一种低温促进丛枝菌根真菌菌丝体萌发的方法和应用

1.本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种低温促进丛枝菌根真菌菌丝体萌发的方法和应用。


背景技术：

2.丛枝菌根真菌可以与80％陆地植物的根系建立共生关系，促进宿主植物对矿质养分，如磷和氮的吸收；提高农作物对生物和非生物胁迫的抗性，比如提高农作物对养分贫瘠、干旱、重金属毒害、酸碱度胁迫、病虫害等的耐受性，改善农作物的生长势，进而提高农作物的产量和品质。因此，丛枝菌根真菌在农业生产上具有很大的应用潜力。
3.丛枝菌根真菌与植物建立共生关系的过程中，孢子萌发，菌丝伸长并分支，植物根系释放分支因子独脚金内酯等物质引导丛枝菌根真菌菌丝朝着植物根系分支生长，同时丛枝菌根真菌也会释放菌根因子如脂壳寡糖，与植物之间进行信号交流。丛枝菌根真菌菌丝到达根系后会在表皮形成菌足，从菌足处侵入植物皮层细胞，在根细胞内形成丛枝、孢子和泡囊，之后继续向根外生长形成根外菌丝和孢子。丛枝菌根真菌菌剂中一般含有孢子、菌丝和侵染根段，它们都是丛枝菌根真菌的繁殖体。在丛枝菌根真菌与根系共生过程中，繁殖体萌发率的高低和萌发管的长度对共生关系的建立，及共生效率的高低和促生效应的大小具有决定作用，也是量化菌剂质量的重要指标。一般来说，菌剂中繁殖体的萌发率越高、萌发菌丝越长，则菌剂对农作物根系的侵染越好，对农作物生长的促进效应越大。因此，如何提高丛枝菌根真菌的繁殖体活力是其扩繁技术中的一个重要因素，也是有效提高菌剂质量的重要途径。
4.目前，对丛枝菌根真菌繁殖体的研究均集中在孢子上，通常情况下丛枝菌根真菌孢子的萌发率会随着培养时间的增加而降低。现有技术(申请号为201410205346.5)公开了一种促进丛枝菌根真菌孢子萌发的方法，使用rit-dna转基因的胡萝卜毛状根分泌液，外加葡萄糖和适当氮源促进了glomus intraradices孢子的萌发和萌发管的伸长。但是，该方法需要对毛状根的分泌物进行收集浓缩等，操作复杂，步骤繁琐。另一技术(申请号为202110393088.8)在培养基中添加一定浓度的硒元素促进孢子萌发和菌丝生长。操作相对简单，但是仍然需要额外添加硒酸钠。
5.现有的技术均是关于提高丛枝菌根真菌孢子萌发率的研究，菌丝是丛枝菌根真菌菌剂非常重要的繁殖体，目前还没有关于提高菌丝体活力和萌发率的技术。因此，研究一种操作简便，且能促进丛枝菌根真菌菌剂中菌丝体萌发的方法具有重大意义，是提高丛枝菌根真菌菌剂质量的重要措施。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种低温促进丛枝菌根真菌菌丝体萌发的方法。
7.本发明的低温促进丛枝菌根真菌菌丝体萌发的方法，其是将丛枝菌根真菌菌丝或含菌丝的菌剂置于低温保藏，然后以此低温保藏的菌丝或从菌剂中分离出的菌丝进行萌发
生长。
8.优选，所述的低温是4℃。进一步优选，所述的保藏是4℃保藏不超过6个月，优选保藏3-6个月。
9.优选，所述的丛枝菌根真菌是异形根孢囊霉。进一步优选，所述的异形根孢囊霉是异形根孢囊霉daom197198。
10.本发明的第二个目的是低温保藏在促进丛枝菌根真菌菌剂质量中的应用。
11.优选，是低温保藏在促进丛枝菌根真菌菌丝体萌发和/或生长中的应用。
12.优选，所述的低温是4℃。进一步优选，所述的保藏是4℃保藏不超过6个月，优选保藏3-6个月。
13.优选，所述的生长是萌发管长度增加。
14.本发明具有以下有益效果：
15.本发明经过创造性的探索实验，通过对双重培养体系扩繁的丛枝菌根真菌菌剂低温(4℃)处理，显著提高了菌丝体的萌发率和萌发管的长度。与初始萌发率相比，低温处理6个月的菌丝体萌发率提高了36.23％；萌发管长度大于1mm的比例提高了327％。
16.基于此，本发明提供了一种低温促进丛枝菌根真菌菌丝体萌发的方法及其应用，该方法能够提高丛枝菌根真菌菌丝的萌发率，且能够显著增加丛枝菌根真菌的萌发管的长度，还具有操作简便、成本低等优点。因此，在促进丛枝菌根真菌菌丝萌发或提高丛枝菌根真菌菌剂质量中具有广泛的应用前景。
附图说明：
17.图1是实施例1中异形根孢囊霉daom197198菌丝在不同处理中的萌发情况；其中，图a是培养初始时菌丝体的萌发情况；图b是在4℃保存6个月后菌丝的萌发情况；白色箭头表示菌丝萌发管生长的方向。
具体实施方式
18.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
19.实施例1不同保存温度对丛枝菌根真菌菌丝体萌发的影响
20.1、实验方法
21.本实施例选用丛枝菌根真菌的模式菌种(异形根孢囊霉daom197198)来研究不同培养温度对丛枝菌根真菌菌丝体萌发的影响，具体的实验方法和实验结果分别如下：
22.(1)使用番茄毛状根-丛枝菌根真菌双重培养体系扩繁的异形根孢囊霉daom197198菌剂，扩繁3个月后繁殖体的活力最高，此时将菌剂一部分置于4℃冷库保存，一部分置于25℃培养箱保存，保存时间6个月。
23.(2)双重培养体系扩繁的异形根孢囊霉daom197198菌剂，在不同温度(4℃和25℃)下保存6个月后测定菌丝的萌发率和萌发管长度。将培养皿中的培养物全部转移至50ml离心管中，加入3倍体积10mm ph6.0的柠檬酸钠缓冲液，在摇床上震荡(震荡转速为120rpm，温度为25℃)1h后，用25μm的尼龙膜将所述溶液过滤，然后用无菌水清洗2次，获得丛枝菌根真菌繁殖体，包括根段、菌丝和孢子。
24.(3)msr培养基的配方为(1l中的添加量)：mgso4·
7h2o：739mg；kno3：76mg；kcl：
65mg；ca(no3)2·
4h2o：359mg；kh2po4：4.1mg；mnso4·
4h2o：2.45mg；znso4·
7h2o：0.28mg；h3bo3：1.85mg；cuso4·
5h2o：0.22mg；(nh4)6mo7o
24
·
4h2o：0.034mg；namoo4·
2h2o：0.0024mg；盐酸硫胺素(vb1)：1mg；盐酸吡哆醇(vb6)：0.9mg；烟酸：1mg；泛酸钙：0.9mg；维生素b
12
：0.4mg；生物素：0.0009mg；nafeedta：8mg；蔗糖：10g；植物凝胶：2.5g，ph：5.5，封好口后121℃高温高压灭菌15min。
25.(4)在超净工作台上倒入培养皿冷却凝固后备用。
26.(5)在超净工作台上体式显微镜下，用两把镊子，双手操作，将缠绕在毛状根上的孢子和菌丝挑出，置于msr培养基上。然后将菌丝和孢子分离，并将缠绕在一起的菌丝分开。
27.(6)将每条菌丝分成大于1.5mm长的菌丝段，接种到新的msr培养基中，每个培养基中接种50条左右的菌丝段，用封口膜封口，置于恒温培养箱中暗培养(培养温度为25℃)。
28.(7)在25℃恒温培养箱中暗培养3周后，将培养皿拿出，倒置放在体视显微镜下观察并统计每个培养皿中菌丝的萌发情况。
29.2、实验结果
30.低温对番茄毛状根-丛枝菌根真菌双重培养体系扩繁的异形根孢囊霉daom197198菌剂中菌丝体萌发率的影响结果如表1所示，可以看出，与25℃保存相比，低温保存极显著提高了丛枝菌根真菌菌丝体的萌发率和萌发管长度。不同温度保存6个月后，4℃处理菌丝体的萌发率极显著高于25℃处理，约是25℃处理的13倍。25℃保存6个月后，虽然仍然有部分菌丝能够萌发，但其萌发管长度均小于1mm，4℃保存处理极显著增加了萌发管长度。
31.表1不同培养温度对丛枝菌根真菌菌丝体萌发的影响
32.处理温度菌丝萌发率(％)萌发管长度大于1mm的比例(％)25℃5.00
±
1.110
±
04℃64.52
±
3.58***42.62
±
5.47***
33.注：“***”表示独立样本t检验在p≤0.001水平时有显著差异。
34.实施例2低温保时间对丛枝菌根真菌菌丝萌发的影响
35.1、实验方法
36.本实施例选用丛枝菌根真菌的模式菌种(异形根孢囊霉daom197198)来研究低温保存对丛枝菌根真菌菌丝体萌发的影响，具体的实验方法和实验结果分别如下：
37.(1)番茄毛状根-丛枝菌根真菌双重培养体系扩繁的异形根孢囊霉daom197198菌剂，扩繁3个月后其繁殖体的活力最高。将此时的菌剂作记为0个月，然后将菌剂置于4℃保存3个月和6个月。
38.(2)对异形根孢囊霉daom197198菌剂进行低温(4℃)保存，分别在保存0个月、3个月和6个月后，将培养皿中的培养物全部转移至50ml离心管中，加入3倍体积10mm ph6.0的柠檬酸钠缓冲液，在摇床上震荡(震荡转速为120rpm，温度为25℃)1h后，用25μm的尼龙膜将所述溶液过滤，然后用无菌水清洗2次，获得丛枝菌根真菌繁殖体，包括根段、菌丝和孢子。
39.(3)配置msr培养基，其配方为(1l中的添加量)：mgso4·
7h2o：739mg；kno3：76mg；kcl：65mg；ca(no3)2·
4h2o：359mg；kh2po4：4.1mg；mnso4·
4h2o：2.45mg；znso4·
7h2o：0.28mg；h3bo3：1.85mg；cuso4·
5h2o：0.22mg；(nh4)6mo7o
24
·
4h2o：0.034mg；namoo4·
2h2o：0.0024mg；盐酸硫胺素(vb1)：1mg；盐酸吡哆醇(vb6)：0.9mg；烟酸：1mg；泛酸钙：0.9mg；维生素b
12
：0.4mg；生物素：0.0009mg；nafeedta：8mg；蔗糖：10g。配置1l的msr培养基调节ph至5.5
后分装到两个1l的锥形瓶中，每瓶500ml。每瓶加入植物凝胶：2.5g，ph：5.5。封好口后121℃高温高压灭菌15min。
40.(4)在超净工作台上倒入培养皿冷却凝固后备用。
41.(5)在超净工作台上体式显微镜下，用两把镊子，双手操作，将缠绕在毛状根上的孢子和菌丝挑出，置于msr培养基上。然后将菌丝和孢子分离，并将缠绕在一起的菌丝分开。
42.(6)接着将每条菌丝分成大于1.5mm长的菌丝段，接种到新的msr培养基中，每个培养基中接种50条左右的菌丝段，用封口膜封口，置于恒温培养箱中暗培养(培养温度为25℃)。
43.(7)在25℃恒温培养箱中暗培养3周后，将培养皿拿出，倒置放在体视显微镜下观察并统计每个培养皿中菌丝的萌发情况。
44.2、实验结果
45.本实施例2中菌丝萌发的情况如图1a和b所示，与初始时菌丝萌发情况相比，4℃保存6个月后菌丝体萌发率和萌发管长度均增加。
46.从表2可以看出随着低温培养时间的增加，菌丝体的萌发率不断增加。初始的菌丝萌发率为47.36％，低温处理6个月后菌丝的萌发率为64.52％，显著高于初始萌发率，提高了36.23％。低温处理中萌发管长度大于1mm的比例也显著增加，是初始值的4.27倍。
47.表2低温处理对菌丝萌发的影响
48.4℃处理时间菌丝萌发率(％)萌发管长度大于1mm的比例(％)0月47.36
±
2.95b9.97
±
1.57b3月52.56
±
3.97ab42.05
±
4.30a6月64.52
±
3.58a42.62
±
5.47a
49.注：不同小写字母表示不同处理之间菌丝萌发率在p≤0.05水平时有显著差异；不同大写字母之间表示不同处理之间萌发管长度大于1mm的比例在p≤0.05水平时有显著差异。
50.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。