一种无硝干腌火腿中锌-原卟啉

一种无硝干腌火腿中锌-原卟啉
ⅸ
的提取纯化方法
技术领域
1.本发明涉及分离纯化技术领域，具体为一种无硝干腌火腿中锌-原卟啉
ⅸ
的提取纯化方法。


背景技术：

2.干腌火腿(dry-cured ham)历史悠久，是以猪后腿为原料，食盐为主要腌制剂，经过长时间的腌制发酵而成的一种发酵肉制品。发酵成熟的干腌火腿肉香浓郁、色泽鲜艳，经历长期的发酵过程后，其腿肉中的营养物质(蛋白质、脂质和微量元素)更易被人体吸收利用，因此深受消费者的喜爱。
3.干腌火腿的鲜红色泽与其本身可销售性和消费者对其的接受性具有很大关联。由于硝盐对肉制品具有良好的发色效果，因此人们常常将硝盐添加到干腌火腿中促进其发色。硝盐促进干腌肉制品发色是由于其参与形成一种亚硝基肌红蛋白(nitroso myoglobin，no-mb)的物质，然而亚硝酸盐的致癌性又引起了人们的广泛关注。在帕尔玛火腿和伊比利亚火腿中，虽然没有添加硝盐，但仍然形成了稳定的鲜红色，并通过研究证实呈现稳定鲜红色的原因是由于其形成了一种新的卟啉化合物—锌-原卟啉
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(zinc protoporphyrin ix，znpp)。znpp作为干腌火腿中的天然着色剂，对其形成过程进行调控，可以改善无硝干腌火腿中鲜红色的形成，并减少亚硝酸盐的使用。
4.目前，国内外关于无硝干腌火腿中znpp的提取纯化工艺研究报道较少，纯度相对较低。分离纯化znpp，对于研究其形成机制和无硝干腌火腿的发色至关重要，因此需要提供一种能够实现高纯度且操作简便的无硝干腌火腿znpp提取方法。


技术实现要素：

5.针对以上问题，本发明提供了一种无硝干腌火腿中锌-原卟啉
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的提取纯化方法，旨在提高无硝干腌火腿中锌-原卟啉
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的回收率。
6.根据本发明的一个目的，本发明提供一种无硝干腌火腿中锌-原卟啉
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的提取纯化方法，包括如下步骤：
7.s1，样品预处理
8.腌制成熟的无硝干腌火腿，经洗霉修割后，取下干腌火腿的股二头肌部分，去除股二头肌中肉眼可见的脂肪和结缔组织，将其切成小块后放入斩拌机斩拌30s，斩拌后的火腿肉糜样品放入外层包裹有锡箔纸的一次性塑料碗中，将其放入-80℃冰箱速冻，移入真空冷冻干燥机中，在-58℃、0pa条件下冷冻干燥3d，取出后迅速用液氮研磨粉碎，并装入真空包装袋中保存；
9.s2，无硝干腌火腿中锌-原卟啉
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的粗提取
10.称取4.00g冷冻干燥后的火腿样品于50ml避光离心管中，并加入20ml事先预冷好的90％丙酮水溶液(丙酮：水，v/v)，摇动数秒后将避光离心管整体浸入冰中，同时使用高速分散器以10000r/min高速匀浆2次，每次15s，中间间隔数秒，然后超声提取10min；
11.提取完成后，取出避光离心管，以4℃、10000r/min的条件离心5min，将上清液通过一次性定性滤纸过滤并收集到避光离心管中，剩余样品残渣再加入20ml事先预冷好的90％丙酮水溶液(丙酮：水，v/v)重复上述步骤提取1次，合并2次提取所得上清液并摇匀；
12.s3，无硝干腌火腿中锌-原卟啉
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的纯化
13.使用微固相萃取装置对90％丙酮水溶液提取所得的锌-原卟啉
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粗提液进行纯化；
14.将s2中提取所得粗提液用蒸馏水1:1(v/v)稀释，混匀后使用一次性定性滤纸过滤，随后转移到一次性反向c
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固相萃取小柱上进行纯化，每根小柱上样量为50ml；
15.在上样之前，先依次加入10ml甲醇和10ml蒸馏水预洗活化反向c
18
固相萃取小柱，打开真空泵，调节预洗活化液流速为1ml/min，预洗活化结束后迅速加入待净化液，调节流速使待净化液以1ml/min的速度过柱，待样品溶液流尽后，接着加入15ml蒸馏水洗涤柱子，最后再用10ml 90％丙酮水溶液洗脱截留在反向c
18
固相萃取小柱上的物质，收集纯化洗脱液；
16.将收集得到的纯化洗脱液再用蒸馏水1:1(v/v)稀释，使用一次性定性滤纸过滤后重复上述步骤上反向c
18
固相萃取小柱进行二次纯化；
17.收集二次纯化洗脱液，使用氮吹仪在室温下氮吹至近干(除去丙酮)，移入真空冷冻干燥机，在-58℃、0pa条件下进行冷冻干燥，收集冻干样品即为锌-原卟啉
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纯化样。
18.进一步地，s2中，90％丙酮水溶液的预冷温度为4℃。
19.进一步地，s2中，在冰水浴条件下进行超声提取。
20.进一步地，s2中，整个提取过程在避光条件下进行。
21.进一步地，s3中，一次性反向c
18
固相萃取小柱的规格为1000mg/6ml。
22.进一步地，s3中，在加入待净化液之前应当保持小柱填料处于湿润状态，若小柱填料处于干燥状态，应当重新预洗活化。
23.本发明的有益效果是：
24.本发明提取无硝干腌火腿中锌-原卟啉
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的过程简单，提纯效果较好，反向c
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固相萃取小柱对锌-原卟啉
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的吸附效果较好，提高了产物的回收率。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.实施例1
27.一种无硝干腌火腿中锌-原卟啉
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的提取纯化方法，包括如下步骤：
28.1.样品预处理
29.腌制成熟的无硝干腌火腿，经洗霉修割后，取下干腌火腿的股二头肌部分，去除股二头肌中肉眼可见的脂肪和结缔组织，将其切成小块后放入斩拌机斩拌30s，斩拌后的火腿肉糜样品放入外层包裹有锡箔纸的一次性塑料碗中，将其放入-80℃冰箱速冻，移入真空冷冻干燥机中，在-58℃、0pa条件下冷冻干燥3d，取出后迅速用液氮研磨粉碎，并装入真空包
装袋中保存。
30.2.无硝干腌火腿中锌-原卟啉
ⅸ
的粗提取
31.称取4.00g左右冷冻干燥后的火腿样品于50ml避光离心管中，并加入20ml事先预冷(4℃)好的90％丙酮水溶液(丙酮：水，v/v)，摇动数秒后将避光离心管整体浸入冰中，同时使用高速分散器以10000r/min高速匀浆2次，每次15s，中间间隔数秒，然后在冰水浴条件下超声提取10min，整个提取过程在避光条件下进行。提取完成后，取出避光离心管，以4℃、10000r/min的条件离心5min，将上清液通过一次性定性滤纸过滤并收集到避光离心管中，剩余样品残渣再加入20ml事先预冷(4℃)好的90％丙酮水溶液(丙酮：水，v/v)重复上述步骤提取1次，合并2次提取所得上清液并摇匀。
32.3.无硝干腌火腿中锌-原卟啉
ⅸ
的纯化
33.使用微固相萃取装置对90％丙酮水溶液提取所得的锌-原卟啉
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粗提液进行纯化。将步骤2中提取所得粗提液用蒸馏水1:1(v/v)稀释，混匀后使用一次性定性滤纸过滤，随后转移到一次性反向c
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固相萃取小柱(1000mg/6ml)上进行纯化，每根小柱上样量为50ml。在上样之前，先依次加入10ml甲醇和10ml蒸馏水预洗活化反向c
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固相萃取小柱，打开真空泵，调节预洗活化液流速为1ml/min左右，预洗活化结束后迅速加入待净化液(在加入待净化液之前应当保持小柱填料处于湿润状态，若小柱填料处于干燥状态，应当重新预洗活化)，调节流速使待净化液以1ml/min左右的速度过柱，待样品溶液流尽后，接着加入15ml蒸馏水洗涤柱子，最后再用10ml 90％丙酮水溶液洗脱截留在反向c
18
固相萃取小柱上的物质，收集纯化洗脱液。将收集得到的纯化洗脱液再用蒸馏水1:1(v/v)稀释，使用一次性定性滤纸过滤后重复上述步骤上反向c
18
固相萃取小柱进行二次纯化。收集二次纯化洗脱液，使用氮吹仪在室温下氮吹至近干(除去丙酮)，移入真空冷冻干燥机，在-58℃、0pa条件下进行冷冻干燥，收集冻干样品即为锌-原卟啉
ⅸ
纯化样。
34.本发明提取无硝干腌火腿中锌-原卟啉
ⅸ
的过程简单，提纯效果较好，反向c
18
固相萃取小柱对锌-原卟啉
ⅸ
的吸附效果较好，提高了产物的回收率。
35.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。