一种黄腐酸检测方法

1.本发明涉及分析化学检测技术领域，具体涉及一种黄腐酸检测方法。


背景技术：

2.黄腐酸是有机肥或土壤碱萃取物中既溶于碱溶液又溶于酸溶液的腐殖酸类物质。黄腐酸具有促进植物生长和抗逆功能，常被作为肥料和饲料添加剂，广泛应用于农业领域中。本发明试剂盒检测速度快、成本低、重现性好，为黄腐酸在有机肥中的应用提供了便捷、快速的检测手段，从而提升了经济效益。
3.目前，黄腐酸的提取检测方法主要是2018年5月1日实施的国家标准《矿物源腐黄腐酸含量的测定》(gb/t 34765-2017)中的容量法和2017年4月1日颁布的行业标准《腐殖酸复合肥料》(hg/t 5046-2016)中的aoac法。两种方法都是利用碱溶酸析原理对黄腐酸进行提取，但对提取后的黄腐酸粗提液的检测原理不相同。容量法是在酸性介质中用过量重铬酸钾氧化黄腐酸中的碳，然后用硫酸亚铁铵溶液进行酸碱滴定，通过碳系数转换间接计算样品中黄腐酸的含量，不仅操作复杂，而且读数时受实验员主观偏差影响较大。aoac法是通过树脂过滤黄腐酸粗提液后得到黄腐酸精华液，再直接比色测定其含量。由于树脂的吸附作用，aoac法测得的黄腐酸含量相比容量法的测定结果偏低；且测定过程受树脂用量、洗涤剂量、洗涤时间等多种因素影响，所以aoac法测定结果重现性差。


技术实现要素：

4.本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种黄腐酸检测方法。采用本发明提供的黄腐酸检测方法，能提高黄腐酸的检测效率，具有灵敏度高、误差小、测定结果稳定、成本低、可以大批量、快速检测样品等优点。
5.本发明是通过如下技术方案实现的，提供一种黄腐酸检测方法，包括以下步骤：
6.(1)将待测样品加至离心管中，加入黄腐酸提取液和去离子水，室温下培养，然后离心，取上清液，备用；
7.(2)往步骤(1)离心后的沉淀依次加入反应液1、反应液2，室温下静置，然后离心，取上清液；
8.(3)往步骤(2)的上清液中加入沉淀剂，室温下静置沉淀，然后离心，取上清液；
9.(4)将步骤(1)得到的上清液和步骤(3)得到的上清液合并，加入去离子水定容，得到待测样液；
10.(5)取待测样液或黄腐酸标准品于消解管中，依次加入消解液1和消解液2，然后将消解管置于消解仪中进行消解；
11.(6)反应结束后取出消解管，待冷却后加入去离子水定容，摇匀，静置，离心；
12.(7)将步骤(6)离心得到的上清液取样至96孔板后，放入酶标仪中测定吸光度；
13.(8)以黄腐酸标准品吸光度为横坐标，以黄腐酸标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线，并拟合曲线方程，将待测样品的吸光度代入标准曲线方程中，计算所对应的浓度，即为
待测样品中黄腐酸的浓度。
14.优选的，所述的黄腐酸提取液为1mol/l的盐酸溶液；所述的反应液1为1mol/l的氢氧化钠溶液；所述的反应液2为0.1mol/l的氢氧化钠溶液；所述的沉淀剂为2mol/l的硫酸溶液；所述的消解液1为质量分数为98％的浓硫酸；所述的消解液2为1.6mol/l的重铬酸钾溶液。
15.优选的，所述的黄腐酸标准品的浓度分别为0.2g/l、0.5g/l、1g/l、2g/l、4g/l、8g/l。
16.优选的，步骤(1)中，所述待测样品与黄腐酸提取液的用量比为0.1g:1ml，所述黄腐酸提取液与去离子水的体积比为1:9，所述室温下培养是室温下培养1h；所述离心是1000 rpm离心15min。
17.步骤(2)中，所述反应液1和反应液2的体积比为1:9；所述室温下静置是室温下静置4h；所述离心是6500rpm离心10min。
18.步骤(3)中的沉淀剂与步骤(2)中的反应液1的体积比为3:1，步骤(3)中，所述室温下静置沉淀是室温下静置沉淀12h，所述离心是8000rpm离心10min。
19.步骤(4)中，所述加入去离子水定容是定容至25ml。
20.步骤(5)中，所述待测样液或黄腐酸标准品、消解液1、消解液2的体积比为1.2:1.5:1；所述消解是在165℃下消解30min。
21.步骤(6)中，所述加入去离子水定容是定容至10ml；所述静置是静置5～20min；所述离心是6000～10000rpm离心5min。
22.步骤(7)中，所述取样的取样量是280μl；所述测定吸光度是测定585nm下的吸光度，以去离子水作参比。
23.如需快速并概略判断待测样本中黄腐酸的含量，在步骤(5)中可只取待测样液进行消解，然后将步骤(6)中离心后的上清液加入96孔板后，观察其颜色，与标准色卡上的色阶进行对照，读出样液与标准色卡相同的颜色对应的黄腐酸含量的数值，再比上其样品的质量即为样品中黄腐酸的含量(％)。
24.本发明检测黄腐酸的原理是：在待测样本的黄腐酸粗提液或黄腐酸标准液中加入浓硫酸和重铬酸钾经高温消解后测定其585nm处的吸光值，根据黄腐酸标准液经消解后的吸光度与其浓度的关系，用外标法计算待测样本中黄腐酸的含量。
25.与国标gb/t 34765-2017容量法比较，本发明对待测样本黄腐酸的提取步骤进行优化，先用稀盐酸对样品进行预处理，使萃取更加温和且充分(先除去碳酸盐等矿物，释放被矿物包裹的黄腐酸类有机质)。本发明中浓硫酸的使用量是国标法的一半，可减少毒害性废液产生量，更加环保。另外，本发明的优势在于国标法检测是酸碱滴定法检测(重铬酸钾 浓硫酸)，读数时受实验员主观偏差影响较大。本发明利用重铬酸钾浓度与颜色之间的关系，使用比色法由分光光度计读数更客观，而上述的操作更便于比色法的操作。本发明测定方法具有灵敏度高、误差小、测定结果稳定、成本低、可以大批量、快速检测样品等优点。
附图说明
26.图1为黄腐酸测定标准曲线。
27.图2为本发明方法的操作示意图。
28.图3为消解温度对响应值的影响示意图。
29.图4为消解时间对响应值的影响示意图。
具体实施方式
30.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
31.实施例1
32.一种黄腐酸检测试剂盒，包含黄腐酸提取液、反应液1、反应液2、沉淀剂、消解液1和消解液2和黄腐酸标准品。所述的黄腐酸提取液为1mol/l的盐酸溶液；所述的反应液1为1 mol/l的氢氧化钠溶液；所述的反应液2为0.1mol/l的氢氧化钠溶液；所述的沉淀剂为2mol/l 的硫酸溶液；所述的消解液1为质量分数为98％的浓硫酸；所述的消解液2为1.6mol/l的重铬酸钾溶液；所述的黄腐酸标准品的浓度分别为0.2g/l、0.5g/l、1g/l、2g/l、4g/l、8g/l。
33.一种利用上述黄腐酸检测试剂盒测定鸡粪肥中黄腐酸含量方法，包括以下步骤：
34.(1)称取0.1g鸡粪肥于25ml离心管中，加入1ml 1mol/l的盐酸溶液和9ml去离子水，将试管置于带轨道和水平振动器的箱形培养箱中，室温下培养1h，然后低速离心1000 rpm离心15min，取上清液，将上清液保存至新的离心管中，备用；
35.(2)往步骤(1)离心后的沉淀依次加入1ml 1mol/l的氢氧化钠溶液、9ml 0.1mol/l 的氢氧化钠溶液，室温下静置4h，然后在6500rpm离心10min，取上清液；
36.(3)往步骤(2)的上清液中加入3ml 2mol/l的硫酸溶液，室温下静置沉淀12h，然后在8000rpm离心10min，取上清液；
37.(4)将步骤(1)得到的上清液和步骤(3)得到的上清液合并，加入去离子水定容至 25ml，得到待测样液；
38.(5)取1.5ml待测样液或黄腐酸标准品(0.2g/l、0.5g/l、1g/l、2g/l、4g/l、8g/l) 于消解管中，依次加入1.875ml质量分数为98％的浓硫酸和1.25ml 1.6mol/l的重铬酸钾溶液，然后将消解管置于消解仪中，在165℃下消解30min；
39.(6)反应结束后取出消解管，待冷却后加入去离子水定容至10ml，摇匀，静置20min，取1.5ml到2ml离心管，6000rpm离心5min，取上清液；
40.(7)取280μl步骤(6)离心得到的上清液，并加入到96孔板中，置于酶标仪中，测定585nm下吸光度，以去离子水作参比；
41.(8)以黄腐酸标准品吸光度为横坐标，以黄腐酸标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线，并拟合曲线方程y＝3.9521x 0.0312，r2＝0.9991，见图1，将待测样品的吸光度代入标准曲线方程中，计算所对应的浓度，即为鸡粪肥中黄腐酸的浓度，将检测得到的黄腐酸质量除以鸡粪肥质量计算得到鸡粪肥中黄腐酸的含量为1.06％。本发明方法的操作示意图见图2。
42.进一步的，分别考察了不同消解温度(100℃、121℃、135℃、165℃)和不同消解时间(15min、30min、45min)对响应值的影响，其具体的检测步骤与上述黄腐酸含量检测步骤相同，区别在于，调整不同的消解温度或消解时间，其余步骤参数保持一致，结果见图3和图4。结果显示，在消解温度为165℃、消解时间为30min的条件下，黄腐酸含量检测的响应值最高。
43.实施例2
44.基于实施例1的检测试剂盒进行加标回收率、精密度和线性评价
45.(1)有机肥中黄腐酸含量检测试剂盒加标回收率评价
46.将有机肥经本发明试剂盒提取后，取除去黄腐酸后的沉淀，于160℃烘干，作为空白基质。取0.5g基质，分别加入0g、0.0125g、0.2g黄腐酸标准品，经本发明试剂盒提取测定其黄腐酸的含量，结果表明本发明试剂盒提取测定后的加标回收率为107.5％～120％。
47.(2)有机肥中黄腐酸含量检测试剂盒精密度评价
48.检测一个黄腐酸含量高、中、低浓度水平的样本：蚯蚓粪肥、鸡粪肥、兔粪肥，每个浓度检测3次，使用变异系数评价。结果见表1，表1中数据显示批内变异系数均小于5％，判定本发明试剂盒合格。
49.表1精密度评价结果
[0050][0051][0052]
(3)有机肥中黄腐酸含量检测试剂盒线性评价
[0053]
测试有机肥中黄腐酸含量检测试剂盒的线性。按试剂盒的检测说明步骤进行分析，经检测后绘制的标准曲线为y＝3.9521x 0.0312，r2＝0.9991。数据表明在该实验条件下，有机肥中黄腐酸含量检测试剂盒在0.2～8g/l浓度范围内线性良好。
[0054]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。