组织微环境的恢复的治疗后测定。测定神经功能的非侵入性方法包含eeg。血流可以通过近红外光谱和fmri进行非侵入性地测定。用于测定组织结构的非侵入性方法包含mri、cat扫描、pet扫描或超声。行为测定可以用于非侵入性测定脑功能的恢复。行为测定应当与由原始脑损伤引起的功能丧失相匹配。例如，如果损伤引起瘫痪，则应测试患者的移动性和肢体灵活性。如果损伤引起语音的丧失或减慢，则应测定患者通过口头语言进行交流的能力。neurod1治疗后正常行为的恢复表明有效神经元回路的成功产生和整合。这些方法可以单独地使用或以任何组合使用，以测定神经功能和组织健康。用于评估治疗的测定可以在neurod1治疗后的任何时间点进行，例如1天、2天、3天、一周、2周、3
周、一个月、两个月、三个月、六个月、一年或更晚。此类测定可以在neurod1治疗之前进行，以便在需要时建立基线比较。
88.本文所使用的科学和技术术语旨在具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。发现在各种标准参考文献的上下文中限定并使用此类术语，这些参考文献说明性地包含以下：j.sambrook和d.w.russell,《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratorymanual)》,冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press)；第3版,2001；f.m.asubel编辑,《精编分子生物学实验指南(short protocols in molecular biology)》,《实验室指南(current protocols)》；第5版,2002；b.alberts等人,《细胞分子生物学(molecular biology of the cell)》,第4版,加兰科学出版社(garland),2002；d.l.nelson和m.m.cox,《生物化学原理(lehninger principles of biochemistry)》,第4版,w.h.弗里曼公司(w.h.freeman&company),2004；engelke,d.r.,《rna干扰(rnai)：rnai技术的具体细节(rna interference(rnai):nuts and bolts of rnai technology)》,宾夕法尼亚州伊格尔维尔的dna出版社有限责任公司(dna press llc,eagleville,pa),2003；herdewijn,p.(编辑),《寡核苷酸合成：方法与应用(oligonucleotide synthesis:methods and applications)》,《分子生物学方法(methods in molecular biology)》,胡马纳出版社(humana press),2004；a.nagy、m.gertsenstein、k.vintersten、r.behringer,《操纵小鼠胚胎：实验室手册(manipulating the mouse embryo:a laboratory manual)》,冷泉港实验室出版社,第3版；2002年12月15日,isbn-10:0879695919；kursad turksen(编辑),《胚胎干细胞：分子生物学方法中的方法和方案(embryonic stem cells:methods and protocols in methods in molecular biology)》2002；185,胡马纳出版社：《干细胞生物学实验指南(current protocols in stem cell biology)》,isbn:9780470151808。
89.如本文所使用的，单数术语“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”不旨在是限制性的，并且包含复数指示物，除非另外明确地陈述或上下文另外清楚地指示。
90.如本文所使用的，术语“neurod1蛋白”是指参与胚胎脑发育和成人神经发生的bhlh促神经原转录因子，参见cho等人,《分子神经生物学(mol.neurobiol.)》,30:35-47(2004)；kuwabara等人,《自然神经科学(nature neurosci.)》,12:1097-1105(2009)；以及gao等人,《自然神经科学》,12:1090-1092(2009)。neurod1在发育后期表达，主要在神经系统中表达，并且参与神经元分化、成熟和存活。
91.术语“neurod1核酸”或“外源性neurod1核酸”涵盖编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的核酸、编码在本文中被鉴定为seq id no:2的人neurod1蛋白的核酸和编码在本文中被鉴定为seq id no:4的小鼠neurod1蛋白的核酸。除了seq id no:2和seq id no:4的neurod1蛋白之外，术语“neurod1蛋白”涵盖neurod1蛋白的变体，如seq id no:2和seq id no:4的变体，所述变体可以包含在本文所述的方法中。如本文所使用的，术语“变体”是指天然存在的遗传变异和重组制备的变异，与参考neurod1蛋白(如seq id no:2或seq id no:4)相比，所述变异中的每一种在其氨基酸序列中含有一个或多个变化。此类变化包含一个或多个氨基酸残基已经通过氨基酸取代、添加或缺失进行修饰的变化。术语“变体”涵盖人neurod1，包含例如哺乳类动物和鸟neurod1的直向同源物，如但不限于来自非人灵长类动物、猫、狗、绵羊、山羊、马、牛、猪、鸟、家禽动物和啮齿动物(如但不限于小鼠和大鼠)的neurod1直向同源物。在非限制性实例中，在本文中例示为seq id no:4的氨基酸序列的小
鼠neurod1是人neurod1的直向同源物。
92.在一些情况下，优选的变体与seq id no:2或seq id no:4具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
93.可以使用如定点诱变和pcr介导的诱变等标准分子生物学技术引入突变。本领域的技术人员将认识到，可以在不改变neurod1蛋白的功能性质的情况下引入一个或多个氨基酸突变。例如，可以在不改变seq id no:2或4的neurod1蛋白的功能性质的情况下进行一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。
94.可以在neurod1蛋白中进行保守氨基酸取代以产生neurod1蛋白变体。保守氨基酸取代是本领域公认的一个氨基酸对具有类似特性的另一个氨基酸的取代。例如，每个氨基酸可以被描述为具有以下特性中的一个或多个：正电性、负电性、脂肪族、芳香族、极性、疏水性和亲水性。保守取代是具有指定结构或功能特性的一个氨基酸对具有同一特性的另一个氨基酸的取代。酸性氨基酸包含天冬氨酸和谷氨酸；碱性氨基酸包含组氨酸、赖氨酸和精氨酸；脂肪族氨基酸包含异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸；芳香族氨基酸包含苯丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸和色氨酸；极性氨基酸包含天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；并且疏水性氨基酸包含丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、缬氨酸和色氨酸；并且保守取代包含每组内的氨基酸之间的取代。氨基酸也可以根据相对大小来描述；丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸和缬氨酸各自通常被认为是小的。
95.neurod1变体可以包含合成氨基酸类似物、氨基酸衍生物和/或非标准氨基酸，说明性地包含但不限于α-氨基丁酸、瓜氨酸、刀豆氨酸、氰基丙氨酸、二氨基丁酸、二氨基庚二酸、二羟基-苯丙氨酸、黎豆氨酸、高精氨酸、羟脯氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、3-磷酸丝氨酸、高丝氨酸、5-羟色氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸和鸟氨酸。
96.为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，出于最佳比较目的对序列进行比对(例如，可以在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入空位，以与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后将对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列中的位置被与在第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则这些分子在所述位置处是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数量的函数(即，同一性％＝相同重叠位置的数量/位置总数
×
100％)。在一个实施例中，两个序列的长度相同。
97.两个序列之间的同一性百分比的确定也可以使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的优选的非限制性实例是karlin和altschul的算法,《美国国家科学院院刊(pnas)》,87:2264-2268(1990)，所述文献被修改为karlin和altschul,《美国国家科学院院刊》,90:5873-5877(1993)。将这种算法并入到altschul等人,《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》,215:403(1990)的nblast和xblast程序中。用nblast核苷酸程序参数集(例如，分数＝100，字长＝12)执行blast核苷酸搜索，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。
98.用xblast程序参数集(例如，分数50，字长＝3)执行blast蛋白搜索，以获得与本文所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有空位的比对，利用如在altschul等人,《核酸研究(nucleic acids res)》,25:3389-3402(1997))中所描述的空位
的blast。可替代地，psi blast用于执行检测分子之间的距离关系的迭代搜索。当利用blast、有空位的blast和psi blast程序时，使用相应程序(例如，xblast和nblast)的默认参数(参见，例如，ncbi网站)。
99.用于序列比较的数学算法的另一个优选的非限制性实例是myers和miller的算法,cabios,4:11-17(1988)。将这种算法并入到align程序(第2.0版)中，所述程序是gcg序列比对软件包的一部分。当利用align程序比较氨基酸序列时，使用pam120权重残基表、空位长度罚分12以及空位罚分4。
100.在容许或不容许空位的情况下，使用类似于以上所述的那些技术的技术，确定两个序列之间的同一性百分比。在计算同一性百分比时，通常仅对确切的匹配进行计数。
101.术语“neurod1蛋白”涵盖在本文所述的方法和组合物中可操作的neurod1蛋白的片段，如seq id no:2和4的片段及其变体。
102.neurod1蛋白和核酸可以从天然来源分离，如生物体的脑或表达neurod1的细胞系的细胞。可替代地，可以重组地产生neurod1蛋白或核酸，如通过使用表达构建体在体外或体内进行表达。neurod1蛋白和核酸也可以通过熟知的方法来合成。
103.可以使用重组核酸技术来产生包含在方法和组合物中的neurod1。重组neurod1生产包含将涵盖编码neurod1的dna序列的重组表达载体引入到宿主细胞中。
104.根据一些实施例，引入到宿主细胞中以产生neurod1的编码neurod1的核酸序列编码seq id no:2、seq id no:4或其变体。
105.在一些情况下，在本文中被鉴定为seq id no:1的核酸序列编码seq id no:2并且包含在表达载体中并且被表达以产生neurod1。根据一些方面，在本文中被鉴定为seq id no:3的核酸序列编码seq id no:4并且包含在表达载体中并且被表达以产生neurod1。
106.应当理解，由于遗传密码的简并性质，与seq id no:1和3基本上相同的核酸序列编码neurod1和neurod1的变体，并且这些替代性核酸可以包含在表达载体中并且被表达以产生neurod1和neurod1的变体。本领域的技术人员将理解，编码neurod1蛋白的核酸的片段可以用于产生neurod1蛋白的片段。
107.表达载体可以含有核酸，所述核酸包含编码所关注多肽的区段，所述所关注多肽与提供编码所关注多肽的区段的转录的一个或多个调控元件可操作地连接。如本文所使用的术语“可操作地连接”是指与第二核酸有功能关系的核酸。术语“可操作地连接”涵盖两个或更多个核酸分子(如待转录的核酸和调控元件)的功能连接。如本文所使用的术语“调控元件”是指控制可操作地连接的核酸的表达的一些方面的核苷酸序列。示例性调控元件包含增强子，如但不限于：土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)；内部核糖体进入位点(ires)或2a结构域；内含子；复制起点；聚腺苷酸化信号(pa)；启动子；转录终止序列；以及上游调控结构域，其有助于可操作地连接的核酸序列的复制、转录、转录后加工。本领域的普通技术人员能够在不超过常规实验的情况下选择和使用表达载体中的这些和其它调控元件。
108.如本文所使用的术语“启动子”是指与如编码neurod1的核酸序列等待转录的核酸序列可操作地连接的dna序列。启动子通常定位在待转录的核酸序列的上游，并且并且提供用于通过rna聚合酶和其它转录因子特异性结合的位点。在具体实施例中，启动子通常定位在被转录以产生期望分子的核酸序列的上游，并且提供由rna聚合酶和其它转录因子特异
性结合的位点。
109.如本领域的技术人员将认识到的，基因的5'非编码区可以被分离并且以其整体用作用于驱动可操作地连接的核酸的表达的启动子。可替代地，5'非编码区的一部分可以被分离并且用于驱动可操作地连接的核酸的表达。通常，基因的5'非编码区的约500-6000bp用于驱动可操作地连接的核酸的表达。任选地，使用基因的5'非编码区的含有驱动可操作地连接的核酸的表达所需的最小量的5'非编码区的部分。用于确定基因的5'非编码区的指定部分驱动可操作连接的核酸表达的能力的测定是本领域熟知的。
110.根据本文所述的方法，用于驱动neurod1表达的特定启动子是“普遍存在的”或“组成型”启动子，其驱动表达载体被转移到其中的生物体的许多、大多数或所有细胞类型中的表达。可以用于neurod1的表达的普遍存在的启动子的非限制性实例是巨细胞病毒启动子；猿猴病毒40(sv40)早期启动子；劳斯氏肉瘤病毒启动子(rous sarcoma virus promoter)；腺病毒主要晚期启动子；β肌动蛋白启动子；甘油醛3-磷酸脱氢酶；葡萄糖调控蛋白78启动子；葡萄糖调控蛋白94启动子；热休克蛋白70启动子；β驱动蛋白启动子；rosa启动子；泛素b启动子；真核起始因子4a1启动子和延长因子i启动子；所有这些启动子在本领域中都是熟知的并且可以使用常规方法从主要来源分离或从商业来源获得。启动子可以完全源自单个基因或者可以是嵌合的，具有源自多于一个基因的部分。
111.调控序列的组合可以包含在表达载体中并且用于驱动neurod1的表达。包含在表达载体中以驱动neurod1的表达的非限制性实例是cag启动子，所述启动子组合了巨细胞病毒cmv早期增强子元件和鸡β-肌动蛋白启动子。
112.根据本文所述的方法，用于驱动neurod1的表达的特定启动子是优先驱动胶质细胞，特别是星形胶质细胞和/或ng2细胞中的表达的启动子。这种启动子被称为“星形胶质细胞特异性”和/或“ng2细胞特异性”启动子。
113.星形胶质细胞特异性启动子的非限制性实例是胶质原纤维酸性蛋白(gfap)启动子和醛脱氢酶1家族成员l1(aldh1l1)启动子。人gfap启动子在本文中被示出为seq id no:6。小鼠aldh1l1启动子在本文中被示出为seq id no:7。
114.ng2细胞特异性启动子的非限制性实例是硫酸软骨素蛋白聚糖4基因的启动子，也称为神经元-胶质抗原2(ng2)。人ng2启动子在本文中被示出为seq id no:8。
115.根据本文所述的方法，用于驱动neurod1的表达的特定启动子是优先驱动反应性胶质细胞，特别是反应性星形胶质细胞和/或反应性ng2细胞中的表达的启动子。这种启动子被称为“反应性星形胶质细胞特异性”和/或“反应性ng2细胞特异性”启动子。
[0116]“反应性星形胶质细胞特异性”启动子的非限制性实例是脂质运载蛋白2(lcn2)基因的启动子。小鼠lcn2启动子在本文中被示出为seq id no:5。
[0117]
普遍存在的启动子和细胞类型特异性启动子的同源物和变体可以用于表达neurod1。
[0118]
在一些情况下，启动子同源物和启动子变体可以包含在用于表达neurod1的表达载体中。术语“启动子同源物”和“启动子变体”是指与本文公开的那些启动子相比，具有基本上类似的功能性质以在编码neurod1的可操作地连接的核酸上赋予期望的表达类型，如neurod1的细胞类型特异性表达或neurod1的普遍存在表达的启动子。例如，与gfap、s100b、aldh1l1、ng2、lcn2和cag启动子相比，启动子同源物或变体具有基本上类似的功能性质以
在编码neurod1的可操作地连接的核酸上赋予细胞类型特异性表达。
[0119]
本领域的技术人员将认识到，可以在不改变给定启动子的功能性质的情况下引入一个或多个核酸突变。可以使用如定点诱变和pcr介导的诱变等标准分子生物学技术引入突变，以产生启动子变体。如本文所使用的，术语“启动子变体”是指参考启动子，如但不限于gfap、s100b、aldh1l1、ng2、lcn2和pcag启动子的分离的天然存在的或重组制备的变体。
[0120]
本领域已知来自其它物种的启动子是具有功能的；例如，小鼠aldh1l1启动子在人细胞中具有功能。可以使用本领域已知的生物信息学工具鉴定来自其它物种的同源物和同源启动子，参见例如，xuan等人,《基因组生物学(genome biol)》,6:r72(2005)；zhao等人,《核酸研究》,33:d103-107(2005)；以及halees等人,《核酸研究》,31:3554-3559(2003)。
[0121]
在结构上，neurod1的细胞类型特异性启动子和/或普遍存在的启动子的同源物和变体与参考发育调节的和/或普遍存在的启动子具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的核酸序列同一性，并且包含用于结合rna聚合酶的位点以及任选地用于转录因子的一个或多个结合位点。
[0122]
与seq id no:1或seq id no:3基本上相同的核酸序列的特征在于具有能够在高严格性杂交条件下与seq id no:1或seq id no:3杂交的互补核酸序列。
[0123]
除了编码neurod1的一个或多个核酸之外，编码另外的蛋白质的一个或多个核酸序列可以包含在表达载体中。例如，此类另外的蛋白质包含非neurod1蛋白，如包含但不限于β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白的报告基因以及抗生素抗性报告基因。
[0124]
在特定实施例中，重组表达载体编码至少seq id no:2的neurod1、与seq id no:2具有至少95％同一性的蛋白质或由与seq id no:1基本上相同的核酸序列编码的蛋白质。
[0125]
在特定实施例中，重组表达载体编码至少seq id no:4的neurod1、与seq id no:4具有至少95％同一性的蛋白质或由与seq id no:2基本上相同的核酸序列编码的蛋白质。
[0126]
seq id no:9是包含与编码neurod1的核酸可操作地连接的cag启动子并且进一步包含编码egfp和增强子wpre的核酸序列的核酸的实例。ires将编码neurod1的核酸与编码egfp的核酸分离。将seq id no:9插入到表达载体中，以便表达neurod1和报告基因egfp。任选地，去除ires以及编码egfp的核酸，并且将剩余cag启动子以及编码neurod1的可操作地连接的核酸插入到表达载体中，以便表达neurod1。可以任选地包含wpre或另一种增强子。
[0127]
任选地，报告基因包含在编码neurod1的重组表达载体中。可以包含报告基因以产生肽或蛋白质，所述肽或蛋白质用作从重组表达载体表达neurod1的替代标志物。如本文所使用的术语“报告基因”是指当通过例如化学发光、荧光、比色反应、抗体结合、诱导型标志物和/或配体结合测定表达时易于检测的基因。示例性报告基因包含但不限于绿色荧光蛋白(gfp)、增强型绿色荧光蛋白(egfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、增强型黄色荧光蛋白(eyfp)、青色荧光蛋白(cfp)、增强型青色荧光蛋白(ecfp)、蓝色荧光蛋白(bfp)、增强型蓝色荧光蛋白(ebfp)、mmgfp(zernicka-goetz等人,《发育(development)》,124:1133-1137(1997))、dsred、荧光素酶和β-半乳糖苷酶(lacz)。
[0128]
将遗传物质引入到接受者宿主细胞中的过程，如用于在宿主细胞中瞬时或稳定表达由遗传物质编码的期望蛋白质的过程被称为“转染”。转染技术是本领域熟知的，并且包含但不限于电穿孔、颗粒加速转化(也称为“基因枪”技术)、脂质体介导的转染、磷酸钙或氯
化钙共沉淀介导的转染、deae-葡聚糖介导的转染、显微注射、聚乙二醇介导的转染、热休克介导的转染和病毒介导的转染。如本文所述，病毒介导的转染可以使用病毒载体，如源自腺病毒、腺相关病毒和慢病毒的病毒载体来完成。
[0129]
任选地，将宿主细胞离体转染并且然后重新引入到宿主生物体中。例如，可以从受试者体内去除细胞或组织，用编码neurod1的表达载体转染，并且然后返回到受试者。
[0130]
将包含编码neurod1或其功能片段的核酸的重组表达载体在体外或体内引入到宿主胶质细胞中，以便在宿主胶质细胞中表达外源性neurod1多肽，从而将胶质细胞转化成神经元是通过各种转染方法中的任何一种来实现的。
[0131]
编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸在宿主胶质细胞中的表达使胶质细胞转化成神经元任选地通过将编码neurod1或其功能片段的mrna在体外或体内引入到宿主胶质细胞来实现。
[0132]
编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸在宿主胶质细胞中的表达使胶质细胞转化成神经元任选地通过将neurod1蛋白在体外或体内引入到宿主胶质细胞来实现。这些和其它技术的细节是本领域已知的，例如，如以下文献中所描述的：j.sambrook和d.w.russell,《分子克隆：实验室手册》,冷泉港实验室出版社；第3版,2001；f.m.ausubel编辑,《精编分子生物学实验指南》,《实验室指南》；第5版,2002；以及engelke,d.r.,《rna干扰(rnai)：rnai技术的具体细节》,宾夕法尼亚州伊格尔维尔的dna出版社有限责任公司,2003。
[0133]
将包含编码neurod1或其功能片段的核酸、编码neurod1或其功能片段的mrna和/或neurod1蛋白、全长或其功能片段在内的表达载体任选地与用于在体外或体内引入到宿主细胞中的载体缔合。
[0134]
在特定方面，载体是颗粒载体，如脂质颗粒，包含脂质体、胶束、单层或多层囊泡；聚合物颗粒，如水凝胶颗粒、聚乙醇酸颗粒或聚乳酸颗粒；无机颗粒，如磷酸钙颗粒，如例如美国专利第5,648,097号中所描述的；以及无机/有机颗粒载体，如例如美国专利第6,630,486号中所描述的。
[0135]
颗粒载体可以选自脂质颗粒；聚合物颗粒；无机颗粒；和无机/有机颗粒。颗粒类型的混合物也可以作为颗粒药学上可接受的载体被包含在内。
[0136]
颗粒载体通常被调配成使得颗粒的平均粒度在约1nm-10微米的范围内。在特定方面，颗粒载体被调配成使得颗粒的平均粒度在约1nm-100nm的范围内。
[0137]
对脂质体和与其制备和用途相关的方法的进一步描述可见于《脂质体：实用方法(liposomes:a practical approach)》(实用方法系列,264),v.p.torchilin和v.weissig(编辑),牛津大学出版社(oxford university press)；第2版,2003。在moghimi等人,《美国实验生物学学会联合会杂志(faseb j.)》,19:311-30(2005)中描述了纳米颗粒的另外的方面。
[0138]
使用重组表达载体表达neurod1是通过将表达载体引入到真核或原核宿主细胞表达系统，如昆虫细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞或本领域公认的任何其它单细胞或多细胞生物体中来完成的。宿主细胞任选地是原代细胞或永生化源性细胞。永生化细胞是可以在体外维持至少5次复制传代的细胞。
[0139]
在产生neurod1的条件下维持含有重组表达载体的宿主细胞。可以使用已知的细
胞培养技术培养和维持宿主细胞，所述细胞培养技术如celis,julio编辑,1994,《细胞生物学实验室手册(cell biology laboratory handbook),纽约的学术出版社(academic press,n.y.)中所述。本领域的技术人员可以选择和优化这些细胞的各种培养条件，包含关于特定营养物、氧气、张力、二氧化碳和降低的血清水平的培养基调配物。
[0140]
在一些情况下，将包含编码neurod1的核酸的重组表达载体引入到受试者的胶质细胞中。编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸在胶质细胞中的表达使胶质细胞“转化”成神经元。
[0141]
在一些情况下，将包含编码neurod1或其功能片段的核酸的重组表达载体引入到受试者的星形胶质细胞中。编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸在胶质细胞中的表达使星形胶质细胞“转化”成神经元。
[0142]
在一些情况下，将包含编码neurod1或其功能片段的核酸的重组表达载体引入到受试者的反应性星形胶质细胞中。编码neurod1多肽(或其生物活性片段)或其功能片段的外源性核酸在反应性星形胶质细胞中的表达使反应性星形胶质细胞“转化”成神经元。
[0143]
在一些情况下，将包含编码neurod1或其功能片段的核酸的重组表达载体引入到受试者的ng2细胞中。编码neurod1多肽(或其生物活性片段)或其功能片段的外源性核酸在ng2细胞中的表达使ng2细胞“转化”成神经元。
[0144]
在引入包含编码外源性neurod1多肽或其功能片段的核酸的重组表达载体之后，检测外源性neurod1多肽(或其生物活性片段)的表达是使用各种标准方法中的任何一种来完成的，所述标准方法包含但不限于用于检测neurod1的免疫测定、用于检测neurod1核酸的核酸测定以及检测与编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸共表达的报告基因。
[0145]
术语“转化(conversion)”和“转化的(converted)”在本文中用于描述neurod1或其功能片段的表达导致胶质细胞、星形胶质细胞或反应性星形胶质细胞表型改变为神经元表型的作用。类似地，短语“neurod1转化的神经元”和“经转化的神经元”在本文中用于指代包含具有随之发生的神经元表型的外源性neurod1蛋白或其功能片段的细胞。
[0146]
术语“表型”是指本文所提及的细胞的熟知的可检测特性。神经元表型可以是但不限于以下的一种或多种：神经元形态、一种或多种神经元标志物的表达、神经元的电生理学特性、突触形成和神经递质的释放。例如，神经元表型涵盖但不限于：神经元的特征性形态方面，如树突、轴突和树突脊的存在；特征性神经元蛋白表达和分布，如在突触点中存在突触蛋白和在树突中存在map2；以及特征性电生理体征，如自发和诱发突触事件。
[0147]
在另外的实例中，如星形胶质细胞表型和反应性星形胶质细胞表型等胶质表型涵盖但不限于：星形胶质细胞和反应性星形胶质细胞的特征性形态方面，如通常“星形”形态；以及特征性星形胶质细胞和反应性星形胶质细胞蛋白表达，如胶质原纤维酸性蛋白(gfap)的存在。
[0148]
术语“核酸”是指具有多于一个核苷酸的任何形式的rna或dna分子，包含单链、双链、寡核苷酸或多核苷酸。术语“核苷酸序列”是指单链形式的核酸中的寡核苷酸或多核苷酸中的核苷酸的排序。
[0149]
术语“neurod1核酸”是指分离的neurod1核酸分子，并且涵盖具有与seq id no:1或seq id no:3中所示的dna序列或其互补体或其片段具有至少70％、75％、80％、85％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的分离的neurod1核酸，或具有在高严格性杂交条件下与seq id no:1或seq id no:3中所示的核酸、其互补体或其片段杂交的序列的分离的dna分子。
[0150]
seq id no:3的核酸是具有在高严格性杂交条件下与seq id no:1中所示的核酸杂交的序列的分离的dna分子的实例。neurod1核酸的片段是在本文所述的一个或多个方面中可操作的neurod1核酸的任何片段，包含neurod1核酸。
[0151]
能够与靶neurod1 mrna或cdna杂交的核酸探针或引物可以用于检测和/或定量编码neurod1蛋白的mrna或cdna。核酸探针可以是长度为至少10、15、30、50或100个核苷酸的寡核苷酸，并且足以在严格条件下与neurod1 mrna或cdna或其互补序列特异性杂交。核酸引物可以是长度为至少10、15或20个核苷酸的寡核苷酸，并且足以在严格条件下与mrna或cdna或其互补序列特异性杂交。
[0152]
术语“互补体”和“互补”是指核苷酸之间的沃森-克里克碱基配对(watson-crick base pairing)并且具体地是指彼此氢键键合的核苷酸，其中胸腺嘧啶或尿嘧啶残基通过两个氢键与腺嘌呤残基连接并且胞嘧啶和鸟嘌呤残基通过三个氢键连接。通常，核酸包含描述为与指定的第二核苷酸序列具有“百分比互补性”的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可以与指定的第二核苷酸序列具有80％、90％或100％互补性，这表明序列的10个核苷酸中的8个、10个核苷酸中的9个或10个核苷酸中的10个与指定的第二核苷酸序列互补。例如，核苷酸序列3'-tcga-5'与核苷酸序列5'-agct-3'是100％互补的。另外，核苷酸序列3'-tcga-与核苷酸序列5'-ttagctgg-3'的区域100％互补。
[0153]
术语“杂交”和“杂交”是指互补核酸的配对和结合。杂交在两个核酸之间以不同程度发生，这取决于如核酸的互补程度、核酸的解链温度tm以及杂交条件的严格性等因素，如本领域中熟知的。术语“杂交条件的严格性”是指杂交介质相对于如甲酰胺和登哈特氏溶液(denhardt's solution)等特定常见添加剂的温度、离子强度和组成的条件。
[0154]
与特定核酸相关的特定杂交条件的确定是常规的并且是本领域熟知的，例如，如在以下文献中所描述的：j.sambrook和d.w.russell,《分子克隆：实验室手册》,冷泉港实验室出版社；第3版,2001；以及f.m.ausubel编辑,《精编分子生物学实验指南》,《实验室指南》；第5版,2002。高严格性杂交条件是仅允许基本上互补的核酸杂交的那些条件。通常，具有约85-100％互补性的核酸被认为是高度互补的并且在高严格性条件下杂交。中间严格性条件被例示为具有中间互补性、约50-84％互补性的核酸以及具有高互补性程度的核酸杂交的条件。相反，低严格性杂交条件是具有低互补性程度的核酸杂交的条件。
[0155]
术语“特异性杂交(specific hybridization)”和“特异性杂交(specifically hybridizes)”是指特定核酸与靶核酸的杂交而不与样品中除了靶核酸之外的核酸发生实质性杂交。
[0156]
杂交和洗涤条件的严格性取决于若干因素，包含探针和靶标的tm以及杂交和洗涤条件的离子强度，如本领域技术人员熟知的。例如在以下文献中描述了杂交和用于实现期望的杂交严格性的条件：sambrook等人,《分子克隆：实验室手册》,冷泉港实验室出版社,2001；以及ausubel,f.等人(编辑),《精编分子生物学实验指南》,威利出版公司(wiley),2002。
[0157]
高严格性杂交条件的实例是长度超过约100个核苷酸的核酸在含有6x ssc、5x登
哈特氏溶液、30％甲酰胺和100微克/毫升变性鲑鱼精子的溶液中在37℃下杂交过夜，随后在0.1x ssc和0.1％sds的溶液中在60℃下洗涤15分钟。ssc是0.15m nacl/0.015m柠檬酸钠。登哈特氏溶液是0.02％牛血清白蛋白/0.02％ficoll/0.02％聚乙烯吡咯烷酮。在高严格条件下，seq id no:1和seq id no:3将与基本上相同靶标的互补体杂交，而不与不相关序列杂交。
[0158]
提供了治疗有需要的受试者的神经病状的方法，所述方法可以包含将治疗有效量的neurod1递送到受试者的中枢神经系统或外周神经系统的胶质细胞，胶质细胞中的治疗有效量的neurod1导致受试者的神经元数量比具有同一神经病状的未经治疗的受试者更多，由此神经病状得到治疗。
[0159]
反应性胶质细胞向神经元的转化还减少了与反应性胶质细胞相关的神经炎症和神经抑制因子，由此使胶质瘢痕组织更允许神经元生长，使得神经病状得以减轻。
[0160]
如本文所使用的术语“神经病状”或“神经病症”是指受试者的中枢神经系统的通过另外的神经元得以减轻、改善或预防的任何病状。导致神经元丧失或抑制和/或神经元功能丧失或抑制的损伤或疾病是通过本文所述的方法进行治疗的神经病状。
[0161]
导致谷氨酸能神经元丧失或抑制和/或谷氨酰胺能神经元功能丧失或抑制的损伤或疾病是可以如本文所述进行治疗的神经病状。其它类型的神经元的丧失或抑制，如gaba能、胆碱能、多巴胺能、去甲肾上腺素能或血清素神经元可以用类似的方法进行治疗。
[0162]
如本文所使用的术语“治疗有效量”旨在意指有效减轻、改善或预防待治疗的神经病状的症状或体征的本发明的组合物的量。在特定实施例中，治疗有效量是对具有神经病状的体征和/或症状的受试者具有有益效果的量。
[0163]
如本文所使用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”和“neurod1治疗”或语法等效物是指减轻、抑制或改善神经病状、神经病状的症状或体征以及预防神经病状的症状或体征，并且包含但不限于治疗性和/或预防性治疗。
[0164]
神经病状的体征和症状连同检测和评估此类体征和症状的方法是本领域熟知的。
[0165]
在一些情况下，可以施用针对受试者的神经病状的疗法的组合。
[0166]
根据特定方面，施用于受试者以治疗有需要的个体受试者的cns中正常血流的中断作用的另外的药剂或治疗性治疗包含治疗，如但不限于去除血凝块、促进血流、施用一种或多种抗炎剂、施用一种或多种抗氧化剂以及施用有效降低兴奋性中毒的一种或多种药剂。
[0167]
术语“受试者”是指人并且还是指非人哺乳动物，如但不限于非人灵长类动物、猫、狗、绵羊、山羊、马、牛、猪和啮齿动物，如但不限于小鼠和大鼠；以及非哺乳动物，如但不限于鸟类、家禽、爬行动物和两栖动物。
[0168]
以下实例说明了本发明组合物和方法的实施例。这些实例出于说明性目的提供，并且不认为是对本发明组合物和方法的范围的限制。
[0169]
实例
[0170]
材料和方法
[0171]
实验动物
[0172]
5xfad小鼠在人app上具有三个突变[瑞典(k670 n/m671 l)、伦敦(v717i)和佛罗里达(i716v)]并且在人ps1蛋白上具有两个突变(m146l和l286v)。这些5xfad转基因小鼠重
pbs中]：单克隆抗gad67(小鼠，1:500，密理博公司(millipore)，mab5406)；多克隆抗gaba(兔，1:1000，西格玛公司(sigma)，a2052)；单克隆抗小清蛋白(小鼠，1:2000，西格玛公司，p3088)；兔单克隆抗β淀粉样蛋白1-42(兔，1:2000，英杰公司(invitrogen)，700254)；多克隆抗胶质原纤维酸性蛋白(鸡，1:1000，密理博公司，ab5541)；多克隆抗iba1(兔，1:500，日本和光纯药株式会社(wako)，019-19741)；单克隆抗inos(小鼠，1:500，bd公司，610328)；多克隆抗gfp(鸡，1:1000，艾博抗公司(abcam)，ab13970)；单克隆抗neurod1(小鼠，1:500，艾博抗公司，ab60704)；多克隆抗il1β(兔，1:1000，艾博抗公司，ab9722)；多克隆抗map2(鸡，1:500，艾博抗公司，ab5392)；单克隆抗突触素(小鼠，1:500，密理博公司，mab368)；多克隆抗囊泡谷氨酸转运蛋白1(豚鼠，1:3000，密理博公司，ab5905)；单克隆抗神经丝200(小鼠，1:500，西格玛公司，n0142)；单克隆抗ly6c(大鼠，1:1000，艾博抗公司，ab15627)；多克隆抗aqp4(兔，1:1000，圣克鲁兹公司(santa cruz)，sc-20812)；多克隆抗双皮质素(山羊，1:500，圣克鲁兹公司，sc-8066)；抗巢蛋白(小鼠，1:500，neuromics公司(neuromics)，mo15056)；和多克隆抗ki67(兔，1:1000，艾博抗公司，ab15580)。在用pbs将样品洗涤三次之后，然后将脑切片和与alexa fluor 488(1:1000，杰克逊免疫研究公司(jackson immunoresearch))或alexa fluor647(1:1000，杰克逊免疫研究公司)缀合的适当的二级抗体在室温下温育2小时。在用pbs将切片洗涤3次之后，将脑切片用具有dapi(英杰公司，赛默飞世尔科技公司(thermo fisher scientific)，p36931)的抗褪色封固剂封固在载玻片上。对于硫黄素-s染色，根据以上所述的免疫组织化学方案对脑样品进行常见程序。在将组织切片在二级抗体中温育之后，首先将样品用含稀释的硫黄素-s的pbs(2μg/ml)在摇床上洗涤10分钟。接下来，使用pbs洗涤脑样品两次，每次10分钟。然后将样品用prolong金色防褪色封固剂(prolong gold antifade mountant)(生命科技公司(life technologies)，p36934)封固在载玻片上。用基恩士显微镜(keyence microscope)(biorevo bz9000查看器和分析器)、奥林巴斯共聚焦显微镜(olympus confocal microscope)(fv 1000)或蔡司共聚焦显微镜(zeiss confocal microscope)(由zeiss zen显微镜软件采集和处理的图像)采集荧光图像。对于每种单独的靶蛋白免疫染色，共聚焦采集参数设置保持不变。在第2章中，对于每个样品，在注射核心(其中观察到许多转化的神经元)的1000μm内的类似皮质层的3个随机位置处拍摄图像。然后将定量数据平均以表示样品。通过imagej软件在相同的设置(imagej 1.46r,wayne rasband,美国国立卫生研究院(national institutes of health,usa))下对图像进一步分析并且通过graphpad prism 6进行绘图。
[0179]
人aβelisa
[0180]
分离来自ad gg-和ad gg 同窝仔的脑的额皮质区域，并且用具有1mm pmsf蛋白酶抑制剂(赛默科技公司(thermo scientific)，36978)和蛋白酶抑制剂混合物(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，p2714)的np40细胞裂解缓冲液(英杰公司，fnn0021)裂解，随后在4℃以13,000rpm离心。收集上清液用于通过elisa测试定量分析aβ负荷。将人aβ42elisa试剂盒(英杰公司，khb3441)和人aβ40elisa试剂盒(英杰公司，khb3481)用于测量aβ水平。严格遵循elisa试剂盒的方案：首先，出于抗原结合的目的，将标准物和样品加载到用aβ抗体(包含在elisa试剂盒中)包被的板中的对应孔中。其次，在这些孔中添加人aβ42检测器抗体(或对应地，人aβ40抗体)，轻敲板以使溶液充分混合，随后在室温下在摇床上温育3小时。然后，丢弃溶液并且用1x洗涤缓冲液将孔洗涤4次。在室温下，将hrp-缀合物抗体与样品一
起温育30分钟，随后用1x洗涤缓冲液将孔洗涤4次。然后，在每个孔中施加稳定化色原，在暗处再温育30分钟。在用终止溶液处理每个孔中的样品之后，在30分钟内读取板以获得450nm处的吸光度并且产生标准曲线(spectramax plus 384酶标仪)。分析未知样品的aβ42和aβ40水平并且用450nm处的光密度值和标准梯的已知浓度进行定量。每个样品重复两次，并且分析平均值。
[0181]
脑切片电生理学
[0182]
注射后约1个月，解剖脑皮质区并且用leica振动切片机以300μm进行切片，用于脑切片记录。冷切割溶液(单位：mm)含有75蔗糖、87nacl、2.5kcl、0.5cacl2、7mgcl2、25nahco3、1.25nah2po4和20葡萄糖。将脑切片维持在含有119nacl、2.5kcl、1.25nah2po4、26nahco3、1.3mgcl2、2.5cacl2、10葡萄糖的人工脑脊液(acsf)(单位：mm)中，并且用95％o2和5％co2鼓泡。将脑切片在acsf中温育，并且然后用含有(单位：mm)135k-葡糖酸盐、10kcl、5na-磷酸肌酸、10hepes、egta、mgatp和0.5na2gtp(ph 7.3，用koh调节，290mosm/l)的移液管溶液对这些样品进行全细胞记录。将移液管电阻设定在3-5mω，将串联电阻设定在20-40mω，将电压钳的电位保持为-70mv。pclamp 9软件(加利福尼亚州帕洛阿尔托的美谷分子仪器有限公司(molecular devices,palo alto,ca))用于数据收集，并且clampfit和synaptosoft软件用于分析。按照前面的方案制备成人脑切片(ting等人,《分子生物学方法》,1183:221-242(2014))。简言之，用以下切割溶液(单位：mm)对12-14月龄的成年转基因小鼠进行经心灌注：93nmdg、93hcl、30nahco3、20hepes、15葡萄糖、12n-乙酰基-l-半胱氨酸、7mgso4、2.5kcl、1.25nah2po4、5抗坏血酸钠、3丙酮酸钠、2硫脲、0.5cacl2、ph范围为7.3-7.4、300mosmo，用95％o2/5％co2鼓泡。进一步解剖小鼠脑并在切割溶液中以300μm切割，并且在室温下温育。在切割溶液中收集脑切片并且在32-34℃下温育12-15分钟。将切片保持在具有连续95％o2/5％co2鼓泡的保持溶液(单位：mm)中：92nacl、30nahco3、20hepes、15葡萄糖、12n-乙酰基-l-半胱氨酸、2.5kcl、1.25nah2po4、5抗坏血酸钠、2硫脲、3丙酮酸钠、2mgso4和2cacl2。在保持溶液中回收样品0.5小时之后，在标准acsf(单位：mm)中进行膜片钳记录：124nacl、26nahco3、10葡萄糖、2.5kcl、1.25nah2po4、1.3mgso4和2.5cacl2。
[0183]
cdna合成和定量实时pcr
[0184]
quanta biosciences qscripttm cdna supermix用于cdna合成。为了合成cdna，对于每个样品，在20μl的总反应体积中使用1μg rna。用于合成cdna的程序设置是：25℃持续5分钟，42℃持续30分钟，85℃持续5分钟，并且保持在4℃。使用无rna酶/dna酶的h2o将cdna产物进一步稀释五倍。通过应用生物系统引物表达软件(applied biosystems primer express software)设计用于定量实时pcr的引物。将包含quanta biosciences perfectatmgreen supermix、roxtm的试剂用于本实验。在25μl的总反应体积中使用对应于1μg总rna的5μl cdna。程序参数为：95℃持续15秒和65℃持续45秒的40个pcr循环，进行扩增。在pcr循环之后，检查熔融曲线，并且测量每个靶基因的比较ct值。将gapdh用作内部对照基因，并且相对于经dmso处理的对照组中的基因表达，分析相对基因表达。对于每个样品，定量实时pcr数据具有两次重复的pcr反应。
[0185]
数据分析
[0186]
数据表示为平均值
±
平均数标准误差。在两组比较中使用斯图登氏t测试进行统计分析。应用单向anova或双向anova分析进行多个组之间的比较。将统计显著性设定为p《
0.05。在嗅觉行为测试中，为了计算交叉适应指数的f和p值，通过spss软件使用具有lsd事后测试的双向anova对数据进行分析。将统计显著性设定为p《0.05，标记为*。p《0.01，标记为**。p《0.001，标记为***。盲目地进行所有行为测试和分析。
[0187]
实例1
–
neurod1介导的星形胶质细胞到神经元转化在阿尔茨海默氏病小鼠模型中的有益效果
[0188]
反应性胶质中的neurod1过表达使得星形胶质细胞到神经元的转化在5xfad小鼠脑中高效进行
[0189]
在ad脑中，典型的标志包含胶质增生、神经元丧失、淀粉样蛋白斑和胞内神经原纤维缠结。据报道，胶质增生在人ad皮质(castillo等人,《科学报告(scientific reports)》,7:17762(2017))和ad转基因小鼠模型，如5xfad小鼠和tg2576 ad小鼠(games等人,《自然》,373:523-527(1995)；nussbaum等人,《自然》,485:651-655(2012)；以及oakley等人,《神经科学杂志》,26:10129-10140(2006))中高度增强。具体地，5xfad小鼠脑中的淀粉样蛋白沉积和胶质增生在2月龄时开始，并且在更深的皮质层和脑下脚区域大量积累。另外，在病理学进展期间，5xfad脑中的神经元数量随着年龄而减少(oakley等人,《神经科学杂志》,26:10129-10140(2006))。星形胶质细胞数量异常增加且神经元数量减少导致脑内部的神经元与星形胶质细胞之间的比率不平衡，这进一步解释了脑回路的功能障碍。因此，假设通过将反应性星形胶质细胞直接体内转化成神经元，过量的反应性星形胶质细胞将减少并且用于补充5xfad脑中的丧失的神经元。
[0190]
为了实现这一目标，设计并构建了在反应性星形胶质细胞gfap启动子(aav9-gfap-cre)的控制下表达cre的腺相关病毒血清型9(aav9)载体，连同在cag启动子(分别是aav9-cag-loxp-neurod1-p2a-gfp-loxp或aav9-cag-loxp-gfp-loxp)下表达neurod1-gfp或gfp假对照的aav9载体。因此，在gfp对照组中，仅gfp将在反应性星形胶质细胞(gfap 细胞)中过表达，而neurod1和gfp将在neurod1组中的反应性星形胶质细胞中共过表达(图1a)。对小鼠脑皮质区进行立体定向注射(坐标：l/r：
±
1.4；a/p： 1.3，dv：-1.0mm)(图1b)。在5xfad中的皮质的此子区域中，已经积累了淀粉样蛋白斑的重负荷，并且星形胶质细胞显示具有细长和较厚过程的扩增细胞体的非典型形态，从而表明星形胶质细胞在此类病理学病状中的活动过度状态。接下来，解剖脑组织样品并且进行免疫染色，以检查注射后30天5xfad小鼠脑中的注射区域中的neurod1表达水平。通过先前的数据(guo等人,《细胞干细胞》,14:188-202(2014))证实，反应性星形胶质细胞已经通过以30dpi的neurod1过表达有效地转化成神经元形态样细胞。值得注意的是，在gfp对照组中，具有gfp过表达的星形胶质细胞保持胶质形态(图1c)。为了进一步鉴定受感染细胞和经转化的细胞，分别进行反应性星形胶质细胞标志物gfap与gfp的共免疫染色、成熟神经元标志物neun(神经元核)与gfp的共免疫染色。代表性图像表明，基于大多数受感染细胞的观察结果是gfap (反应性星形胶质细胞标志物，品红色)，aav9-gfap-cre系统在星形胶质细胞中具有高特异性(图1d)。有趣的是，具有neurod1过表达的受感染反应性星形胶质细胞(当在颜色方面观察时，染色为红色)已经通过30dpi在5xfad皮质中成功地转化成成熟神经元(neun ，当在颜色方面观察时，染色为品红色)(图1e)。在电生理学研究中，记录了经转化神经元(明场相位图像，25dpi)(图1f)上的动作电位(图1g)、sepsc和sipsc(图1h)的代表性迹线。总之，上述数据证实，neurod1过表达使得能够在5xfad皮质中在1个月内以高效率从反应性星形胶质细胞直接体
内转化为成熟的和完全功能的神经元。
[0191]
neurod1介导的星形胶质细胞到神经元转化改善了5xfad小鼠脑中的星形胶质细胞的活动过度状态
[0192]
在脑中，健康的星形胶质细胞在维持和调节正常的神经元通讯、突触生理学以及能量代谢中发挥关键性作用(freeman,《科学》,330:774-778(2010))。然而，在ad脑的病理学背景中，异常的活动过度星形胶质细胞和星形胶质细胞增生已经被广泛报道(burda和sofroniew,《神经元》,81:229-248(2014))。星形胶质细胞的这些异常变化还干扰正常的脑功能和信号传导通路，包含改变谷氨酸和gaba再循环、钾缓冲以及甚至胆碱能和钙调节(osborn等人,《神经生物学进展(prog.neurobiol.)》,144:121-141(2016))。假设，通过减少5xfad小鼠脑中的反应性星形胶质细胞的数量和星形胶质细胞的活动过度状态，反应性星形胶质细胞转化成功能神经元可以有益于脑。此处，研究显示，反应性星形胶质细胞中的neurod1过表达可以有效地将反应性星形胶质细胞转化成5xfad脑中的功能成熟神经元。为了研究这种突破和切割边缘技术是否可以用作ad的潜在治疗方法，进一步检查了在由neurod1诱导的体内直接细胞转化之后的有益效果。引人注目的是，在注射后60天观察到对注射核心区域附近的反应性星形胶质细胞的若干有益效果(此处，将可以在早期时间点(约60dpi)观察到的有益效果定义为短期有益效果)(图2a和图2b)。首先，在neurod1组中反应性星形胶质细胞的数量减少，因为过量的反应性星形胶质细胞通过neurod1的过表达而转化为成熟神经元(图2c和2d：gfp对照组中的gfap 细胞数量：45.5
±
1.0；neurod1组中的gfap 细胞数量：30.3
±
1.1，n＝8，p《0.001)。其次，neurod1组中剩余的反应性星形胶质细胞显示具有较少扩增细胞体和较薄过程的形态，这表明当与gfp对照组相比时，反应性星形胶质细胞的活动过度状态得到改善(图2c-图2f：gfp对照组中的gfap 覆盖面积百分比：21.0
±
1.9；neurod1组中的gfap 覆盖面积百分比：6.4
±
1.1，n＝8，p《0.001。gfp对照组中的gfap 强度：57.2
±
4.8；neurod1组中的gfap 强度：18.3
±
3.2，n＝8，p《0.001)。
[0193]
neurod1介导的星形胶质细胞到神经元转化可以补充5xfad小鼠脑中的神经元池
[0194]
随着发现过量的反应性星形胶质细胞显著减少，还观察到neurod1介导的细胞转化组中神经元显著增加。此处，仔细检查了neurod1干预后的若干个不同的时间点(30dpi、60dpi、90dpi，数据未示出)，并且发现通过60dpi，可观察到宽神经元诱导。5xfad小鼠早在1.5个月就开始胞内β-淀粉样蛋白产生，并且在2月龄时开始发展胞外淀粉样蛋白斑。到6月龄时，淀粉样蛋白斑的重负荷沉积在整个5xfad小鼠脑的皮质中，从而导致神经元逐渐丧失。当与gfp对照组相比时，neurod1组显示出经处理的脑区中的神经元数量显著增加(图3b和图3c)。因此，在neurod1干预后，病理学病状中的异常神经元和星形胶质细胞比率发生逆转(图3d)。策略通过转化过量的反应性星形胶质细胞来补充神经元池，这是neurod1介导的星形胶质细胞到神经元转化的另一个有益特征。
[0195]
gaba能神经元可以通过5xfad皮质中的neurod1介导的星形胶质细胞到神经元转化来产生
[0196]
多项证据表明，ad脑中的gaba能系统发生严重改变，包含在ad发病机制期间gaba能神经元丧失(schmid等人,《神经元》,92:114-125(2016)；以及verret等人,《细胞》,149:708-721(2012))以及gaba合成(limon等人,《美国国家科学院院刊》,109:10071-10076(2012))和转运的变化(wu等人,《自然通讯(nature comm.)》,5:4159(2014))。因此，质疑策
略是否还能使ad小鼠脑中的足够的gaba能神经元再生。为了解决这个问题，对成熟的神经元标志物neun和gaba能标志物gaba进行共免疫染色(图4a)。有趣的是，除了现有的gaba能神经元(图4b，箭头，gaba 和neun 细胞)之外，与剩余的gaba能神经元的体细胞中的gaba水平相比，一组经转化神经元(图4b，箭头状物，gfp 、gaba 和neun 细胞)也在体细胞中表达类似水平的gaba(由gaba免疫荧光指示)。为了进一步证实一些经转化神经元是gaba能的，应用gaba能标志物gad67，并且发现一些经转化神经元是gad67免疫阳性的。这一观察结果表明，neurod1可以将星形胶质细胞转化成5xfad小鼠皮质中的gaba能神经元。在经转化神经元中，18.5％
±
2.1％是gaba 神经元，其与非病理学小鼠脑中的总皮质神经元中的gaba能神经元的百分比类似。因此，neurod1介导的星形胶质细胞到神经元转化可以使5xfad皮质区域中的足够数量的gaba能神经元再生以补充gaba能神经元池。
[0197]
经neurod1处理的5xfad在脑中具有较少的异常聚集体
[0198]
在gfp对照组与neurod1介导的转化组之间星形胶质细胞和神经元变化的比较期间，出乎意料地发现在5xfad小鼠皮质中立体定向注射后60天时，gfp对照组内部有大量异常的gfp标记的大聚集体(当在颜色方面观察时，染色为绿色)(图5)。然而，这种现象在neurod1组中大大减少。这一新发现表明经neurod1处理的ad脑中的更健康的局部环境。异常gfp聚集体的来源可以是ad病理学病状中gfp感染的细胞的碎片，或在ad病理进展期间摄取gfp碎片的其它细胞，这需要进一步鉴定。
[0199]
新转化的神经元在5xfad皮质中具有较少的胞内aβ负载
[0200]
根据以上令人感兴趣的观察结果，进一步假设由neurod1介导的细胞转化可以通过减少异常反应性星形胶质细胞、补充神经元并且因此重建星形胶质细胞与神经元细胞之间的正常通信来为脑提供更健康的环境。先前的研究还报道，反应性星形胶质细胞(gonzalez-reyes等人,《分子神经科学前沿(front.molec.neurosci.)》,10:427(2017))和经激活的小胶质细胞(venegas等人,《自然》,552:355-361(2017))在包含ad、亨廷顿氏病(huntington's disease)、帕金森氏病(parkinson's disease)、肌萎缩性侧索硬化和多发性硬化(liddelow等人,《自然》,541:481-487(2017))在内的许多神经退行性疾病的淀粉样蛋白毒性的进展中起重要作用。一方面，淀粉样蛋白β的存在干扰星形胶质细胞的胞内信号传导通路和正常功能。另一方面，反应性星形胶质细胞具有增加水平的用于aβ产生的三种必要组分，包含淀粉样蛋白前体蛋白、β-分泌酶(bace1)和γ-分泌酶(frost和li,《开放生物学(open biol.)》,7(2017))。接下来，调查将反应性星形胶质细胞重编程为神经元的策略是否可以影响5xfad小鼠脑中的淀粉样蛋白产生和进展。众所周知，aβ在胞外沉积，越来越多的证据表明这种肽也可以在神经内积累(laferla等人,《自然神经科学综述(nature rev.neurosci.)》,8:499-509(2007))，并且可以促进包含突触功能障碍和神经元丧失在内的疾病进展(bayer和wirths,《老化神经科学前沿(front.aging neurosci.)》,2:8(2010))。为了回答这个问题，进一步通过神经元标志物neun和β-淀粉样蛋白(aβ42)的共免疫染色检查胞内aβ负荷。仔细测量和分析每个脑样品的感染核心中所有神经元的胞内aβ水平。出人意料地，在经neurod1转化的新神经元中仅检测到最低水平的胞内aβ42，而gfp对照组中的预先存在的神经元含有大量的胞内aβ42(图6a和图6d，来自gfp对照组中的3只5xfad小鼠的神经元数量＝662，来自neurod1组中的3只5xfad小鼠的神经元数量＝1357，60dpi)。此外，先前存在的神经元中的胞内aβ42水平还在经neurod1处理的组中降低(图6a和图6e：
gfp组的感染核心中的所有预先存在的神经元中的胞内aβ42强度：43.1
±
0.7，来自gfp对照组中的3只5xfad小鼠的所分析的预先存在的神经元数量＝662)。neurod1组的感染核心中的所有预先存在的神经元的胞内aβ42强度：24.2
±
0.1，来自neurod1组中的3只5xfad小鼠的所分析的预先存在的神经元数量＝714。neurod1组的感染核心中的所有经转化神经元的胞内aβ42强度：27.0
±
0.2，来自neurod1组中的3只5xfad小鼠的所分析的经转化神经元数量＝643)，这表明减少反应性星形胶质细胞可以逆转或至少延迟β-淀粉样蛋白病理学进展。
[0201]
neurod1介导的星形胶质细胞到神经元转化减少了5xfad小鼠皮质中的促炎性小胶质细胞
[0202]
除了丰富的淀粉样蛋白沉积物和过量的反应性星形胶质细胞之外，阿尔茨海默氏病的脑的特征还在于炎症应答。这种免疫应答很大程度上由脑的内在髓样细胞(小胶质细胞)驱动，所述髓样细胞密切参与ad的病理学进展。淀粉样蛋白β可以通过使小胶质细胞更易受到二次刺激来引发小胶质细胞，并且促进小胶质细胞的激活。对小神经胶质的这种引发作用导致通过这些细胞持续产生促炎性趋化因子和细胞因子，这进一步导致发病机制的加速和疾病进展的加剧。另外，这些增加的细胞因子有助于在ad的病理学进展期间维持致敏小胶质细胞的反应性状态(heppner等人,《自然神经科学综述》,16:358-372(2015))。因此，首先通过对一般小胶质细胞标志物iba1(图7a，当在颜色方面观察时，染色为灰色)和促炎性小胶质细胞亚型标志物inos(图7a，当在颜色方面观察时，染色为红色)进行共免疫染色，测试neurod1介导的直接细胞转化是否对5xfad皮质中的免疫应答具有任何有益效果。两组中的小胶质细胞(图7a，iba1 细胞，当在颜色方面观察时，染色为灰色)保持类似的强度，而neurod1组中的小胶质细胞(经激活的小胶质细胞通常显示异常的扩增细胞体和较厚过程)的活性状态略微降低，尽管不能得出显著的统计差异。然而，促炎性小胶质细胞亚型标志物inos的免疫荧光在neurod1介导的星形胶质细胞到神经元转化之后大大减少，这表明在ad小鼠脑中在neurod1处理下缓解了促炎性应答。
[0203]
在5xfad皮质中neurod1介导的星形胶质细胞到神经元转化之后，促炎性细胞因子il-1β下调
[0204]
近年来，体外(van gijsel-bonnello等人,《公共科学图书馆
·
综合(plos one),12:e0175369(2017))和体内(medeiros和laferla,《实验神经病学(exp.neurol.)》,239:133-138(2013)；stamouli和politis,《精神病科(psychiatrike psychiatriki)》,27:264-275(2016))和体内积累的证据支持以下观点：包含白介素1β(il-1β)、白介素6(il-6)、干扰素γ(ifn-γ)和肿瘤坏死因子(tnf)在内的促炎性细胞因子的水平的增加在ad的病理学进展中发挥作用。促炎性细胞因子的这种增加的水平通过暂停淀粉样蛋白β的吞噬作用阻碍ad脑(stamouli和politis,《精神病科》,27:264-275(2016))。在多个促炎性细胞因子中，对il-1β特别感兴趣，因为白介素密切参与ad中的星形胶质细胞、神经元和小胶质细胞之间的复杂的胞间相互作用。增强的白介素水平影响小胶质细胞去除淀粉样蛋白斑的效力，并且增加星形胶质细胞增生和神经死亡。另外，白介素调节促进ad病理学的炎性级联特性所必需的胞内信号转导事件(stamouli和politis,《精神病科》,27:264-275(2016))。为了研究在5xfad小鼠脑中在neurod1介导的转化之后关于促炎性应答的有益效果，通过在注射后60天进行反应性星形胶质细胞标志物(gfap)和白介素-1β(il-1β)的共免疫染色来检查促炎
性变化。令人惊讶的是，与先前的发现一致的是，反应性星形胶质细胞(gfap 细胞，当在颜色方面观察时，染色为品红色)大大减少(图8a和图8b)，白介素-1β水平的显著降低(当在颜色方面观察时，染色为红色，gfp对照组中的il-1β强度：62.7
±
5.0；neurod1组中的il-1β强度：24.3
±
2.8)在5xfad小鼠皮质的经处理区域中在neurod1介导的细胞转化之后在反应性星形胶质细胞内部也可观察到。总之，neurod1介导的细胞转化通过减少促炎性细胞因子il-1β而有益于ad脑，这可以是5xfad小鼠脑中的aβ负荷减少的潜在机制。
[0205]
neurod1转化的神经元在5xfad小鼠脑中存活超过8个月
[0206]
如本文所述，反应性星形胶质细胞中的neurod1过表达可以在注射后2个月实现向功能神经元的有效转化，减少胞内aβ负荷，并且改善5xfad脑中的促炎性应答。进一步质疑经转化神经元是否可以在5xfad小鼠脑中长期存活，以及在长期中可以观察到哪些对应的有益效果。为了回答问题，将与aav9-cag-gfp混合的aav9-gfap-cre或与24aav9-cag-neurod1-p2a-gfp混合的aav9-gfap-cre通过立体定向注射原位递送到皮质区域中(坐标：l/r：
±
1.4；a/p：1.3，dv：-1.0)。在约8个月后收集脑样品进行进一步研究。免疫荧光分析表明，在注射后8个月，经neurod1转化的神经元仍然可以存活。经转化神经元拥有具有多个神经突(图9c和图9d，当在颜色方面观察时，染色为绿色)的健康神经元形态，并且保持neurod1的高表达水平(图9c，当在颜色方面观察时，染色为红色)(图9d，当在颜色方面观察时，染色为品红色)。相反，在注射后8个月，在gfp对照组中观察到大量的gfp聚集体。在这个长期处理组中，怀疑异常的gfp聚集体来自两种潜在来源：(1)死亡的受感染星形胶质细胞的碎片，因为细胞内部cre毒性的不断积累；和/或(2)gfp对照组中的渗漏的神经元的萎缩神经突。假定cre仅在gfap启动子(反应性星形胶质细胞内部)下过表达。然而，在注射后的长期时间段期间，cre可以从死亡的星形胶质细胞释放到附近区域并且因此被周围神经元摄取。因此，gfp对照组中的一些预先存在的神经元也可以具有gfp表达。然而，预先存在的神经元未获得由免疫染色数据支持的neurod1过表达(图9c和图9d)。由于对neurod1介导的星形胶质细胞到神经元转化在ad病理学病状中的长期有益效果感兴趣，因此更多地关注神经元和病理学标志物变化的检查和比较，而不是这种cre-loxp系统中的细微的泄露标记问题。
[0207]
neurod1介导的细胞转化对5xfad皮质中的轴突、树突和突触的长期影响
[0208]
在ad脑中，突触是重要的并且在ad的病理学进展期间逐渐减少。神经元神经突和突触的丧失会导致ad和痴呆的学习和记忆的损伤(mitew等人,《老年神经生物学(neurobiol.aging)》,34:2341-2351(2013)；以及palop和mucke,《自然—神经科学(nat.neurosci.)》,13:812-818(2010))。在ad中，三个主要原因可以解释这种症状。(1)正常星形胶质细胞促进神经元存活和过生长，促进突触形成和功能，并且有助于清除突触和髓磷脂碎片(liddelow等人,《自然》,541:481-487(2017))。然而，ad背景下的功能失调的反应性星形胶质细胞可以中断这种胞间调节并且干扰突触形成和维持。(2)小胶质细胞，作为大多数组织巨噬细胞，可以通过保护和重塑突触来支持cns内稳态和可塑性。此外，由正常功能小胶质细胞合成的脑源性神经营养因子(bdnf)对于促进学习相关的突触形成也是至关重要的(prinz和priller,《自然神经科学综述》,15:300-312(2014))。先前的工作已报道，如bdnf等神经营养因子的缺乏可能严重损害神经元完整性，其导致突触丧失和破坏突触功能(parkhurst等人,《细胞》,155:1596-1609(2013))。(3)其它级联分子或蛋白质，例如
定位于突触的c1q和c3可以调节突触消除(hong等人,《科学》,352:712-716(2016))。然而，这种功能在ad条件下被中断。为了研究neurod1介导的转化是否在5xfad脑中保持足够的神经元神经突和突触方面具有长期有益效果，此处在体内干预后8个月时通过免疫染色检查轴突、树突和突触密度变化。具体地，为了检查突触变化，测试了突触素作为全局突触标志物以及vglut1作为兴奋性突触标志物。轴突将被神经丝200(nf200，图10a，当在颜色方面观察时，染色为天蓝色)标记，而树突将是微管相关蛋白2(map2，图10b，当在颜色方面观察时，染色为天蓝色)免疫阳性的。aβ聚集体通过硫黄素-s染色来揭示(图10a和图10b，当在颜色方面观察时，染色为蓝色)。观察到全局突触标志物突触素的强度显著增加(图10a，当在颜色方面观察时，染色为红色)。根据突触素强度的增加，兴奋性突触标志物vglut1(图10b，当在颜色方面观察时，染色为红色)在neurod1处理后还显示出相当增强的强度。还研究了当5xfad小鼠6月龄(注射后2个月)时的轴突、树突和突触变化。然而，在gfp对照组与neurod1组之间未观察到显著差异。解释这种情况的一个可能的原因是神经变性和突触丧失在5xfad小鼠仍处于ad病理学进展的早期或中期阶段时并不严重。当5xfad小鼠接受治疗持续更长时间时，这些有益效果被放大，并且当ad病理学进展的晚期出现包含更多神经元和突触丧失的严重症状时，在ad病理学进展的晚期时检查这些有益效果。总之，这些数据表明，neurod1介导的细胞转化通过以下增加突触密度：(1)由于更健康的脑环境而保持和保存预先存在的神经元的突触；以及(2)当通过转化产生更多新神经元时增加新突触。在neurod1组中nf200和map2强度也增强，这表明轴突和树突两者均在neurod1处理后增加。因此，neurod1介导的星形胶质细胞到神经元转化的治疗策略在维持、保护和产生足够的轴突、树突和突触以更好地维持脑中的神经元完整性中发挥着有益且支持性作用，并且可以用作针对ad患者的潜在疗法。
[0209]
如本文所证明的，使用本文所述的方法和材料产生的新神经元可以是具有承受神经病状的破坏性cns环境(例如，ad脑的破坏性环境)的性质的神经元。另外，本文所述的方法和材料可以用于在患有神经病状(例如，ad)的哺乳动物的脑内重建神经元和/或星形胶质细胞内稳态。
[0210]
neurod1介导的星形胶质细胞到神经元转化保护5xfad小鼠皮质中的血管形态
[0211]
早期研究已经阐明ad的发病机制的特征在于aβ的积累和沉积、神经变性、小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，并且重要地，血管消退和变性。血管壁中的aβ沉积也被称为大脑淀粉样血管病(jaunmuktane等人,《自然》,525:247-250(2015))。围绕血管积聚的淀粉样蛋白-β的毒性对神经血管单元表现出有害作用，并且通过内皮细胞和周细胞的变性导致血管完整性和功能障碍(busch等人,《细胞生理学与生物化学(cell.physiol.biochem.)》《国际实验细胞生理学、生物化学与药理学杂志(int.j.exp.cell.physiol.biochem.pharmacol.)》,30:1436-1443(2012))。另外，另一研究已报道，正常星形胶质细胞连同血管平滑肌细胞和周细胞在血管直径、血流量和神经血管可塑性的调节中是关键参与者(kimbrough等人,《神经病学杂志(j.neurol.)》,138:3716-3733(2015))。因此，在ad脑中，肥大型反应性星形胶质细胞和淀粉样蛋白斑的积累围绕血管圆周，并且氧化诱导的炎症导致血管形态破坏和血管反应不良(marchesi,《美国实验生物学学会联合会杂志》,25:5-13(2011))。为了研究通过neurod1介导的星形胶质细胞到神经元转化而实现的反应性星形胶质细胞的减少是否可以减轻对血管完整性的阻碍，通过在neurod1或gfp对照干预后8个月时在5xfad脑样
品上共免疫染色血管标志物淋巴细胞抗原6复合物(ly6c)和反应性星形胶质细胞末端足标志物水通道蛋白4(aqp4)来检查血管完整性(图11)。令人惊讶的是，与gfp对照组中较短的ly6c 和aqp4 区段相反，neurod1组显示出长得多的ly6c 和aqp4 区段，这表明在neurod1组中血管的完整性保存得更好(图11)。总之，本文所提供的结果证明了neurod1介导的细胞转化在血管完整性中的保护作用。还检查了野生型完整小鼠脑作为对照。
[0212]
实例2-通过多次颅内注射neurod1 aav-php.eb进行的ad小鼠脑的全局感染
[0213]
为了全局靶向星形胶质细胞以在小鼠脑中进行神经元转化，将aav-gfap::cre flex系统(图12a和图12b)和多次颅内注射(图12c和图12d)应用于研究中。选择aav-php.eb以在小鼠脑中异位表达neurod1和gfp(对照)。将flex gfp和neurod1aav-php.eb注射到gfap::cre转基因小鼠脑中。注射后15天(dpi)，将小鼠脑切片进行组织学分析。注射区域周围的矢状和冠状切片的免疫组织化学分析显示，gfp阳性细胞在注射gfp和neurod1-gfp的小鼠脑中的宽区域中都是可检测的。这些结果表明aav-php.eb的多次颅内注射通过小鼠脑实现了广泛感染。
[0214]
gfap::cre转基因小鼠脑中的全局星形胶质细胞到神经元的转化
[0215]
为了测试neurod1是否可以将星形胶质细胞全局转化成神经元，通过免疫染色检查小鼠脑的不同区域。发现在经gfp处理的小鼠中，几乎所有的gfp阳性细胞与星形胶质细胞标志物s100β共标记(图13a)。有趣的是，观察到在经neurod1处理的小鼠脑(包含皮质区、海马体、脑下脚和中脑)中与神经元标志物neun共标记的多个gfp阳性细胞(图13b)。
[0216]
为了直接显示对照与经neurod1处理的小鼠脑之间的gfp阳性细胞的不同形态，逐个表现高放大率图像。neurod1组中的大多数gfp阳性细胞表现出典型的神经元形态，然而，对照组中的gfp阳性细胞表现出典型的星形胶质细胞形态(图14a)。此外，还检测到neurod1在经转化神经元中过表达(图14b)。这些结果表明gfap::cre flex系统特异性靶向星形胶质细胞并且aav-php.eb neurod1的多次颅内注射实现了跨小鼠脑的广泛星形胶质细胞到神经元转化。
[0217]
5xfad转基因小鼠脑中的全局星形胶质细胞到神经元转化
[0218]
为了实现ad小鼠脑中的全局转化，将全局转化系统应用于5xfad小鼠脑中。aav-php.eb gfap::cre病毒与flex neurod1-p2a-gfp共注射到13月龄的5xfad小鼠脑中，1个月后处死小鼠进行转化分析(图15a)。通过硫黄素-s染色(当在颜色方面观察时，染色为蓝色，图15b)检测宽的aβ斑。有趣的是，几乎整个大脑区都被gfp覆盖(图15b)，这表明aav-php.eb的感染效率在5xfad小鼠大脑中是相当高的。为了检查5xfad小鼠脑中的星形胶质细胞到神经元转化，采用gfp和neun免疫染色。许多gfp阳性细胞通过不同的脑区与neun共定位(图15c)。这些数据证明，全局星形胶质细胞到神经元转化也在5xfad小鼠模型脑中起作用。另外，本文呈现的结果证明新神经元和新星形胶质细胞达到内稳态。
[0219]
脑是高度复杂但有组织的器官，并且不同亚型的神经元在脑中具有其特定位置。例如，已经在大脑皮质内鉴定了层和神经元亚型特异性。为了检查全局转化是否可以在大脑皮质中的正确位置产生正确的神经元，研究了在全局转化之后的典型的皮质标志物tbr1表达模式。tbr1在皮质层ii/iii和vi神经元中高度表达。有趣的是，还发现，tbr1在位于大脑皮质深层中的经neurod1转化的神经元中表达(图16a和图16b)。这些结果表明，全局转化可以产生正确位置中的皮质神经元的具体亚型。
[0220]
实例3
–
通过眶后注射neurod1 aav实现的星形胶质细胞向神经元的全局转化
[0221]
通过使用aav.php.eb，一种最近发现的aav血清型(chan等人,《自然神经科学》,20(8):1172-1179(2017))，能够通过静脉内注射穿过血脑屏障(bbb)有效地转导小鼠脑。首先用gfap启动子驱动的gfp质粒包装aav.php.eb。在眶后注射后17天，小鼠脑被gfp荧光广泛标记(图17a)。用星形胶质细胞标志物s100β进行的共免疫染色显示gfp在皮质、纹状体和海马体区域中的非常特异性表达。
[0222]
接下来，用cre-flex系统包装aav.php.eb病毒，试图实现所关注基因的更高表达。首先用gfap::cre和flex-gfp病毒制备aav.php.eb。这种组合的眶后注射还在脑中显示出广泛的感染和强烈的表达(图18a)。虽然在不同脑区中的许多gfp阳性细胞显示星形胶质细胞形态和gfap信号，但是所述阳性细胞中的一些阳性细胞还显示出神经元形态和与neun的共定位(图18b)。
[0223]
还将cre-flex-neurod1系统放入aav.php.eb病毒中。在眶后注射具有gfap::cre和flex-neurod1-gfp病毒的aav.php.eb之后，在脑的不同区域中检测到gfp信号和neurod1信号两者(图19)。有趣的是，许多gfp信号和neurod1信号与神经元标志物neun共定位，这表明可以通过静脉内注射aav.php.eb病毒实现系统性感染和星形胶质细胞到神经元转化。这些结果证明，将neurod1递送到星形胶质细胞的非侵入性疗法可以用于在许多神经变性疾病，如ad和大规模中风中全局地再生神经元。
[0224]
图20展示了病毒(例如，aav.php.eb-cag::flex-gfp)的眶后(r.o.)注射用于星形胶质细胞的全局靶向，如通过脑内(图21a-21b)、脑的不同区域内(图24)以及脊髓内(图22)的gfp染色所证实的。在其它器官中未检测到明显的gfp信号(图23)。
[0225]
当通过眶后注射来注射被设计成表达neurod1的病毒(aav.php.eb-cag::flex-nd1-p2a-gfp；约2.0
×
10
10
个基因组拷贝/小鼠)时，星形胶质细胞被转化成大脑内的神经元，但是在脊髓中似乎需要更长的时间进行转化(图25a和图25b)。还在脑的不同区域中以不同效率观察到星形胶质细胞向神经元的这种全局转化(图26和27)。
[0226]
被设计成表达neurod1的病毒(aav.php.eb-cag::flex-nd1-p2a-gfp；约2.0
×
10
10
个基因组拷贝/小鼠)的眶后注射成功改善了ad动物模型中的记忆(图28)。具体地，被设计成表达neurod1的病毒的眶后注射导致记忆改善，如使用y迷宫记忆评估测定所评估的(图29a-图29b和图30)，如使用气味习惯化测定所评估的(图31)，如使用恐惧条件记忆测试所评估的(图32)，以及如使用用于评估空间学习和记忆的morris水迷宫所评估的(图33和图34a-图34d)。
[0227]
这些结果证明，aav php.eb眶后注射是用于全局靶向星形胶质细胞以转化成神经元的良好方法。这些结果还证明，neurod1介导的星形胶质细胞到神经元转化的效率在不同的脑区中是不同的，并且皮质和海马星形胶质细胞可以通过neurod1以高效率转化成神经元。另外，这些结果证明，星形胶质细胞向神经元的全局转化可以改善ad的小鼠模型(即，5xfad小鼠)中的学习和记忆性能。
[0228]
通过神经干细胞移植在整个阿尔茨海默氏脑中很难产生数十亿新神经元，这促使发明一种替代方式来在阿尔茨海默氏脑内部全局地再生数十亿神经元。如本文所述，开发了基因疗法策略，所述基因疗法策略可以用于通过眶后注射aav php.eb病毒而全局靶向星形胶质细胞，以在5xfad小鼠脑中进行原位神经元转化。当neurod1在那些星形胶质细胞中
过表达时，发现在不同的脑区，尤其是在皮质和海马体中有大量的经转化神经元。迄今为止，通过5xfad小鼠脑中的全局星形胶质细胞到神经元转化，总结了一些有趣的发现。在将aav php.eb病毒眶后注射到5xfad
/-/cre77.6
/-双基因小鼠中之后，发现报告基因gfp在星形胶质细胞中遍及不同的脑和脊髓区域广泛表达。在aav php.eb-cag::flex-neurod1-p2a-gfp注射后30天，在5xfad小鼠脑中观察到许多gfp阳性转化的神经元。neurod1介导的星形胶质细胞到神经元转化的效率在5xfad小鼠脑中的大脑皮质、梨状皮质和海马体中为约70-90％。
[0229]
在6月龄时用gfp或经neurod1-gfp处理5xfad
/-/cre77.6
/-双基因小鼠。然后，在8月龄(aav php.eb注射后2个月)进行一系列行为测试，并且发现如通过y-迷宫测定、恐惧条件记忆、气味习惯化以及morris水迷宫所评估，全局星形胶质细胞到神经元转化显著改善了5xfad小鼠的学习和记忆性能。
[0230]
在neurod1治疗表现出ad小鼠的认知功能得到改善之后，进一步设计了抑制经neurod1转化的神经元的实验并且检查记忆的增强是否会相应地减少。出于此目的，采用了通过与neurod1一起表达抑制性受体hm4di的化学遗传学方法，使得经转化神经元将表达hm4di。在确认neurod1-治疗增强了ad小鼠的恐惧调节记忆之后，应用cno以激活hm4di受体，使得经neurod1转化的神经元被抑制激发动作电位。有趣的是，发现记忆增强在cno使神经d1转化的神经元沉默之后被消除(图35a-图35d)。这些结果进一步证明，经neurod1转化的神经元有助于ad小鼠的记忆增强。
[0231]
实例4
–
另外的实施例
[0232]
实施例1.一种用于治疗患有脑神经病症的哺乳动物的方法，其中所述方法包括向所述哺乳动物的脑施用包括编码神经源性分化1(neurod1)多肽或其生物活性片段的外源性核酸的组合物。
[0233]
实施例2.根据实施例1所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
[0234]
实施例3.根据实施例1所述的方法，其中所述神经病症是阿尔茨海默氏病。
[0235]
实施例4.根据实施例1所述的方法，其中所述施用步骤包括向脑递送包括编码neurod1的核酸的表达载体。
[0236]
实施例5.根据实施例1所述的方法，其中所述施用步骤包括向脑递送包括编码neurod1的核酸的重组病毒表达载体。
[0237]
实施例6.根据实施例1所述的方法，其中所述施用步骤包括向脑递送包括编码neurod1的核酸的重组腺相关病毒表达载体。
[0238]
实施例7.根据实施例6所述的方法，其中所述腺相关病毒是aav.php.eb。
[0239]
实施例8.根据实施例1到7中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括施用包括编码neurod1蛋白的核酸序列的重组表达载体，其中所述编码neurod1蛋白的核酸序列包括选自由以下组成的组的核酸序列：编码seq id no:2或其功能片段的核酸序列；编码seq id no:4或其功能片段的核酸序列；seq id no:1或其功能片段；seq id no:3或其功能片段；以及编码与seq id no:2或seq id no:4或其功能片段具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的蛋白质的核酸序列。
[0240]
实施例9.根据实施例1到8中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括立体定向
颅内注射。
[0241]
实施例10.根据实施例9所述的方法，其中所述施用步骤包括两次或更多次立体定向颅内注射。
[0242]
实施例11.根据实施例1到8中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括颅外注射。
[0243]
实施例12.根据实施例11所述的方法，其中所述施用步骤包括两次或更多次颅外注射。
[0244]
实施例13.根据实施例1到8中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括眶后注射。
[0245]
实施例14.一种治疗患有阿尔茨海默氏病的哺乳动物的方法，其中所述方法包括向所述哺乳动物的脑施用包括含有腺相关病毒颗粒的药学上可接受的载体的药物组合物，所述腺相关病毒颗粒包括编码neurod1多肽或其生物活性片段的核酸。
[0246]
实施例15.根据实施例14所述的方法，其中所述药物组合物包括约1μl到约500μl的药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体含有浓度为10
10-10
14
个腺相关病毒颗粒/毫升载体的腺相关病毒颗粒。
[0247]
实施例16.根据实施例14或15所述的方法，其中将所述药物组合物以约0.1微升/分钟到约5微升/分钟的受控流速注射到所述哺乳动物的脑中。
[0248]
实施例17.一种用于在患有阿尔茨海默氏病并且需要(1)减少过度磷酸化tau蛋白的神经原纤维缠结；(2)减少胞外淀粉样蛋白斑的聚集；(3)减少神经炎症；(4)减少白介素1β(il-1β)；(5)产生新的谷氨酸能神经元；(6)增加gaba能神经元的存活率；(7)产生新的非反应性星形胶质细胞；(8)减少反应性星形胶质细胞的数量；或(9)改善记忆的哺乳动物体内进行所述(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)或(9)的方法，其中所述方法包括向所述哺乳动物施用包括编码neurod1多肽或其生物活性片段的外源性核酸的组合物，其中所述(1)过度磷酸化神经原纤维缠结得以减少；(2)胞外淀粉样蛋白斑的聚集得以减少；(3)神经炎症得以减少；(4)白介素1β(il-1β)水平得以降低；(5)新的谷氨酸能神经元得以产生；(6)gaba能神经元的存活率得以增加；(7)新的非反应性星形胶质细胞得以产生；(8)反应性星形胶质细胞的数量得以减少；或(9)所述记忆得以改善。
[0249]
实施例18.根据实施例17所述的实施例，其中所述哺乳动物是人。
[0250]
实施例19.根据实施例17到18中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括递送包括编码neurod1多肽的核酸的表达载体。
[0251]
实施例20.根据实施例17到19中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括递送包括编码neurod1多肽的核酸的重组病毒表达载体。
[0252]
实施例21.根据实施例17到20中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括递送包括编码neurod1多肽的核酸的重组腺相关病毒表达载体。
[0253]
实施例22.根据实施例21所述的方法，其中所述重组腺相关病毒表达载体是aav.php.eb表达载体。
[0254]
实施例23.根据实施例17到22中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括施用包括编码neurod1多肽的核酸序列的重组表达载体，其中所述编码neurod1多肽的核酸序列包括选自由以下组成的组的核酸序列：编码seq id no:2或其功能片段的核酸序列；编码
seq id no:4或其功能片段的核酸序列；seq id no:1或其功能片段；seq id no:3或其功能片段；以及编码与seq id no:2或seq id no:4或其功能片段具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的蛋白质的核酸序列。
[0255]
实施例24.根据实施例17到23中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括立体定向颅内注射。
[0256]
实施例25.根据实施例24所述的方法，其中所述施用步骤包括两次或更多次立体定向颅内注射。
[0257]
实施例26.根据实施例17到23中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括颅外注射。
[0258]
实施例27.根据实施例26所述的方法，其中所述施用步骤包括两次或更多次颅外注射。
[0259]
实施例28.根据实施例17到23中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括眶后注射。
[0260]
序列
[0261]
seq id no:1-编码人neurod1蛋白的人neurod1核酸序列-1071个核苷酸，包含终止密码子
[0262]
atgaccaaatcgtacagcgagagtgggctgatgggcgagcctcagccccaaggtcctccaagctggacagacgagtgtctcagttctcaggacgaggagcacgaggcagacaagaaggaggacgacctcgaagccatgaacgcagaggaggactcactgaggaacgggggagaggaggaggacgaagatgaggacctggaagaggaggaagaagaggaagaggaggatgacgatcaaaagcccaagagacgcggccccaaaaagaagaagatgactaaggctcgcctggagcgttttaaattgagacgcatgaaggctaacgcccgggagcggaaccgcatgcacggactgaacgcggcgctagacaacctgcgcaaggtggtgccttgctattctaagacgcagaagctgtccaaaatcgagactctgcgcttggccaagaactacatctgggctctgtcggagatcctgcgctcaggcaaaagcccagacctggtctccttcgttcagacgctttgcaagggcttatcccaacccaccaccaacctggttgcgggctgcctgcaactcaatcctcggacttttctgcctgagcagaaccaggacatgcccccccacctgccgacggccagcgcttccttccctgtacacccctactcctaccagtcgcctgggctgcccagtccgccttacggtaccatggacagctcccatgtcttccacgttaagcctccgccgcacgcctacagcgcagcgctggagcccttctttgaaagccctctgactgattgcaccagcccttcctttgatggacccctcagcccgccgctcagcatcaatggcaacttctctttcaaacacgaaccgtccgccgagtttgagaaaaattatgcctttaccatgcactatcctgcagcgacactggcaggggcccaaagccacggatcaatcttctcaggcaccgctgcccctcgctgcgagatccccatagacaatattatgtccttcgatagccattcacatcatgagcgagtcatgagtgcccagctcaatgccatatttcatgattag
[0263]
seq id no:2-由seq id no:1编码的人neurod1氨基酸序列-356个氨基酸
[0264]
mtksysesglmgepqpqgppswtdeclssqdeeheadkkeddleamnaeedslrnggeeedededleeeeeeeeedddqkpkrrgpkkkkmtkarlerfklrrmkanarernrmhglnaaldnlrkvvpcysktqklskietlrlaknyiwalseilrsgkspdlvsfvqtlckglsqpttnlvagclqlnprtflpeqnqdmpphlptasasfpvhpysyqspglpsppygtmdsshvfhvkppphaysaalepffespltdctspsfdgplspplsingnfsfkhepsaefeknyaftmhypaatlagaqshgsifsgtaaprceipidnimsfdshshhervmsaqlnaifhd
[0265]
seq id no:3-编码小鼠neurod1蛋白的小鼠neurod1核酸序列-1074个核苷酸，包含终止密码子
[0266]
atgaccaaatcatacagcgagagcgggctgatgggcgagcctcagccccaaggtcccccaagctggacagatgagtgtctcagttctcaggacgaggaacacgaggcagacaagaaagaggacgagcttgaagccatgaatgcagaggaggactctctgagaaacgggggagaggaggaggaggaagatgaggatctagaggaagaggaggaagaagaagaggaggaggaggatcaaaagcccaagagacggggtcccaaaaagaaaaagatgaccaaggcgcgcctagaacgttttaaattaaggcgcatgaaggccaacgcccgcgagcggaaccgcatgcacgggctgaacgcggcgctggacaacctgcgcaaggtggtaccttgctactccaagacccagaaactgtctaaaatagagacactgcgcttggccaagaactacatctgggctctgtcagagatcctgcgctcaggcaaaagccctgatctggtctccttcgtacagacgctctgcaaaggtttgtcccagcccactaccaatttggtcgccggctgcctgcagctcaaccctcggactttcttgcctgagcagaacccggacatgcccccgcatctgccaaccgccagcgcttccttcccggtgcatccctactcctaccagtcccctggactgcccagcccgccctacggcaccatggacagctcccacgtcttccacgtcaagccgccgccacacgcctacagcgcagctctggagcccttctttgaaagccccctaactgactgcaccagcccttcctttgacggacccctcagcccgccgctcagcatcaatggcaacttctctttcaaacacgaaccatccgccgagtttgaaaaaaattatgcctttaccatgcactaccctgcagcgacgctggcagggccccaaagccacggatcaatcttctcttccggtgccgctgcccctcgctgcgagatccccatagacaacattatgtctttcgatagccattcgcatcatgagcgagtcatgagtgcccagcttaatgccatctttcacgattag
[0267]
seq id no:4-由seq id no:3编码的小鼠neurod1氨基酸序列-357个氨基酸
[0268]
mtksysesglmgepqpqgppswtdeclssqdeeheadkkedeleamnaeedslrnggeeeeededleeeeeeeeeeedqkpkrrgpkkkkmtkarlerfklrrmkanarernrmhglnaaldnlrkvvpcysktqklskietlrlaknyiwalseilrsgkspdlvsfvqtlckglsqpttnlvagclqlnprtflpeqnpdmpphlptasasfpvhpysyqspglpsppygtmdsshvfhvkppphaysaalepffespltdctspsfdgplspplsingnfsfkhepsaefeknyaftmhypaatlagpqshgsifssgaaaprceipidnimsfdshshhervmsaqlnaifhd
[0269]
小鼠lcn2启动子-seq id no:5
[0270]
gcagtgtggagacacacccactttccccaagggctcctgctcccccaagtgatccccttatcctccgtgctaagatgacaccgaggttgcagtccttacctttgaaagcagccacaagggcgtgggggtgcacacctttaatcccagcactcgggaggcagaggcaggcagatttctgagttcgagaccagcctggtctacaaagtgaattccaggacagccagggctatacagagaaaccctgtcttgaaaaaaaaagagaaagaaaaaagaaaaaaaaaaatgaaagcagccacatctaaggactacgtggcacaggagagggtgagtccctgagagttcagctgctgccctgtctgttcctgtaaatggcagtggggtcatgggaaagtgaaggggctcaaggtattggacacttccaggataatcttttggacgcctcaccctgtgccaggaccaaggctgagcttggcaggctcagaacagggtgtcctgttcttccctgtctaaaacattcactctcagcttgctcacccttccccagacaaggaagctgcacagggtctggtgttcagatggctttggcttacagcaggtgtgggtgtggggtaggaggcagggggtaggggtgggggaagcctgtactatactcactatcctgtttctgaccctctaggactcctacagggttatgggagtggacaggcagtccagatctgagctgctgacccacaagcagtgccctgtgcctgccagaatccaaagccctgggaatgtccctctggtccccctctgtcccctgcagcccttcctgttgctcaaccttgcacagttccgacctgggggagagagggacagaaatcttgccaagtatttcaacagaatgtactggcaattacttcatggcttcctggacttggtaaaggatggactaccccgcccaacaggggggctggcagccaggtaggcccataaaaagcccgctggggagtcctcctcactctctgctcttcctcctccagcacacatcagacctagtagctgtggaaacca
[0271]
人gfap启动子-seq id no:6
[0272]
gtctgcaagcagacctggcagcattgggctggccgccccccagggcctcctcttcatgcccagtgaatgactcaccttggcacagacacaatgttcggggtgggcacagtgcctgcttcccgccgcaccccagcccccctcaaatgccttccgagaagcccattgagtagggggcttgcattgcaccccagcctgacagcctggcatcttgggataaaagcagcacagccccctaggggctgcccttgctgtgtggcgccaccggcggtggagaacaaggctctattcagcctgtgcccaggaaaggggatcaggggatgcccaggcatggacagtgggtggcagggggggagaggagggctgtctgcttcccagaagtccaaggacacaaatgggtgaggggactgggcagggttctgaccctgtgggaccagagtggagggcgtagatggacctgaagtctccagggacaacagggcccaggtctcaggctcctagttgggcccagtggctccagcgtttccaaacccatccatccccagaggttcttcccatctctccaggctgatgtgtgggaactcgaggaaataaatctccagtgggagacggaggggtggccagggaaacggggcgctgcaggaataaagacgagccagcacagccagctcatgcgtaacggctttgtggagctgtcaaggcctggtctctgggagagaggcacagggaggccagacaaggaaggggtgacctggagggacagatccaggggctaaagtcctgataaggcaagagagtgccggccccctcttgccctatcaggacctccactgccacatagaggccatgattgacccttagacaaagggctggtgtccaatcccagcccccagccccagaactccagggaatgaatgggcagagagcaggaatgtgggacatctgtgttcaagggaaggactccaggagtctgctgggaatgaggcctagtaggaaatgaggtggcccttgagggtacagaacaggttcattcttcgccaaattcccagcaccttgcaggcacttacagctgagtgagataatgcctgggttatgaaatcaaaaagttggaaagcaggtcagaggtcatctggtacagcccttccttccctttttttttttttttttttgtgagacaaggtctctctctgttgcccaggctggagtggcgcaaacacagctcactgcagcctcaacctactgggctcaagcaatcctccagcctcagcctcccaaagtgctgggattacaagcatgagccaccccactcagccctttccttcctttttaattgatgcataataattgtaagtattcatcatggtccaaccaaccctttcttgacccaccttcctagagagagggtcctcttgattcagcggtcagggccccagacccatggtctggctccaggtaccacctgcctcatgcaggagttggcgtgcccaggaagctctgcctctgggcacagtgacctcagtggggtgaggggagctctccccatagctgggctgcggcccaaccccaccccctcaggctatgccagggggtgttgccaggggcacccgggcatcgccagtctagcccactccttcataaagccctcgcatcccaggagcgagcagagccagagcat
[0273]
小鼠aldh1l1启动子-seq id no:7
[0274]
aactgagagtggaggggcacagaagagcccaagaggctccttaggttgtgtggagggtacaatatgtttgggctgagcaacccagagccagactttgtctggctggtaagagacagaggtgcctgctatcacaatccaagggtctgcttgaggcagagccagtgcaaaggatgtggttagagccagcctggtgtactgaagaggggcgaagagcttgagtaaggagtctcagcggtggtttgagaggcagggtggttaatggagtagctgcaggggagaatccttgggagggagcctgcaggacagagctttggtcaggaagtgatgggcatgtcactggaccctgtattgtctctgacttttctcaagtaggacaatgactctgcccagggagggggtctgtgacaaggtggaagggccagaggagaacttctgagaagaaaaccagaggccgtgaagaggtgggaagggcatgggattcagaacctcaggcccaccaggacacaaccccaggtccacagcagatgggtgaccttgcatgtctcagtcaccagcattgtgctccttgcttatcacgcttgggtgaaggaaatgacccaaatagcataaagcctgaaggccgggactaggccagctagggcttgcccttcccttcccagctgcactttccataggtcccaccttcagcagattagacccgcctcctgcttcctgcctccttgcctcctcactcatgggtctatgcccacctccagtctcgggactgaggctcactgaagtcccatcgaggtctggtctggtgaatcagcggctggctctgggccctgggcgaccagttaggttccgggcatgctaggcaatgaactctacccggaattgggggtgcggggaggcggggaggtctccaacccagccttttgaggacgtgcctgtcgctgcacggtgctttttatagacgatggtggcccattttgcagaagggaaagccggagccctctggggagcaaggtccccgcaaatggacggatgacctgagcttggttctgccagtccacttcccaaatccctcaccccattctagggactagggaaagatctcctgattggtcatatctgggggcctggccggagggcctcctatgattggagagatctaggctgggcgggccctagagcccgcctcttctctgcctggaggaggagcactgaccctaaccctctctg
cacaagacccgagcttgtgcgcccttctgggagcttgctgcccctgtgctgactgctgacagctgactgacgctcgcagctagcaggtacttctgggttgctagcccagagccctgggccggtgaccctgttttccctacttcccgtctttgaccttgggtaagtttctttttcttttgtttttgagagaggcacccagatcctctccactacaggcagccgctgaaccttggatcctcagctcctgccctgggaactacagttcctgccctttttttcccaccttgagggaggttttccctgagtagcttcgactatcctggaacaagctttgtagaccagcctgggtctccggagagttgggattaaaggcgtgcaccaccacc
[0275]
人ng2启动子-seq id no:8
[0276]
ctctggtttcaagaccaatactcataacccccacatggaccaggcaccatcacacctgagcactgcacttagggtcaaagacctggccccacatctcagcagctatgtagactagctccagtcccttaatctctctcagcctcagtttcttcatctgcaaaacaggtctcagtttcgttgcaaagtatgaagtgctgggctgttactggtcaaagggaagagctgggaagagggtgcaaggtggggttgggctggagatgggctggagcagatagatggagggacctgaatggaggaagtaaaccaaggcccggtaacattgggactggacagagaacacgcagatcctctaggcaccggaagctaagtaacattgccctttctcctcctgtttgggactaggctgatgttgctgcctggaagggagccagcagaagggccccagcctgaagctgttaggtagaagccaaatccagggccagatttccaggaggcagcctcgggaagttgaaacacccggattcaggggtcaggaggcctgggcttctggcaccaaacggccagggacctactttccacctggagtcttgtaagagccactttcagcttgagctgcactttcgtcctccatgaaatgggggaggggatgctcctcacccaccttgcaaggttattttgaggcaaatgtcatggcgggactgagaattcttctgccctgcgaggaaatccagacatctctcccttacagacagggagactgaggtgaggcccttccaggcagagaaggtcactgttgcagccatgggcagtgccccacaggacctcgggtggtgcctctggagtctggagaagttcctaggggacctccgaggcaaagcagcccaaaagccgcctgtgagggtggctggtgtctgtccttcctcctaaggctggagtgtgcctgtggaggggtctcctgaactcccgcaaaggcagaaaggagggaagtaggggctgggacagttcatgcctcctccctgagggggtctcccgggctcggctcttggggccagagttcagggtgtctgggcctctctatgactttgttctaagtctttagggtggggctggggtctggcccagctgcaagggccccctcacccctgccccagagaggaacagccccgcacgggccctttaagaaggttgagggtgggggcaggtgggggagtccaagcctgaaacccgagcgggcgcgcgggtctgcgcctgccccgcccccggagttaagtgcgcggacacccggagccggcccgcgcccaggagcagagccgcgctcgctccactcagctcccagctcccaggactccgctggctcctcgcaagtcctgccgcccagcccgccggg
[0277]
cag::neurod1-ires-gfp
–
seq id no:9
[0278]
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[0279]
其它实施例
[0280]
应当理解，虽然已经结合本发明的具体描述对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点以及修改都在以下权利要求书的范围内。