一种抗生素使用方式评估的方法

1.本发明涉及肠道共生菌研究技术领域和药物领域，具体涉及一种抗生素的使用方法评估方法。


背景技术：

2.万古霉素是一种针对革兰氏阳性菌的糖肽类抗生素，常用于治疗难辨梭菌感染(cdi)。但短期口服万古霉素是cdi反复感染的一个关键危险因素，因为口服万古霉素引起肠道菌群的紊乱，会促使其他病原体包括肺炎克雷伯菌、大肠杆菌及其他耐万古霉素肠球菌(vre)在肠道中的定植。随着万古霉素在全世界越来越广泛使用，人们越来越认识到万古霉素不当使用引起的负面作用：抗生素抗性的迅速发展，并开始了对万古霉素使用方式的探索。
3.以往对抗生素抗性的许多研究多集中在对临床致病菌的分析。但是，越来越多的研究转向“耐药基因组”。抗生素不同给药方式对体内肠道微生物群抗生素耐药性的影响迄今被低估。万古霉素给药方式对肠道微生物耐药基因影响的进一步了解对于正确评估治疗方案至关重要。
4.目前没有关于短期万古霉素不同给药方式对大鼠16s肠道菌群、宏基因组耐药基因的影响研究。
5.精神疾病影响25％的人群，是全球致残的主要原因。精神疾病包括自闭症、抑郁症、焦虑症、精神分裂症、双相情感障碍、神经性厌食症、注意缺陷/多动症、强迫症等。精神类疾病严重影响了患者的生活质量，例如，抑郁症主要特征包括敏感、情绪低落、失眠、思维迟缓、言语较少且对有趣活动失去兴趣等，自闭症特征是除了焦虑和认知障碍外，还存在严重的社交障碍、刻板印象或重复行为障碍。精神类疾病对患者家庭及社会的和谐稳定也产生了极大威胁。该类疾病发病机制较为复杂，受遗传(如基因)及非遗传(如饮食、环境、生产等)多种因素的影响，故缺乏有效的治疗手段，因此成了备受人们关注的慢性疾病。抑郁症占据精神类疾病的首位，研究抑郁症的发病机制具有重要意义。
6.用于研究抑郁症的动物模型包括习得性无助、慢性不可预知温和应激、社会挫败等，而一个相对成熟稳定、简单方便的抑郁症动物模型对于研究其致病机制具有重要的作用。慢性束缚应激(crs)抑郁症动物模型是一种较为便捷、表型稳定的模型建立方法。
7.肠脑轴是肠道菌群与大脑之间复杂的多器官双向信号系统，在宿主的生理、稳态、发育和代谢等方面发挥着重要作用。越来越多研究表明复杂的肠道微生物群落及其代谢与精神疾病的病理密切相关。因此，寻找精神类疾病的原因和治疗方法时，不能只局限于大脑，肠道微生物组失调不应该被忽视，它也是一个重要的因素。目前精神疾病中研究肠道菌群作用的模式生物包括无菌和伪无菌动物。无菌大鼠是在无菌实验室将怀孕大鼠剖腹产手术生产无菌的仔鼠，将无菌仔鼠在无菌环境中养大成为无菌大鼠，是最佳的研究对象，但产量非常小，且昂贵，不利于开展大样本量的实验研究。伪无菌大鼠一般是spf级大鼠通过混合抗生素灌胃，将肠道菌群清除建立的。这种方法比无菌动物要容易操作，产生的动物数量
要更多，成本更低，但不能研究特定微生物在抑郁机制中的作用。
8.目前没有关于万古霉素不同给药方式干扰结合crs抑郁模型建立对大鼠16s肠道菌群、宏基因组和血清代谢组的影响研究。
9.为探究抑郁症机制，并了解其中肠道菌群-肠-脑轴在其发展过程中起的作用，本发明用慢性束缚应激的方法建立焦虑、抑郁的大鼠模型，利用行为学(糖水偏好、明暗穿梭以及强迫游泳)检测建模效果，探究抑郁模型对肠道菌群以及靶向短链脂肪酸和广泛靶向代谢组的影响；通过万古霉素的给药方式，进一步探究肠道菌群及其代谢物与抑郁症的产生是否存在因果关系。最后我们也关注万古霉素给药方式对肠道菌群和抗性基因的影响。


技术实现要素：

10.本发明的目的在于通过利用以基因组为核心的宏基因组学分析方法，发现万古霉素灌胃比注射增加了肠道内菌群抗生素基因的数量和丰度。本发明用慢性束缚应激的方法建立焦虑、抑郁的大鼠模型，利用行为学(糖水偏好、明暗穿梭以及强迫游泳实验)检测建模效果，探究抑郁模型对肠道菌群以及靶向短链脂肪酸和广泛靶向代谢组的影响。
11.本发明的目的可以通过以下实验方案来实现，万古霉素不同给药方式造成健康大鼠肠道菌群紊乱的实验包括以下步骤：
12.步骤一，健康大鼠置于实验室环境(光/暗循环12h，温度25℃，相对湿度55-65％)中自由取食和饮水，适应一周后取粪便。
13.步骤二，适应期后的大鼠随机分成三组，一组作为健康对照组，一组作为万古霉素注射组，一组作为万古霉素灌胃组。
14.进一步，步骤一中，在一周适应期后将雄性sd大鼠置于可代谢笼中，5min后用无菌锥形管收集粪便样本。在代谢高峰期(上午9:00-10:00)采集每只大鼠2-3颗粪便标本，液氮处理后立即置于-80℃保存，提取dna进行16s rrna v3-v4扩增子测序。
15.进一步，步骤二中所述生理盐水和万古霉素不同给药方式处理的操作方法如下：
16.(1)大鼠一半每天灌胃0.3ml的生理盐水，一半每天注射0.3ml的生理盐水，其余时间自由获取水和食物，然后合并为健康对照组(hc)。
17.(2)大鼠每天灌胃0.3ml的万古霉素，其余时间自由获取水和食物，所用的万古霉素浓度为50mg/kg大鼠体重，为万古霉素灌喂组(va-po)。
18.(3)大鼠每天注射0.3ml的万古霉素，其余时间自由获取水和食物，所用的万古霉素浓度为50mg/kg大鼠体重，为万古霉素注射组(va-im)。
19.步骤三，万古霉素干预10天后，取三组的大鼠粪便和全血。
20.进一步，步骤三中，采集粪便后，提取dna后立即置于-80℃保存，进行16s rrna v3-v4扩增子测序和宏基因组测序。
21.采用大鼠眼眶静脉取血方法采集全血，将采好的血样于室温静置30min-60min使其凝结后，再将采血管放入离心机内，4℃条件下3000rpm，离心10min，取出采血管吸取上清液(即血清)装于合适的已编号的ep管中，如此重复分装成多管血清以避免反复冻融，尽快将血清保存于-80℃冰箱中，用于血清靶向和广泛靶向代谢组学检测。
22.本发明的另一目的在于研究肠道菌群及其代谢物在抑郁机制中的作用。
23.本发明的另一目的可以通过以下实验方案来实现，万古霉素不同给药方式结合建
立抑郁模型研究肠道菌群及其代谢物对抑郁的影响的实验包括以下步骤：
24.步骤四，将步骤三后的健康对照组大鼠随机分成两组，一组为健康对照组，一组为抑郁模型组。
25.步骤五，在crs模型建立前，四组大鼠进行糖水偏好实验。
26.进一步，步骤四中，健康对照组大鼠在整个过程中无压力干预，自由获取水和食物。抑郁模型组大鼠每天被限制在亚克力瓶中(内径6.0cm，长18cm，瓶鼻端有气孔)6小时，其余时间自由获取水和食物。crs模型建立周期为三周。
27.进一步，步骤五中，每只鼠笼上并排放置2个饮水瓶，两瓶均装有200ml质量浓度为1％蔗糖水，适应性训练24小时。24小时后，将其中一瓶蔗糖水替换成无菌水，继续适应24小时；适应期结束后，全部大鼠禁食禁水24h小时；之后分别给各大鼠提供体积为100ml的1％蔗糖溶液和无菌水各一瓶，4小时后测量剩余蔗糖溶液和无菌水的体积。蔗糖偏好比的确定公式如下:蔗糖偏好比(％)＝蔗糖摄入量(ml)100％/[蔗糖摄入量(ml) 无菌勺水摄入量(ml)]。
[0028]
步骤六，步骤三后的万古霉素灌胃组和注射组大鼠进行为期三周的crs模型建立，即每天被限制在亚克力瓶中6小时。
[0029]
步骤七，crs模型建立三周后，采集四组大鼠的粪便和全血。
[0030]
进一步，步骤七中，采集粪便后，提取dna后立即置于-80℃保存，进行16s rrna v3-v4扩增子测序和宏基因组测序。
[0031]
采用大鼠眼眶静脉取血方法采集全血，将采好的血样于室温静置30min-60min使其凝结后，再将采血管放入离心机内，4℃条件下3000rpm，离心10min，取出采血管吸取上清液(即血清)装于合适的已编号的ep管中，如此重复分装成多管血清以避免反复冻融，尽快将血清保存于-80℃冰箱中，用于血清代谢组学检测。
[0032]
步骤八，大鼠粪便和全血采集完成后，采用包括糖水偏好实验、明暗穿梭实验和强迫游泳实验对大鼠的抑郁样和焦虑样的行为学进行测序，判断建模的成功与否。
[0033]
进一步，步骤八中，强迫游泳和明暗穿梭实验通常用于评估抑郁和焦虑样行为。
[0034]
步骤九，实验结束时，大鼠禁食12小时，用6％(v/v)水合氯醛麻醉，并实施安乐死。
[0035]
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
[0036]
本发明提供大鼠肠道菌群失调模型的建立方法，用万古霉素不同给药方式(灌胃和注射)处理10天，通过16srrna基因测序方法分析不同给药处理的大鼠和正常对照大鼠肠道菌群的组成差异。同时，可以用宏基因组对粪便抗生素抗性基因数量和丰度进行探究，以便于评估现有抗生素口服和注射形式的效应。采用慢性束缚应激抑郁建模三周的方法,正常大鼠、万古霉素灌胃大鼠和万古霉素注射大鼠建模完成后进行糖水偏好、明暗穿梭和强迫游泳行为学，检测此建模方法的效果以及肠道菌群改变对抑郁样行为的影响。此外,使用高通量测序方法分析大鼠肠道菌群的组成和功能差异，以及血清靶向以及广泛靶向代谢组学检测分析大鼠肠道菌群相关代谢物的组成和差异情况,对肠道菌群改变引起抑郁的可能机制进行探究。
附图说明
[0037]
图1是本发明方法的流程图；
[0038]
图2是万古霉素不同给药方式处理后arg总丰度；
[0039]
图3是万古霉素不同给药方式处理后耐药类型丰度柱形图；
[0040]
图4是万古霉素不同给药方式处理后丰度前40的arg类型。
具体实施方式
[0041]
实施例1
[0042]
1、实验大鼠的适应期
[0043]
选用六周龄健康雄性(sprague dawley，sd)大鼠。研究之前，大鼠未使用过任何抗生素。置于实验室环境(光/暗循环12h，温度25℃，相对湿度55-65％)中自由取食和饮水，适应一周后采集粪便。新鲜粪便立即冷冻于液氮中，并储存于-80℃进行进一步分析。
[0044]
2、万古霉素处理
[0045]
适应后，将总共40条健康大鼠随机分为3组(2个处理组和1个对照组)，其中对照组有20只，处理组每组10只大鼠，每个笼子2只大鼠。为了研究特定微生物失调在抑郁机制中的作用，sigma-aldrich(货号v2002,potency:≥900μg per mg)的万古霉素采用灌胃和肌肉注射两种给药方式分别处理2个处理组，每次0.3ml，健康对照组大鼠不接触万古霉素，连续处理10天，采集粪便，眼眶取血。新鲜粪便立即冷冻于液氮中，并储存于-80℃进行进一步分析。万古霉素浓度为50mg/kg大鼠体重。
[0046]
万古霉素计量选择依据：万古霉素的剂量水平(50mg/kg体重)通常用于如动脉损伤、他克林诱导的肝毒性和高血压大鼠研究中，此剂量的万古霉素会对目标微生物群产生明显的作用，引起低且可逆的全身毒性。
[0047]
结果分析
[0048]
图2显示，万古霉素灌胃和注射均导致了粪便菌群中args总丰度的增加，其中灌喂组的耐药基因总丰度是健康组的2倍以上。
[0049]
图3显示，灌胃比注射万古霉素对肠道微生物群耐药性的影响更大，具体表现为灌胃组中耐药类型的增加比注射组更为明显，特别是多药耐药的急剧增加在灌胃组中最为明显,丰度分别是健康组的300倍，是注射组的4倍。
[0050]
图4显示，前40个丰度的arg亚型对很多抗生素类产生了耐药性。万古霉素治疗组(特别是灌喂组)具有15个对多药耐药指标args(acrb、acra、tolc、emrd、mdtg等)。万古霉素对大鼠体内杆菌肽、四环素(尤其是灌胃组)含量的影响主要是由于其对baca、tetw、tetq的抑制作用。
[0051]
3、慢性束缚(crs)抑郁大鼠模型的建立
[0052]
2中的正常对照组大鼠20只随机分2组(健康组和模型组)，每组10只，除健康组外，模型组、灌胃组和注射组大鼠每天被限制在一个亚克力瓶中(内径6.0cm，长18cm，瓶鼻端有气孔)6小时(09:00到15:00)，这样可以防止前后移动和限制左右移动，其余时间自由获取水和食物。crs模型建立周期为三周。
[0053]
在约束期结束后，采集粪便，眼眶取血。新鲜粪便立即冷冻于液氮中，并储存于-80℃进行进一步分析。并对大鼠进行了三种行为测试：糖水偏好实验(spt)，明暗穿梭实验(ldt)和强迫游泳实验(fst)。
[0054]
4、明暗穿梭实验
[0055]
通常用于评估研究对象是否具有抑郁症状。在本试验中，明暗穿梭实验则被用来测试模型大鼠在暗箱中所处时间。明暗穿梭盒是一个长40cm、宽30cm和高为35cm的装置，由1/2的明亮环境和1/2的黑暗环境组成，将大鼠放至明暗穿梭盒的中间，适应2min后统计4min内各大鼠在暗箱中所处的时间。为减少交叉污染，这些试验均在同一个测试室内进行。每只大鼠测试完成后，用70％的乙醇清洗实验区域，以免该sd大鼠余留的信息(如动物的大小便、气味等)影响其它大鼠的测试结果。为避免主观影响，每个试验均由两名训练有素的观察者独立完成评估。
[0056]
5、强迫游泳实验
[0057]
在高50cm、直径20cm的圆筒中装入温度为(23
–
25℃)左右的水，水深的设置为25cm。适应2min,记录4min时间的大鼠“不动时间”时间(维持自身不下沉、仅露出鼻孔保持呼吸、四肢偶尔划动以保持身体漂浮不动的时间)。“不动时间”的定义是:动物保持漂浮或静止，只做在水中保持平衡所必需的动作的时间。
[0058]
实施例2
[0059]
6、大鼠体重测量
[0060]
分别在适应期后(给药前)、万古霉素暴露后(给药10天后)，以及三周的慢性束缚(crs)抑郁大鼠模型建立期间每周测量一次每只大鼠的体重并记录。
[0061]
7、粪便样本收集
[0062]
分别在适应期后(给药前)、万古霉素暴露后(给药10天后)以及慢性束缚(crs)抑郁大鼠模型建立后(束缚三周后)收集每组大鼠的新鲜粪便，湿重约1g(2～3粒)，液氮中速冻，转移至-80℃保存，待测。
[0063]
实施例3
[0064]
8、粪便16srrna检测
[0065]
将冷冻后的粪便样本,送至美吉生物测序公司测序。粪便样品利用illumina公司的miseq pe300平台进行测序。
[0066]
实施例4
[0067]
9、粪便宏基因组检测
[0068]
将冷冻后的粪便样本,送至美吉生物测序公司测序。粪便样品使用illumina公司的hiseqxten测序平台进行宏基因组测序。
[0069]
10、全血处理
[0070]
万古霉素处理以及建模完成后眼眶取全血，将采好的血样于室温静置30min-60min使其凝结后，再将采血管放入离心机内，4℃条件下3000rpm，离心10min，取出采血管吸取上清液(即血清)装于合适的已编号的ep管中，如此重复分装成多管血清以避免反复冻融，尽快将血清保存于-80℃冰箱中。
[0071]
11、血清广泛靶向代谢组学检测
[0072]
血清样本从80摄氏度的冰箱中取出，在冰上解冻，解冻后，它们被旋转10秒并充分混合。每个样品取50μl分装于ep管中，加入预冷的冰甲醇(含1μg/ml 2-氯苯丙氨酸)150μl。4℃下离心12000g，3min，取上清液进行lc-ms/ms分析。
[0073]
12、血清靶向代谢组学检测
[0074]
靶向检测七种短链脂肪酸，包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和己酸。血
清样本从80摄氏度的冰箱中取出，将其置于冰上解冻；解冻后，取血清50μl加入ep管中，加入36％磷酸溶液100ul；加入150μl的2-甲基戊酸内标液，涡流3min，冰浴超声5min,12000r/min,4离心10min；离心后取上清90μl，吸进样品瓶，20℃冰箱保存，用于gc-ms/ms分析。
[0075]
通过万古霉素不同给药方式处理，并做16srnra和宏基因组分析即可以评估现有抗生素口服和注射形式的效应。万古霉素干预后进行模型建立，即可通过肠道菌群-肠-脑轴机制对肠道菌群改变引起抑郁的可能性进行探究。
[0076]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。