一种碱性磷酸酶的检测方法与流程

1.本发明涉及检测碱性磷酸酶领域，特别涉及一种碱性磷酸酶的检测方法。


背景技术：

2.土壤作为“类生命体”，其几乎所有的生物化学反应都是由酶驱动的。土壤酶活性可作为“土壤肥力”、“土壤质量”及“土壤健康”等土壤生物活性和生产力的重要指标。土壤酶促进了土壤腐殖质的形成，进入土壤的有机物质和有机残体转化成土壤腐殖质是一个很复杂的生化过程，这一过程离不开各种酶的催化。
3.本发明涉及土壤中的碱性磷酸酶的检测方法，截至目前，通过色谱法，比色法，化学发光法，电化学法，荧光法，表面增强共振拉曼散射等不同的分析技术已经发展了多种碱性磷酸酶活性的检测方法。其中，荧光检测技术由于其简单灵敏、实时性等优点而受到了高度关注。由于检测土壤中碱性磷酸酶含量，容易由于土壤颜色、土壤中所含的其他元素和土壤酶影响，导致检测结果不准确，因此，本发明提出一种去除背景干扰、准确度高的碱性磷酸酶的检测方法。


技术实现要素：

4.鉴以此，本发明提出一种碱性磷酸酶的检测方法，解决上述问题。
5.本发明的技术方案是这样实现的：
6.一种碱性磷酸酶的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.(1)溶液配制：取试样土壤加入对氨基苯磷酸水溶液中，振荡50-70s，加入脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠，混合，静置8-10min，放入36-38℃恒温培育箱中培育3-5h，加入硫酸铜溶液，离心，取上清液；上清液中加入三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液，摇晃1-3min，制得碱性磷酸酶供试品溶液；
8.(2)样品检测：取步骤(1)制得碱性磷酸酶供试品溶液使用紫外可见分光光度计检测。
9.进一步的，步骤(1)中，所述试样土壤、对氨基苯磷酸水溶液和脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠质量比为1:5-7:0.5-0.8。
10.进一步的，步骤(1)中，所述对氨基苯磷酸水溶液浓度为8-10mmol/l。
11.进一步的，步骤(1)中，所述硫酸铜溶液浓度为7-10mmol/l。
12.进一步的，步骤(1)中，所述硫酸铜溶液和土壤试样的质量比为2-3:1。
13.进一步的，步骤(1)中，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液浓度为200-250mmol/l，调节ph值至7.5-8.5。
14.进一步的，步骤(1)中，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液和上清液体积比为1-3:1。
15.进一步的，步骤(2)中，所述紫外可见分光光度计检测波长为500-550nm。
16.进一步的，所述紫外可见分光光度计检测波长为530nm。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
18.本发明的碱性磷酸酶的检测方法能够准确检出土壤中碱性磷酸酶的含量，具有灵敏度、准确性高，抗干扰能力强等优点。通过对氨基苯磷酸水溶液和脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠作为底物，能够提高碱性磷酸酶酶解活性成分含量，将活性成分结合于供试品溶液体系中，孵化后的活性成分和硫酸铜溶液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液反应，可以提高碱性磷酸酶中活性成分信号，通过验证本发明的碱性磷酸酶试验方法具有高达99％的准确率，检出限为0.01mg/g。
具体实施方式
19.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
20.本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
21.本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
22.实施例1碱性磷酸酶的检测方法
23.(1)溶液配制：取试样土壤加入浓度为8mmol/l的对氨基苯磷酸水溶液中，振荡50s，加入脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠，混合，所述试样土壤、对氨基苯磷酸水溶液和脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠质量比为1:5:0.5，静置8min，放入37℃恒温培育箱中培育3h，加入浓度7mmol/l的硫酸铜溶液，所述硫酸铜溶液和土壤试样的质量比2:1，摇晃5min，使用1100r/min离心2min，取上清液；上清液中加入浓度为200mmol/l的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液，使用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph值至7.5，摇晃1-3min，制得碱性磷酸酶供试品溶液。
24.实施例2碱性磷酸酶的检测方法
25.(1)溶液配制：取试样土壤加入浓度为9mmol/l的对氨基苯磷酸水溶液中，振荡60s，加入脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠，混合，所述试样土壤、对氨基苯磷酸水溶液和脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠质量比为1:6:0.65，静置9min，放入37℃恒温培育箱中培育4，加入浓度8mmol/l的硫酸铜溶液，所述硫酸铜溶液和土壤试样的质量比2.5:1，摇晃5min，使用1100r/min离心2min，取上清液；上清液中加入浓度为230mmol/l的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液，使用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph值至8.0，摇晃2min，制得碱性磷酸酶供试品溶液。
26.实施例3碱性磷酸酶的检测方法
27.(1)溶液配制：取试样土壤加入浓度为10mmol/l的对氨基苯磷酸水溶液中，振荡70s，加入脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠，混合，所述试样土壤、对氨基苯磷酸水溶液和脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠质量比为1:7:0.8，静置10min，放入恒温培育箱中培育5h，加入浓度10mmol/l的硫酸铜溶液，所述硫酸铜溶液和土壤试样的质量比3:1，摇晃5min，使用1100r/min离心2min，取上清液；上清液中加入浓度为250mmol/l的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液，使用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph值至8.5，摇晃1-3min，制得碱性磷酸酶供试品溶液。
28.对比例1
29.在实施例2的基础上，溶液配制中不使用脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠，具体为：取试样土壤加入浓度为9mmol/l的对氨基苯磷酸水溶液中，振荡60s，所述试样土壤和对氨基苯磷酸水溶液质量比为1:6，静置9min，放入37℃恒温培育箱中培育4，加入浓度8mmol/l的硫酸铜溶液，所述硫酸铜溶液和土壤试样的质量比2.5:1，摇晃5min，使用1100r/min离心2min，取上清液；上清液中加入浓度为230mmol/l的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液，使用1mol/l的
氢氧化钠溶液调节ph值至8.0，摇晃2min，制得碱性磷酸酶供试品溶液。
30.对比例2
31.在实施例2的基础上，溶液配制中改变三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液的浓度，具体为：取试样土壤加入浓度为9mmol/l的对氨基苯磷酸水溶液中，振荡60s，加入脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠，混合，所述试样土壤、对氨基苯磷酸水溶液和脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠质量比为1:6:0.65，静置9min，放入37℃恒温培育箱中培育4，加入浓度8mmol/l的硫酸铜溶液，所述硫酸铜溶液和土壤试样的质量比2.5:1，摇晃5min，使用1100r/min离心2min，取上清液；上清液中加入浓度为100mmol/l的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液，使用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph值至8.0，摇晃2min，制得碱性磷酸酶供试品溶液。
32.对比例3
33.在实施例2的基础上，溶液配制中使用醋酸盐缓冲液代替三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液，具体为：取试样土壤加入浓度为9mmol/l的对氨基苯磷酸水溶液中，振荡60s，加入脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠，混合，所述试样土壤、对氨基苯磷酸水溶液和脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠质量比为1:6:0.65，静置9min，放入37℃恒温培育箱中培育4，加入浓度8mmol/l的硫酸铜溶液，所述硫酸铜溶液和土壤试样的质量比2.5:1，摇晃5min，使用1100r/min离心2min，取上清液；上清液中加入浓度为浓度为230mmol/l的醋酸盐缓冲液，使用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph值至8.0，摇晃2min，制得碱性磷酸酶供试品溶液。
34.对比例4
35.在实施例2的基础上，溶液配制中改变试样土壤、对氨基苯磷酸水溶液和脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠质量比，具体为：取试样土壤加入浓度为9mmol/l的对氨基苯磷酸水溶液中，振荡60s，加入脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠，混合，所述试样土壤、对氨基苯磷酸水溶液和脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠质量比为1:3:1，静置9min，放入37℃恒温培育箱中培育4，加入浓度8mmol/l的硫酸铜溶液，所述硫酸铜溶液和土壤试样的质量比2.5:1，摇晃5min，使用1100r/min离心2min，取上清液；上清液中加入浓度为230mmol/l的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液，使用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph值至8.0，摇晃2min，制得碱性磷酸酶供试品溶液。
36.试验例1
37.标准曲线1：分别取0、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5mg/l碱性磷酸酶标准溶液加入浓度为9mmol/l的对氨基苯磷酸水溶液中，振荡60s，加入脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠，混合，所述试样土壤、对氨基苯磷酸水溶液和脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠质量比为1:6:0.65，静置9min，放入37℃恒温培育箱中培育4，加入浓度8mmol/l的硫酸铜溶液，所述硫酸铜溶液和碱性磷酸酶标准溶液的质量比2.5:1，摇晃5min，使用1100r/min离心2min，取上清液；上清液中加入浓度为230mmol/l的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液，使用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph值至8.0，摇晃2min，制得碱性磷酸酶供试品溶液。
38.采用紫外可见分光光度计检测波长530nm进行检测。
39.以x轴为浓度，y轴为吸光度绘制标准曲线方程，y＝0.0243x 0.0012，r2＝0.9998。
40.实验过程，采用不含碱性磷酸酶的土壤制备土壤中含1.5mg/g碱性磷酸酶的试样土壤。根据实施例1-3和对比例1-4的溶液配制方法进行配制碱性磷酸酶供试品溶液，采用紫外可见分光光度计检测波长530nm进行检测，进行两次平行试验。计算准确率，准确率(％)＝实测值/理论值
×
100
41.名称准确率(％)实施例199.51实施例299.89实施例399.63对比例193.85对比例296.17对比例394.11对比例492.88
42.实验结果表明，本发明的检测方法具有准确度高，能够屏蔽土壤颜色、金属元素对碱性磷酸酶检测的干扰。对比例1中碱性磷酸酶孵育中不使用脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠，导致酶解活性成分含量在供试品溶液中下降；对比例2改变改变三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液的浓度导致响应信号降低；对比例3使用醋酸盐缓冲液代替三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液，导致酶解活性成分未能很好和供试品溶液体系相结合导致响应信号降低；对比例4改变试样土壤、对氨基苯磷酸水溶液和脂肪醇聚氧乙烯磺酸钠质量比，导致碱性磷酸酶酶解活性成分含量降低。
43.试验例2
44.实验过程，采用不含碱性磷酸酶的土壤制备土壤中含0.05、0.01mg/g碱性磷酸酶的试样土壤。根据实施例1-3和对比例1-4的溶液配制方法进行配制碱性磷酸酶供试品溶液，采用紫外可见分光光度计检测波长530nm进行检测，进行两次平行试验。计算准确率，准确率(％)＝实测值/理论值
×
100
45.浓度(mg/g)0.050.01项目准确率(％)准确率(％)实施例199.1298.84实施例299.6899.53实施例399.1098.64对比例1未检出未检出对比例260.47未检出对比例353.75未检出对比例444.31未检出
46.实验结果表明，本发明碱性磷酸酶的检测方法，能够增强碱性磷酸酶的信号，检出限为0.01mg/g，对比例1-4改变溶液的制备方法，导致碱性磷酸酶信号下降，在土壤中碱性磷酸酶含量为0.01mg/g时，对比例1-4均检测不出土壤中碱性磷酸酶的含量。
47.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。