生成哑铃形DNA载体的方法

技术特征：
1.一种生成哑铃形载体的无克隆和无核酸内切酶的方法，所述哑铃形载体包含发夹结构的表达盒，所述方法包括：i)提供包含单链核酸模板的制剂，所述单链核酸模板包含靶核酸分子，所述靶核酸分子包含两个互补序列区段，其中每个区段包含转录启动子序列并且进一步包含转录终止子，并且其中所述两个互补序列区段由第三序列区段隔开；ii)提供其中所述单链核酸模板额外包含茎的制剂；iii)使所述单链核酸模板与包含3
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羟基的第一寡核苷酸引物接触，所述第一寡核苷酸引物与所述单链核酸模板的3’末端核苷酸序列的至少部分互补，并且进一步包含与所述靶核酸分子不互补的5’核苷酸序列，其中所述寡核苷酸引物包含编码发夹结构rna的3’臂的序列；并且进一步使所述单链核酸模板与第一阻断寡核苷酸接触，所述第一阻断寡核苷酸与所述单链核酸模板的5’末端核苷酸序列的至少部分互补；iv)提供聚合酶链反应组分以对3’退火的第一寡核苷酸引物进行引物延伸；v)使所述延伸的寡核苷酸引物与包含3
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羟基的第二寡核苷酸引物接触，所述第二寡核苷酸引物与所述延伸的寡核苷酸引物的3’末端核苷酸序列的至少部分互补并且进一步包含与所述靶核酸分子不互补的5’核苷酸序列，其中所述寡核苷酸引物包含编码发夹结构rna的3’臂的序列；并且进一步使所述单链核酸模板与第二阻断寡核苷酸接触，所述第二阻断寡核苷酸与所述延伸的寡核苷酸引物的5’末端核苷酸序列的至少部分互补；vi)将所述模板进行聚合酶链扩增以合成模板dna的池并将所述模板退火以生成双链核酸，所述双链核酸在正链和负链的5’核苷酸序列处包含编码发夹结构rna的3’臂的序列，并且在正链和负链的3’核苷酸序列处包含编码发夹结构rna的5’臂的序列；vii)使所述双链核酸热变性，然后冷却以允许所得正链和负链dna的分子内重新折叠，以建立由正链或负链dna组成的预形成的寡聚茎环结构；viii)将正链和负链dna的所述预形成的寡聚环结构与单链特异性dna连接酶接触以在分子内连接中将末端5
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磷酸化的5’突出端与相同dna链的3’突出端的末端3
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oh基团连接，以建立共价闭合的正链衍生和负链衍生的哑铃形载体dna，其包含发夹结构的模板dna，用于发夹结构rna的转录；ix)将所述哑铃形载体dna与dna核酸外切酶接触，以去除所有引物和含有5’和3’端的非共价闭合dna。2.一种生成哑铃形载体的无克隆和无限制性核酸内切酶的方法，所述载体包含表达盒，所述方法包括：i)提供包含单链核酸模板的制剂，所述单链核酸模板包含靶核酸分子，所述靶核酸分子包含两个互补序列区段，其中每个区段包含转录启动子序列并且进一步包含转录终止子，并且其中所述两个互补序列区段由第三序列区段隔开；ii)提供其中所述单链核酸模板额外包含茎的制剂；iii)使所述单链核酸模板与包含3
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羟基的第一寡核苷酸引物接触，所述第一寡核苷酸引物与所述单链核酸模板的3’末端核苷酸序列的至少部分互补，并且进一步包含与所述靶核酸分子不互补的5’核苷酸序列；并且进一步使所述单链核酸与第一组阻断寡核苷酸接触，所述第一组阻断寡核苷酸包含与所述单链核酸模板的5’末端核苷酸序列的至少部分互补的一种、两种、三种或更多种寡核苷酸；
iv)提供聚合酶链反应组分以对3’退火的第一寡核苷酸引物进行引物延伸；v)使所述延伸的寡核苷酸引物与包含3
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羟基的第二寡核苷酸引物接触，所述第二寡核苷酸引物与所述延伸的寡核苷酸引物的3’末端核苷酸序列的至少部分互补并且进一步包含与所述靶核酸分子不互补的5’核苷酸序列；并且进一步使所述单链核酸模板与第二组阻断寡核苷酸接触，所述第二组阻断寡核苷酸包含与所述延伸的寡核苷酸引物的5’末端核苷酸序列的至少部分互补的一种、两种、三种或更多种寡核苷酸；vi)将模板进行聚合酶链扩增以合成延伸的寡核苷酸引物的池(并且将所述模板进行退火以建立双链核酸，所述双链核酸在正链和负链的5’核苷酸序列处包含编码发夹结构rna的3’臂的序列，并且在正链和负链的3’核苷酸序列处包含编码发夹结构rna的5’臂的序列)；vii)使所述延伸的寡核苷酸引物的池与包含3’羟基的第三寡核苷酸引物接触，所述第三寡核苷酸引物与由所述第一寡核苷酸引物延伸的寡核苷酸引物的3’末端核苷酸序列的至少部分互补，并且进一步包含与所述延伸的寡核苷酸引物不互补的5’核苷酸序列；并且进一步使所述延伸的寡核苷酸引物的池与包含3’羟基的第四寡核苷酸引物接触，所述第四寡核苷酸引物与由所述第二寡核苷酸引物延伸的寡核苷酸引物的3’末端核苷酸序列的至少部分互补，并且进一步包含与所述延伸的寡核苷酸引物不互补的5’核苷酸序列；并且进一步使所述延伸的寡核苷酸引物与所述第一组和第二组阻断寡核苷酸接触；viii)使用第五和第六、第七和八对或更多对寡核苷酸引物重复步骤iv)和vii)，其中最后一组引物包含3’羟基基团和5’磷酸基团；ix)将所述模板进行聚合酶链扩增以合成延伸的寡核苷酸引物的池并且将所述模板退火以建立双链核酸，所述双链核酸在正链和负链的5’核苷酸序列处包含编码发夹结构rna的3’臂的序列，并且在正链和负链的3’核苷酸序列处包含编码发夹结构rna的5’臂的序列；x)使所述双链核酸热变性，然后冷却以允许所得正链和负链dna的分子内重新折叠，以建立由正链或负链dna组成的预形成的寡聚茎环结构；xi)将所述预形成的寡聚环结构的正链和负链dna与单链特异性dna连接酶接触，以分子内连接将末端5
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磷酸化的5’突出端与相同dna链的3’突出端的末端3
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oh基团连接，以建立共价闭合的正链衍生和负链衍生的哑铃形载体dna，其包含发夹结构的模板dna，用于发夹结构rna的转录；xii)将所述哑铃形载体dna与dna核酸外切酶接触，以去除所有引物和含有5’和3’端的非共价闭合dna。3.一种生成包含两个表达盒的哑铃形双表达载体的无克隆和无限制性核酸内切酶的方法，其中所述载体包括：i)提供包含第一单链核酸模板的制剂，所述第一单链核酸模板包含靶核酸分子，所述靶核酸分子包含5’末端序列处的第一转录启动子的反向互补序列和3’末端序列处的第二转录终止子的序列；ii)使所述第一单链核酸模板与包含5
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磷酸和3
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羟基基团的第一寡核苷酸引物接触，所述第一寡核苷酸引物与所述单链核酸模板的3’末端核苷酸序列的至少部分互补并且进一步包含与所述靶核酸分子不互补的5’核苷酸序列，其中所述寡核苷酸引物包含待转录的第一感兴趣的序列，并且进一步包含第一转录终止子的反向互补序列，并且进一步包含
mirna、反义rna、反义mirna、适体、反式剪接rna、引导rna、单引导rna、crrna或tracrrna、mrna或pre-mrna。15.根据权利要求12的方法，其中所述待转录的核酸序列编码治疗性蛋白质或肽。16.根据权利要求13的方法，其中所述治疗性蛋白质或肽选自：cas9、cas9n、hspcas9、hspcas9n、hsvtk、细胞死亡触发蛋白、霍乱毒素、白喉毒素、α毒素、炭疽5毒素、外毒素、百日咳毒素、志贺毒素、志贺样毒素fas、tnf、半胱天冬酶、起始半胱天冬酶、半胱天冬酶2、8、9、10、11、12和效应半胱天冬酶、半胱天冬酶3、6、7和嘌呤核苷磷酸化酶。17.根据权利要求1至16中任一项的方法，其中所述第一和所述第二寡核苷酸引物包含5’磷酸。18.根据权利要求1至17中任一项的方法，其中所述发夹结构的rna序列为小发夹rna或microrna前体。19.根据权利要求1至18中任一项的方法，其中所述阻断寡核苷酸与所述单链核酸模板或所述延伸的寡核苷酸引物的完整的5’末端那一半核苷酸序列互补。20.根据权利要求19的方法，其中所述阻断寡核苷酸包含seq id no:9和seq id no:10中所示的核苷酸序列。21.根据权利要求1至20中任一项的方法，其中所述热变性包括在96℃下孵育5分钟。22.根据权利要求1至21中任一项的方法，其中所述冷却包括从96℃逐渐冷却至室温。23.根据权利要求1至22中任一项的方法，其中所述dna连接酶是单链特异性或双链特异性dna连接酶。24.根据权利要求1至23中任一项的方法，其中所述单链特异性dna连接酶是环化连接酶。25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述核酸外切酶是t7 dna聚合酶。26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中，所述第一和第二寡核苷酸引物在其与所述靶核酸分子不互补的5’核苷酸序列中包含翻译起始密码子的反向互补序列cat。27.根据权利要求1至26中任一项的方法，其中所述最后一组引物的引物在其与所述延伸的寡核苷酸引物不互补的5’核苷酸序列中包含翻译终止密码子tag、taa或tga的反向互补序列cta、tta或tca。28.根据权利要求1至27中任一项的方法，其中所述最后一组引物的引物在其与所述延伸的寡核苷酸引物不互补的5’核苷酸序列中包含转录终止子的反向互补序列。29.根据权利要求3至28中任一项的方法，其中所述寡核苷酸引物包含与所述靶核酸分子不互补但包含形成茎环结构的在其部分长度上内部互补的区域的核苷酸序列。30.根据权利要求3至29中任一项的方法，其中所述寡核苷酸引物在其部分长度上包括回文核苷酸序列。31.根据权利要求3至30中任一项的方法，其中所述寡核苷酸引物修饰是在所述引物中包含通过dna聚合酶引物延伸期间不被识别为碱基配对模板的位点。32.根据权利要求3至31中任一项的方法，其中所述寡核苷酸引物修饰是在所述引物中包含无碱基位点。33.根据权利要求3至32中任一项的方法，其中所述无碱基位点是无嘌呤/无嘧啶位点。34.根据权利要求3至33中任一项的方法，其中所述无嘌呤/无嘧啶位点包括四氢呋喃。
35.根据权利要求3至34中任一项的方法，其中所述无碱基位点包含至少一个或至少三个无嘌呤/无嘧啶位点。36.根据权利要求3至35中任一项的方法，其中所述无碱基位点将与所述单链核酸模板的3’末端核苷酸序列互补的区域和与所述靶核酸分子不互补的5’核苷酸序列分隔开。37.根据权利要求3至36中任一项的方法，其中所述寡核苷酸引物包含非互补核苷酸序列，所述非互补核苷酸序列包含转录终止子。38.一种用于转染分离自人类对象的原代细胞的方法，包括：i)提供包含待转染细胞的分离样本；ii)形成包含所述分离细胞样本的制剂，并使所述样本与使用权利要求1至37中任一项的方法制备的哑铃形载体接触；iii)提供能够将所述哑铃形载体引入所述原代细胞样本并持续表达包含在所述载体中的核酸分子的转化条件。39.一种治疗患有将受益于基因治疗的疾病的患者的离体方法，包括以下步骤：i)从所述对象获得包含待转染细胞的样本；ii)形成包含使用权利要求1至37中任一项的方法制备的哑铃形载体的细胞培养制剂，并且提供条件以将所述载体转染到所述细胞；以及iii)将转染的细胞施用于所述对象。40.seq id no:23中所示的核酸序列。41.包含seq id no:23中所示的核苷酸序列的dna载体。

技术总结
哑铃形DNA最小载体代表仅由感兴趣的基因表达盒和末端闭合环结构组成的遗传载体。用于小发夹RNA或microRNA表达的哑铃载体体积非常小，这对于细胞传递和核扩散是有利的。用于生成表达小RNA的哑铃载体的常规策略需要克隆相应的质粒载体，该载体随后用于哑铃保护。在这里，我们提出了一种新的无克隆方法，用于生成表达小RNA的哑铃载体，该载体也不需要任何限制性内切酶。该方法包括使用含有感兴趣序列的有义或反义链的引物对通用DNA模板进行PCR扩增，将扩增产物变性和重折叠以形成茎环结构，并使用DNA连接酶将结构共价闭合以获得哑铃结构。构。构。


技术研发人员：帕策尔 S
受保护的技术使用者：新加坡国立大学
技术研发日：2020.08.21
技术公布日：2022/6/10