改善肉仔鸡肠道菌群的促生饲料添加剂及其制备与应用

1.本发明涉及畜禽饲料技术领域，具体涉及一种改善肉仔鸡肠道菌群的促生饲料添加剂及其制备与应用。


背景技术：

2.当前推进畜牧业转型升级、研发高效、安全和抗生素饲料添加剂替代技术愈来愈受到人们的重视。研发能够提高畜禽生产性、提高饲料效率、降低饲料成本、维护畜禽肠道健康、减少抗生素使用、减少粪便排放和温室气体排放的功能性饲料添加剂，符合相关产业的发展方向。
3.畜禽肠道不仅是营养物质消化吸收的主要部位，也是重要的免疫器官和内分泌器官，对畜禽健康和生长发育起着至关重要的作用。小肠上皮作为动物更新速度最快的器官，其分化对于肠道应激后的损伤修复、肠道屏障以及肠道功能的正常行使具有非常重要的意义。肠道健康主要涉及到肠道黏膜组织结构、肠道免疫、生长因子、黏蛋白、紧密连接和肠道微生物等方面的因素。研究表明，肠道黏膜组织结构与其吸收功能密切相关，任何形态学的改变都会导致肠道的功能受损。
4.目前，我国肉仔鸡养殖存在饲养密度大、环境恶劣和管理技术偏低的状况，导致肉仔鸡肠道和呼吸道疾病增加，影响了肉仔鸡的生产性能和企业效益。研制能够提高肉仔鸡生产性能和维护肠道健康的饲料添加剂越来越成为科技工作者关注的热点。
5.公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种改善肉仔鸡肠道菌群的促生饲料添加剂及其制备与应用，以解决当前肉仔鸡生产性能不足和肠道健康不佳的技术问题。
7.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：设计一种饲料添加剂，其有效成分由桃胶、卤素甲基蛋氨酸组成。
8.所述桃胶、卤素甲基蛋氨酸的质量比为300～350：1。
9.所述饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：取桃胶、卤素甲基蛋氨酸混合，按1g：0.8～1.2ml的固液比加水混匀后摊开，于45～55℃烘干，碎粉后过20～60目筛，即成。
10.设计一种肉仔鸡饲料，含基础饲粮，还添加有所述肉仔鸡饲料添加剂。
11.所述肉仔鸡饲料添加剂的添加量为1～4g/kg所述基础饲粮。
12.所述基础饲粮包括以下重量份的原料：玉米520～550份、豆粕200～220份、花生粕25～35份、棉粕80～120份、豆油18～22份、次粉75～85份、石粉10～15份、磷酸氢钙 7～10份、食盐 2.8～3.5份；每千克所述基础饲粮添加有以下预混料成分：
维生素a 8000～12000 iu、维生素d 2400～2600 iu、维生素e 45～55mg、维生素k3 1.8～2.2mg、维生素b1 1.8～2.2mg、维生素b2 8～12mg、维生素b6 0.8～1.2mg、维生素b12 4～6g、生物素22～28μg、烟酸 45～55mg、泛酸 8～12mg、叶酸1.8～2.2mg、胆碱1000～1400 mg、ca 150～160 g、fe 18～22mg、cu 8～12mg、mn 80～120 mg、zn 80～120 mg、se 0.2～0.3mg、i0.4～0.6mg、co 0.1～0.3 mg。
13.与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：1. 卤素甲基蛋氨酸（如氯甲基蛋氨酸是体内蛋氨酸代谢的中间产物）稳定性较差，难以到达畜禽肠道中起作用，本发明实施例中利用桃胶（不易被动物体内的消化酶分解）包埋氯甲基蛋氨酸，增加氯甲基蛋氨酸的稳定性，有利于维持氯甲基蛋氨酸的功效，发挥了桃胶的益生元作用，且桃胶能够被动物肠道微生物分解成短链脂肪酸，同时还会促进ca、p的吸收，促进b族维生素在大肠内的生成与吸收。
14.2.桃胶和卤素甲基蛋氨酸配合作用，能够促进畜禽的肠道发育，增加肠道杯状细胞的数量和muc2的表达，能够增加益生菌的丰度，能够降低热应激引起的血糖升高；该添加剂的使用，有利于维护肉仔鸡肠道健康，有利于提高其出栏重和降低其料重比。
附图说明
15.图1为本发明实施例中肉仔鸡添加剂对 46 日龄肉仔鸡肠道组织形态的对比显微照片。
16.图2为本发明实施例中肉仔鸡添加剂对 46 日龄肉仔鸡盲肠菌群α多样性的影响。
17.图3为本发明实施例中肉仔鸡添加剂对肉仔鸡盲肠菌群相对丰度的影响（门水平）。
18.图4为本发明实施例中肉仔鸡添加剂对肉仔鸡盲肠菌群相对丰度的影响（属水平）。
19.图5 为本发明实施例中肉仔鸡添加剂对肉仔鸡盲肠菌群差异物种与标志物种的影响，其中，上图为分支图：分类学分枝图展示了样本群落中从门到属(从内圈到外圈)主要分类单元的分类等级关系；节点大小对应于该分类单元的平均相对丰度，系统发育树中的蓝色和红色节点分别代表对照组和试验组中起重要作用的差异物种；d，对照组；ss，试验ⅲ组；下图为柱状图：纵坐标为组间具有显著差异的分类单元，横坐标则以条形图直观地展示各分类单元的lda分析对数得分值。
20.图6为本发明实施例中肉仔鸡添加剂对肉仔鸡beta多样性的影响（upgma聚类树）。
21.图7 为本发明实施例中肉仔鸡添加剂对ipecj2细胞muc 2蛋白表达量的影响。
具体实施方式
22.下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
23.在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的饲料原料如无特别说明，均为市售常规原料；所涉及的检测、测试、制备方法，如无特别说明，均为常规方法。
24.实施例：肉仔鸡饲料添加剂性能验证试验
1 材料与方法1.1基础饲粮配方（以重量份计）1～24天：玉米 550.00份、豆粕 220.00份、花生粕30.00份、棉粕100.00份、豆油20.00份、次粉84.90份、石粉14.00份、磷酸氢钙 8.00份、食盐 3.10份、预混料10.00份。
25.24～48天：玉米 530.00份、豆粕 210.00份、花生粕30.00份、棉粕100.00份、豆油20.00份、次粉76.90份、石粉12.00份、磷酸氢钙 8.00份、食盐 3.10份、预混料10.00份。
26.预混料为每千克饲粮提供：维生素a 10 000 iu、维生素d 2 500 iu、维生素e 50 mg、维生素k3 2 mg、维生素b1 2 mg、维生素b2 10 mg、维生素b6 1 mg、维生素b1 2 5 g、生物素 25 μg、烟酸 50 mg、泛酸 10 mg、叶酸 2 mg、胆碱 1200 mg、ca 156 g、fe 20 mg、cu 10 mg、mn 100 mg、zn 100 mg、se 0.25 mg、i 0.5 mg、co 0.2 mg。
27.1.2添加剂的配方及制备工艺1.2.1 原料的制备称取桃胶粉1000 g、氯甲基蛋氨酸3g，充分搅拌后，加蒸馏水800～1000 ml，均匀摊开，放入烘箱中50℃烘干，碎粉后过40目筛，即得肉仔鸡饲料添加剂。
28.1.3 试验设计及饲养管理1.3.1试验设计选用1日龄的肉仔鸡375只（母），采用单因素完全随机试验设计的方法，分5个处理组，每个处理组5个重复，每个重复15只；对照组饲喂基础饲粮，试验ⅰ、ⅱ、ⅲ和ⅳ组在基础饲粮中分别添加1、2、3、4 g/kg所述肉仔鸡饲料添加剂。根据肉仔鸡生产性能，检测对照组与生产性能最优组的肠道发育、盲肠菌群结构和血清生化指标；试验期为46天。
29.1.3.2饲养管理采用半开放式鸡舍，3层立体笼养，第1周每天光照 24 h，随后光照每周递减 1～2 h；育雏第 1 周的舍温保持在33～35℃，1 周后保持舍温与环境温度一致，但当舍温高于33℃时，用自然通风和风机调节舍温；自由采食和饮水；常规免疫。
30.1.4 样品采集及检测方法1.4.1 生产性能于试验第46天，每个处理组随机选取接近平均体重的肉仔鸡5只，空腹12 h，称重，计算平均日采食量、平均日增重和料重比。
31.1.4.2 盲肠内容物称重后，选取对照组和生产性能最好组中接近平均体重量的肉仔鸡5只，屠宰后分别提取其盲肠内容物，装入灭菌冻存管中，液氮速冻后，转移到-80 ℃冰箱保存。委托上海派森诺生物科技有限公司用三代测序方法检测盲肠内容物菌群组成。
32.1.4.3 肠道黏膜发育屠宰后，截取十二指肠、空肠、回肠每个肠段中部约3 cm左右，然后浸入盛有4%多聚甲醛的离心管中固定。将多聚甲醛中固定的肠组织去除，经修剪
→
脱水
→
入蜡
→
包埋
→
切片
→
染色
→
密片程序处理之后，苏木精-伊红染色后于光学显微镜下进行观察，使用eclipse ci-l拍照显微镜选取组织的目的区域进行40和200倍成像，成像时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。成像完成后使用image-pro plus 6.0分析软件分析。选取40倍视野，分别测量每张切片中5根完整肠绒毛高度；以及对应的5处隐窝深度；
选取200倍视野，测量5处绒毛上皮长度，计数该长度内的杯状细胞数量，并计算出单位长度内的杯状细胞数量=杯状细胞数量/绒毛长度。
33.1.4.4 血清生化指标于试验的第46天，空腹12 h后，取颈静脉血 10 ml，离心分离血清。用全自动生化分析仪（深圳迈瑞公司生产）测定肉鸡血清葡萄糖、钙（ca）、磷（p）、总蛋白（tp）、白蛋白（alb）、尿素（urea）、三酰甘油（tg）、总胆固醇（tc）、丙氨酸转酶（alt）和天冬转酶（ast）含量。
34.1.5 体外验证因现有条件受限，无法用肉子鸡肠道细胞试验，故取仔猪空肠上皮细胞进行验证，检测氯甲基蛋氨酸对细胞生长因子和muc2蛋白表达的影响。
35.2 结果与讨论2.1添加剂对肉仔鸡生产性能的影响。
36.表1 添加剂对46天肉仔鸡生长性能的影响同行数据肩标相同或无字母表示差异不显著( p＞0.05) ，不同小写字母表示差异显著( p＜0.05) ；下表同。
37.由表1可知，与对照组相比，试验ⅲ组肉仔鸡的出栏重较对照组显著增加（p＜0.05），试验ⅰ、ⅱ和ⅳ组与对照组相比差异不显著（p＞0.05）。因本试验是在7月中旬～8月底进行，因鸡舍内温度偏高，造成了肉仔鸡的采食量偏低，影响了肉仔鸡出栏重，但试验结果也能证明本添加剂可以显著提高肉仔鸡出栏重。
38.2.2 添加剂对 46 日龄肉鸡肠道组织形态的影响。
39.表 2 添加剂对 46 日龄肉仔鸡肠道组织形态的影响
40.由表 4和图1 可知，与对照组相比，试验ⅲ组肉仔鸡的十二指肠和空肠的绒毛高度显著增加（p＜0.05），十二指肠、空肠和回肠的隐窝深度无显著变化（p＞0.05）。与对照组相比，试验ⅲ组肉仔鸡的十二指肠杯状细胞数量显著增加（p＜0.05）。试验结果表明，饲粮中添加所述肉仔鸡添加剂，增加了肉仔鸡十二指肠杯状细胞数量，增加了十二指肠和空肠面积；因此，有利于提高肉仔鸡对营养物质的吸收率和肠道屏障功能，对提高肉仔鸡的生产性能有利。
41.2.3 添加剂肉仔鸡46 日龄盲肠内容物菌群alpha多样性指数由图2 可知本添加剂可以提高46 日龄肉仔鸡盲肠菌群的α多样性，但无显著影响（p＞0.05）。
42.2.3添加剂对肉仔鸡46 日龄盲肠内容物菌群组成的影响由图 3、图4可知，门水平上，对照组和试验ⅲ组中的优势菌群是拟杆菌门（bacteroidetes）、厚壁菌门（firmicutes）和变形菌门（proteobacteria）。与对照组相比，试验ⅲ组肉仔鸡拟杆菌门的丰度升高。属水平上，对照组和试验ⅲ组中的优势菌群主要由拟杆菌属（bacteroides）、parabacteroides 、螺杆菌属（helicobacter）、alistipes、synergistes、anaerotignum 、mucispirillum 、粪杆菌属(faecalibacterium )和梭杆菌属(fusobacterium)等菌属组成。与对照组相比，试验ⅲ组parabacteroides和anaerotignum降低，拟杆菌属(bacteroides)和faecalibacterium升高。
43.借助lefse (lda effect size)分析方法，对对照组和试验ⅲ组肉仔鸡差异物种与标志物种进行了分析（p《 0.05，lda》 3.5）。分析结果如图5所示，肉仔鸡饲粮中添加所述肉仔鸡添加剂3 g/kg，盲肠内容物微生物群富集了拟杆菌门、拟杆菌属、巴恩斯氏菌（barnesiella）和lachnoclostridium。不添加肉仔鸡添加剂的对照组盲肠内容物微生物群则富集了放线菌门（actinobacteria）、parabacteroides和乳杆菌属（lactobacillus）。
44.进一步研究发现，试验ⅲ组中的标志物种拟杆菌属编码碳水化合物活性酶（cazymes）的能力高于其它细菌，利用多糖的能力也高与其它细菌。标志物种barnesiella在抑制肝脏糖异生、调节免疫和减少炎症等方面具有重要作用。标志物种lachnoclostridium是lachnospiraceae和梭菌簇xiva的成员，具有抗炎和调节菌群平衡中发挥作用，其组分和代谢物，特别是丁酸盐，在维持肠道健康中具有重要作用。对照组中的
标志物种parabacteroides，是肠道中的机会病原菌，具有对抗菌药物产生耐药性的能力，也与宿主体重减少相关。对照组中的标志物种乳酸杆菌属具有改善肠道完整性、抵消内毒素血症和炎症等功能，但对碳水化合物和蛋白的利用能力不及拟杆菌属。总之，造成对照组和试验组肉仔鸡46日龄体重显著差异的原因，与其肠道中差异物种与标志物种不同有关。
45.2.3.2 添加剂对肉仔鸡46 日龄盲肠内容物菌群beta多样性的影响由图6可知，对照组和试验组分别聚类为不同的分支，表明二组之间的菌群组成存在差异。
46.2.4 添加剂对肉仔鸡血清生化指标的影响表3 饲粮中添加氯甲基蛋氨酸对肉仔鸡血清生化指标的影响项目对照组试验ⅲ组葡萄糖（glu）mmol/l12.27
±
0.66a10.58
±
0.35b钙mmol/l2.62
±
0.02a2.44
±
0.04b磷mmol/l2.08
±
0.142.18
±
0.11总蛋白tpg/l1.100
±
0.080.98
±
0.17白蛋白albg/l9.35
±
0.7610.08
±
0.15尿素ureammol/l2.38
±
0.042.39
±
0.33甘油三酯tgmmol/l0.42
±
0.05b0.53
±
0.09a谷丙转氨酶altu/l4.73
±
0.48a3.93
±
0.48b谷草转氨酶astu/l353.35
±
35.41372.66
±
53.47总胆固醇tcmmol/l3.49
±
0.163.67
±
0.30
47.由表3可知，对照组和试验ⅲ组血清tc、总蛋白含量、尿素、谷草转氨酶、总蛋白和白蛋白无显著差异（p＞0.05），与对照组相比，试验ⅲ组血清中葡萄糖显著降低（p＜0.05），表明饲粮中添加本添加剂降低了因热应激引起的血糖浓度水平
15.。与对照组相比，试验ⅲ组血清中谷丙转氨酶显著降低（p＜0.05），表明饲粮中添加氯甲基蛋氨酸对保护肉仔鸡肝脏有利。
48.2.5 肉仔鸡添加剂对ipecj2细胞muc2和生长因子蛋白表达的影响由图7可知，与对照组相比，添加0. 5或1 mm所述肉仔鸡添加剂提高了muc 2和部分生长因子的蛋白表达量，验证了该肉仔鸡添加剂具有维护肠道健康和促进肠道发育的功能。
49.由上实例可知，饲粮中添加3 g/kg 所述肉仔鸡添加剂能增加肉仔鸡出栏重，能提高肉鸡十二指肠、空肠的绒毛高度和十二指肠杯状细胞数量，能富集肠道内容物中益生菌的种类和分度，能降低热应激引起的血糖升高。
50.上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明构思的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，或者是对相关原材料及方法、步骤进行等同替代（如桃胶的替代），从而形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。