一种毛竹蜡质合成转录因子基因PeWST及其应用的制作方法

一种毛竹蜡质合成转录因子基因pewst及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种毛竹蜡质合成转录因子基因pewst及其应用。


背景技术：

2.植物表皮蜡质是植物与外界环境直接相接触的一层疏水保护层，能够调节植物体内的水分应对干旱、盐、温度、强光等非生物胁迫，对植物的生长和发育起着重要的作用，因此了解植物表皮蜡质合成的途径对于深入理解蜡质的形成及其生物学功能具有重要意义。在不同的物种之间，植物表皮蜡质的结构和组成均有着很大差异，但都具有类似的蜡质合成途径。
3.蜡质合成途径实际上是一个复杂的代谢过程，有许多调控因子参与并发挥作用，wax inducer(win)/shine是在拟南芥中第一个被确定下来用于负责蜡质产生和沉积的转录因子，wax inducer(win)/shine转录因子是ap2家族的一类重要成员，通过调节蜡质合成相关基因的表达，参与调节蜡质合成，深入开展包括wax inducer(win)/shine在内的遗传因子及环境因子对蜡质合成、调控与运转的机制研究将具有重要意义。
4.wax inducer(win)/shine的基因结构相对比较简单，都含有1个内含子与2个外显子，如拟南芥中有3个重要的wax inducer(win)/shine同源基因，分别为shn1、shn2和shn3，水稻中与拟南芥wax inducer(win)/shine同源的基因oswr1-oswr4，oswr1-oswr4均含有1个内含子。对于wax inducer(win)/shine的研究主要集中在拟南芥、水稻和大麦等，目前wax inducer(win)/shine参与毛竹蜡质合成的调控作用尚未见报道。
5.竹子具有生长快、成材早、产量高等特点，是我国重要的森林资源之一。毛竹(phyllostachys edulis)是我国最具生态和经济价值的竹种，然而随着全球淡水资源的缺乏，如何提高毛竹的抗旱能力也是目前研究的重要课题之一，对毛竹中调节蜡质形成的转录因子pewst(wax synthesis transcription factor)的功能进行研究，对于解析毛竹pewst对蜡质合成、调控与运转机制，以及毛竹开发利用的生产实践具有重要意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种毛竹蜡质合成转录因子基因pewst及其应用。
7.为了达到上述目的，本发明目的之一在于提供：一种毛竹蜡质合成转录因子基因pewst，核苷酸序列如seq id no:1所示。
8.本发明目的之二在于提供：上述毛竹蜡质合成转录因子基因pewst编码的蛋白质，氨基酸序列如seq id no:2所示。
9.本发明目的之三在于提供：根据上述毛竹蜡质合成转录因子基因pewst在增加叶片表皮蜡质总量、降低叶片失水率、提高植株抗旱能力上的应用。
10.本发明还公开了包含上述毛竹蜡质合成转录因子基因pewst的生物材料，生物材料为表达盒、表达载体、克隆载体或工程菌。
no:1所示。
29.应用blast在线软件在毛竹预测基因组中的几万个基因中进行比对，发现seq id no:1与ph02gene49110的序列完全一致。
30.进一步通过blastp软件在线比较分析，发现该基因编码的氨基酸序列(seq id no:2)与水稻(oryza sativa)的oswr1具有较高的一致性，为63％；蛋白结构域分析显示该蛋白具有典型的ap2保守结构域，以及wax inducer(win)/shine保守结构域(cmv-1和cmv-2)。
31.由此可见，克隆得到的基因编码一个蜡质合成转录因子，将该基因命名为pewst。
32.以毛竹cdna为模板，根据seq id no:1所示序列设计引物，pcr扩增pewst编码区的脱氧核糖核苷酸序列。在引物两端分别引入bamhⅰ和ecorⅰ酶切位点，引物序列如下：
33.正义上游引物(seq id no:3)：5
′‑
ggattcatggtacaaccaaagaag-3
′
(bamhⅰ位点小写字母)；
34.正义下游引物(seq id no:4)：5
′‑
gaattctcagatgacaaagctacct-3
′
(ecorⅰ位点小写字母)；
35.反义上游引物(seq id no:5)：5
′‑
ggattctcagatgacaaagctacct-3
′
(bamhⅰ位点小写字母)；
36.反义下游引物(seq id no:6)：5
′‑
gaattcatggtacaaccaaagaag-3
′
(ecorⅰ位点小写字母)；
37.对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带纯化回收，将回收的dna片段连接到pgem-t easy载体上，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，提取阳性克隆质粒，单克隆测序正确后，得到含有酶切位点及编码一种毛竹转录因子基因pewst的脱氧核糖核苷酸序列的质粒pt-pewst-s(正义)和pt-pewst-a(反义)。
38.将质粒pt-pewst-s(正义)、pt-pewst-a(反义)和表达载体pri101-an质粒在37℃条件下分别用ecorⅰ和bamhⅰ双酶切6h，酶切产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带，用t4 dna连接酶4℃连接过夜。连接产物转化dh5α感受态细胞，挑取卡那霉素抗性(50mg
·
l-1
)平板上长出的单克隆，提取质粒，酶切图谱鉴定(图1)和测序验证。
39.将获得的重组表达载体命名为pri101-s-pewst(图2a)和pri101-a-pewst(图2b)。
40.将表达载体pri101-s-pewst和pri101-a-pewst通过电击的方法转入农杆菌(agrobacterium tumefaciens)菌株eha105感受态细胞中，挑取卡那霉素抗性(50mg
·
l-1
)平板上长出的单菌落进行pcr鉴定。以pewst基因重组表达载体转化后形成的单克隆菌落为模板，用引物seq id no:3-6进行pcr检测，同时以重组质粒和水为对照。
41.如图3所示，表达载体pri101-s-pewst和pri101-a-pewst质粒转化农杆菌单克隆菌落pcr电泳图结果表明，单克隆菌落含有目的基因片段，摇菌获得农杆菌单克隆菌液，可用于侵染转化实验。
42.利用获得的农杆菌单克隆菌液，采用蘸花法转化野生型拟南芥。通过连续抗性(卡那霉素50mg
·
l-1
)筛选，最终获得不分离的t3代转基因拟南芥株系正义5个和反义4个，进行基因表达检测。
43.分别提取转基因拟南芥植株和野生型拟南芥植株的dna，采用pcr方法，用引物seq id no:3-6进行pcr检测。如图4所示，结果表明，在转基因拟南芥植株正义5个和反义3个中
检测到了目的基因，有1个反义为假阳性，而在野生型拟南芥植株中未检测到，证明pewst已转入拟南芥植株中。
44.利用气相质谱对叶片表皮层蜡质含量和组成进行定量分析。
45.结果表明如图5所示，与野生型拟南芥(wt)相比，转正义pewst的拟南芥植株(s-pewst)叶片的蜡质总量增加了1.6倍，而转反义pewst的拟南芥植株(a-pewst)减少1.8倍。而通过对比发现转基因植株当中蜡质的增加主要是由烷烃的增加所造成的，烷烃占蜡质含量的66％。
46.另外，伯醇及醛类也有所增加，但脂肪酸的增加不明显。进一步分析叶片中蜡质成分发现，烷烃中c29、c31及c33烷烃的增加较大，是叶片蜡质增长的主要成分，说明pewst转基因植物叶片的蜡质明显增加。
47.除此之外，伯醇中的1-二十六烷醇(c26)、1-二十八烷醇(c28)增加较为明显。而醛类当中的c30与c32也有所增加。但是，脂肪酸中长链脂肪酸c16、c26、c28、c30等增长较少。
48.为了进一步探索转基因植物中蜡质含量的增加是否与蜡生物合成途径中所涉及到的基因相关，通过定量pcr技术对pewst转基因植物叶片中14种与蜡质合成相关基因的表达进行了检测。研究结果显示如图6所示，在正义植株当中，与脂肪酸延长过程有关的kcs1、kcs2、fdh、kcr1、pas2、cer10等6个基因表达上调，其中kcs1与cer10上调了3倍左右，fdh上调了5.2倍，kcr1上调了9.5倍，pas2上调了约11倍。
49.另外，cer1、cer5、ltpg这三个参与超长链烷烃，醇和醛生物合成与运输基因的表达量也有所增加。cer5的上调较为明显，上调了3.1倍。除此之外，剩余的5个基因与角质素的生物合成有关(gpat4、gpat6、cyp86a4、cyp86a7、lacs2)。而编码甘油3-磷酸酰基转移酶的gpat4与gpat6并没有明显的表达量上调，分别上调了1.45倍与2.0倍。cyp86a4与cyp86a7有显著的表达量上调，分别上调了12.16倍与5.12倍，而这2个基因又具有编码脂肪酸的功能，因此这2个基因对于研究pewst的功能具有重要意义。
50.定量pcr所用引物
51.52.验证实验：检测pewst转基因拟南芥叶片表皮通透性的改变
53.植物的表皮对限制水分散失方面具有重要的生理功能，而植物表皮蜡质作为与环境直接接触的一层疏水保护层，对于抵抗干旱等具有重要意义，而植物失水率是干旱胁迫的重要指标，失水率越高，抗旱能力越弱，反之抗旱能力越强。因此，对pewst正义、反义转基因植株和wt植株叶片失水率进行了研究。
54.结果显示如图7所示，从整体来看转基因植株和wt植株叶片的失水率随着时间的增加而上升，但是反义植株的失水率相比较wt来言相差较大，在相同的时间内失水率较高。在失水300min时，反义植株的失水率达到了96.6％，而wt与正义植株的失水率分别为72.9％和60.1％。由此可见，正义植株的失水率远远低于野生型与反义植株，在处理420min后，失水率仅为70.8％。因此，pewst正义植株的抗旱能力明显高于野生型及反义植株。
55.验证实验：干旱胁迫下检测pewst转基因拟南芥中丙二醛和脯氨酸含量
56.氧自由基对脂质氧化产生丙二醛(mda)，它的积累能够使细胞的生命活动受到阻碍。由于在逆境条件之下，植物体内氧自由基对脂质氧化的增加，mda的含量也随之增加。因此，mda可以作为衡量植物抗逆的标准之一，mda的含量越低证明植物对逆境胁迫的抵御能力越强。
57.随着干旱处理天数的延长，mda的含量逐渐增加，呈现逐渐上升的趋势，而在处理到8d的时候，野生型比没有处理之前增加了2.9倍，而正义植株与反义植株分别增加了2.5倍和3.0倍(图8a)。在处理之后，正义植株明显要比野生型与反义植株的mda含量减少，表明其细胞膜的损伤程度较小，pewst的表达在抵御干旱方面起到了正向调节的功能。
58.在遭遇逆境胁迫下，脯氨酸含量能够在植物体内进行积累从而可以达到调节植物细胞质的渗透性及氧化还原反应，稳定细胞内的生理代谢反应。因此，脯氨酸可以用于显示抵御干旱能力的强弱。干旱处理前转基因植株与野生型植株的差别不大，s-pewst为51.20μg
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g-1
，wt为55.15μg
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g-1
，a-pewst为50.54μg
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g-1
，处理8d之后，野生型增加了24.3倍，而正义植株增加了46.7倍，反义植株增加了13.6倍(图8b)。由此表明，正义植株s-pewst中脯氨酸含量显著增加，抗旱性更强。
59.以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。