透明质酸与RSL3共同修饰的光敏纳米材料、制备方法及其应用

透明质酸与rsl3共同修饰的光敏纳米材料、制备方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医用纳米材料技术领域，具体涉及一种透明质酸与rsl3共同修饰的光敏纳米材料、制备方法及其应用。


背景技术：

2.膀胱肿瘤是最常见的泌尿系统恶性肿瘤，居全球人类常见恶性肿瘤第十一位(年龄标化发病率男性为9.0/10万，女性为2.2/10万)。幸运的是，其中大部分(约75％)患者为非肌层浸润性膀胱肿瘤(nmibc)，可以通过经尿道微创技术切除肿瘤而保留膀胱。经尿道膀胱肿瘤电切术(turbt)目前仍是治疗nmibc的一线治疗方法。但是，膀胱肿瘤自身的生物学特性决定了其turbt术后二年内50-70％的患者会出现肿瘤复发，不仅显著延长了患者的治疗时间，而且严重影响患者的预后。更重要的是，对于膀胱镜检查看不见的微小肿瘤病变，如原位癌(cis)等不能有效地切除，而这些微小病变对于肿瘤的复发产生非常重要的作用。
3.光动力疗法(photodynamic therapy,pdt)是利用光动力反应治疗疾病的一种技术。光敏剂被肿瘤细胞选择性吸收，并经过特定波长激发光照射后，光敏剂可以吸收激光的能量，从基态转化为激发态，当光敏剂从不稳定的激发态转换回基态时，会将能量传递给细胞周围的氧分子，产生大量的活性氧(ros)，导致细胞死亡，以达到治疗肿瘤的目的。与传统治疗方法相比，pdt具有一些显著的优势，尤其是其微创性和时空可控的特性，大大降低了副作用。除了直接杀伤机制外，pdt还能在靶组织中引起其他治疗效果，包括血管损伤和免疫激活。然而，由于光敏剂在常用的激光器波长内的吸光率较低，其效果并不理想。此外，肿瘤微环境(tumor microenvironment,tme)和pdt过程中的快速耗氧显著影响其抗肿瘤疗效。更重要的是，细胞凋亡是pdt诱导细胞死亡的主要途径，而一些难治性肿瘤具有细胞凋亡的抵抗性。因此，对于难治性肿瘤和转移肿瘤等，为了达到完全根除的目的，pdt可以结合一种互补的治疗模式进行联合治疗。
4.铁死亡(ferroptosis)是近年来新发现的一种不同于凋亡和坏死的程序性细胞死亡方式。它主要是通过抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶4(gpx4)的失活，造成细胞内脂质过氧化物累积，引起细胞质膜的破坏并最终导致细胞死亡。因该过程需要铁离子的参与，故命名为铁死亡。多种研究结果证实，诱导铁死亡可显著抑制肿瘤在体内外的增殖，尤其是耐药、耐凋亡肿瘤细胞对铁死亡诱导剂敏感。此外，由于脂质代谢改变和氧化应激，容易发生转移的上皮-间质转化的肿瘤细胞对铁死亡也很敏感。诱导细胞铁死亡是一种很有前景的方法，可以避开细胞凋亡途径，提高pdt的治疗效果。因此，将pdt和铁死亡联合可以通过产生多源的ros，互补协同抑制肿瘤细胞的生长，可以作为非常有效的联合治疗手段。
5.近年来，纳米材料用于肿瘤pdt越来越受到关注。利用纳米材料搭载光敏剂可以显著提高光敏剂的稳定性和靶向性，克服直接应用光敏剂靶向性不强、生物利用度不高的缺点。修饰后的纳米材料可以发挥多重生物学功能，例如：pdt、光热治疗、免疫激活、化疗、放疗以及肿瘤微环境重塑等，这种效果对于临床常见的小分子光敏剂介导的pdt是无可比拟
的。
6.目前，许多纳米结构如金纳米粒子、介孔二氧化硅纳米颗粒、碳纳米管、石墨烯、富勒烯等已经被用做光敏剂改造。通常情况下，纳米材料会携带光敏剂以及化疗药物、免疫激活剂或者蛋白抑制剂等达到pdt与其他治疗手段的联合治疗，同时通过表面修饰水溶性的多聚物来提高生物相容性和靶向性。其次，一些纳米材料会将重点放在改进pdt本身的不足上，例如：改善肿瘤的缺氧环境从而增强pdt、增强材料的光学特性以期可被近红外光(nir)激发达到深层肿瘤治疗的目的、增强活性氧的产生以及增强材料在荧光诊断方面的作用。但是，目前的材料设计还存在一些不足：
①
众多金属元素掺杂引起的生物毒性有待解决
②
由于制备工艺复杂导致材料的均一性差
③
材料在特定波长激光照射下的吸收效率低，产生活性氧的能力较低
④
为增强治疗效果，所需激光照射功率往往偏高，可能会引起治疗时的副作用，比如光热作用引起的皮肤烧伤等。
7.金属-有机骨架(metal-organic framework，mof)是一种新型的有机-无机杂化晶态多孔材料，与传统材料相比，它不仅具有较大孔隙、高孔隙度和较大表面积等有益于提高装载小分子药物的效率，而且兼具易被功能化修饰、良好生物相容性、生物降解性和水溶性等特点。更为重要的是，光敏物质可作为有机配体用于合成mof的有机框架，因此，mofs本身可作为光敏物质用于pdt。将mof作为光敏剂以及铁死亡药物的搭载平台可以实现pdt和铁死亡的联合治疗，同时采用短波长，穿透较浅的450nm激光照射mof可以相比于传统近红外激光产生更强的pdt效果，这对于治疗表浅肿瘤如非肌层浸润性膀胱肿瘤、皮肤癌、宫颈癌等具有非常好的应用前景。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种透明质酸与rsl3共同修饰的光敏纳米材料、制备方法及其应用，克服现有携带光敏剂的纳米材料具有生物毒性、制备工艺复杂、材料的均一性差以及材料对光的吸收效率低，产生活性氧的能力差等问题。
9.本发明的技术方案是提供一种透明质酸与rsl3共同修饰的光敏纳米材料，其特殊之处在于：由铁死亡药物rsl3、光敏纳米材料fetbp及透明质酸构成，其中铁死亡药物rsl3搭载在光敏纳米材料fetbp中，透明质酸包覆在搭载有铁死亡药物rsl3的光敏纳米材料fetbp外层。
10.进一步地，透明质酸与铁死亡药物rsl3均通过电子静电吸附作用结合在fetbp上。
11.本发明还提供一种上述透明质酸与rsl3共同修饰的光敏纳米材料制备方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
12.步骤1、制备光敏纳米材料fetbp；
13.步骤2、在超声处理下，将光敏纳米材料fetbp溶液和铁死亡药物rsl3溶液加入至透明质酸溶液中，然后将混合溶液在室温下在黑暗中搅拌设定时间；
14.步骤3、对步骤2的反应液进行液固分离，收集沉淀物并用水洗涤；干燥后获得最终的透明质酸与rsl3共同修饰的新型光敏纳米材料hafer。
15.进一步地，步骤1具体包括以下步骤：
16.步骤1.1、制备fe3o(oac)6(h2o)3(oac)；
17.将fe(no3)3·
9h2o和ch3co2na
·
3h2o在研钵中研磨成糊状，然后将糊状物溶解在甲
醇中并转移到圆底烧瓶回流搅拌12小时；过滤反应混合物并静置结晶，获得fe3o(oac)6(h2o)3(oac)；
18.步骤1.2、制备光敏纳米材料fetbp；
19.将fe3o(oac)6(h2o)3(oac)溶液、h4tbp溶液和甲酸混合，将反应混合物在80度烘箱中保持24小时；通过离心收集紫色沉淀，并用dmf和乙醇洗涤；最后，在室温下干燥得到fetbp。
20.进一步地，步骤2中：
21.光敏纳米材料fetbp溶液为光敏纳米材料fetbp的dmf溶液，光敏纳米材料fetbp溶液的浓度为50mg/ml；
22.铁死亡药物rsl3溶液为铁死亡药物rsl3的dmf溶液，铁死亡药物rsl3溶液的浓度为2mm；
23.透明质酸溶液为透明质酸的双蒸水溶液，透明质酸溶液的浓度为2mg/ml；
24.光敏纳米材料fetbp溶液、铁死亡药物rsl3溶液及透明质酸溶液的体积比为：10:1:500。
25.进一步地，步骤1.1中：
26.fe(no3)3·
9h2o和ch3co2na
·
3h2o的摩尔比为1:2；
27.步骤1.2中：
28.fe3o(oac)6(h2o)3(oac)溶液为fe3o(oac)6(h2o)3(oac)的dmf溶液，fe3o(oac)6(h2o)3(oac)溶液的浓度为2.2mg/ml；
29.h4tbp溶液为h4tbp的dmf溶液，h4tbp溶液的浓度为1.32mg/ml；
30.fe3o(oac)6(h2o)3(oac)溶液、h4tbp-dmf溶液和甲酸的体积比为：5：5：1。
31.本发明还提供一种上述透明质酸与rsl3共同修饰的光敏纳米材料在制备治疗肿瘤药物的应用。
32.进一步地，上述治疗为采用光动力疗法或采用光动力疗法与其他治疗手段联合进行的疾病治疗方法。
33.进一步地，上述肿瘤为非肌层浸润性膀胱肿瘤。
34.进一步地，上光动力疗法采用450nm激光照射。
35.本发明还提供一种治疗肿瘤的药物，其特殊之处在于，包括上述透明质酸与rsl3共同修饰的光敏纳米材料。
36.进一步地，上述肿瘤为非肌层浸润性膀胱肿瘤。
37.本发明的有益效果是：
38.1、本发明设计的hafer为mof类结构，首先，hafer将富集在肿瘤部位并通过增强的生物相容性和ha-cd44受体介导的特异性靶向能力选择性地内化到肿瘤细胞中。其次，当受体介导的内吞作用发生时，酸性溶酶体环境可以引起hafer降解同时释放框架结构中的亚铁离子和搭载的rsl3。两者将通过增加脂类过氧化物的积累显著放大细胞内的氧化应激。具体而言，rsl3可以直接抑制gpx4的活性，一种调节氧化还原稳态的关键酶。另一方面，亚铁离子可协同促进rsl3的抑制效果。同时，释放出的三价铁离子可以作为仿生纳米催化剂将h2o2转化为o2以缓解肿瘤缺氧。由于肿瘤微环境(tme)中的高浓度h2o2(50-100μm)环境，这种产氧作用可以长时间保持，以提高pdt的治疗效果。最后，hafer可以在450nm激光照射下
产生氧气不依赖的i型和氧气依赖的ii型pdt表现出优异的杀伤性能。精巧的tme-可调控的hafer提供了一种有前景的治疗策略，它将铁死亡和pdt相结合，协同促进ros，就像一个强大的ros引擎，用于精确靶向和高效肿瘤治疗。
39.2、fetbp可以作为外源性的铁源促进rsl3的杀伤效果，因此可以降低rsl3在体内的使用剂量，降低了rsl3的毒性；
40.3、fetbp制备工艺简单，从fetbp的电子显微镜结果，可以看出材料的均一性较好，形貌特征比较均一，呈现米粒状，表面光滑，大小基本在350nm左右；
41.4、fetbp材料对450nm激光的吸收效率高，产生活性氧的能力强；这与现在常用的近红外激光和红外激光相比，不会出现因激光照射功率偏高而导致的副作用。
附图说明
42.图1a为fetbp、hafe和hafer的透射电镜图像；比例尺＝100nm。
43.图1b为hafer的扫描透射电镜和元素映射图像；比例尺＝200nm。
44.图1c为hafer(200μg/ml)在450nm激光照射(30mw/cm2，15分钟)下的temp/1o2的电子顺磁共振光谱。
45.图1d为hafer(200μg/ml)在450nm激光照射(30mw/cm2，15分钟)下的dmpo/
·
oh的电子顺磁共振光谱。
46.图1e为不同浓度hafer在450nm激光照射(30mw/cm2，1分钟)下使用sosg检测1o2的生成(n＝3)。
47.图1f为不同浓度hafer在450nm激光照射(30mw/cm2，1分钟)下使用apf检测
·
oh的生成(n＝3)。
48.图1g为不同浓度hafer在450nm激光照射(30mw/cm2，1分钟)下使用dpbf检测总ros的生成(n＝3)。
49.图1h为使用rosgreen
tm
检测不同浓度的hafer消耗h2o2的能力(n＝3)。
50.图1i为检测不同浓度的hafer在450nm激光照射(30mw/cm2，15分钟)下gsh的消耗能力。
51.图1j为通过溶氧仪检测hafer的时间依赖性的o2产生。
52.*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001和****p《0.0001。
53.图2a为用不同浓度的fetbp在与200nm rsl3共同孵育，处理253j细胞24h后的细胞活力(n＝4)。
54.图2b为5637细胞与fetbp、hafe和hafer(25或50μg/ml)一起孵育4小时，经450nm激光照射(30mw/cm2，15分钟)后的细胞活力。(n＝3)。
55.图2c为在(b)中描述的相同处理后，通过流式细胞术对5637细胞进行annexin-v/pi双染色凋亡测定。
56.图2d为calcein-am和pi在各种处理后的死活染色成像。比例尺＝200μm。
57.图2e为用不同浓度的hafer与5637细胞孵育4小时，在450nm或630nm激光照射(30mw/cm2，10分钟)下细胞活力检测。(n＝3)。
58.图2f为在缺氧环境与常氧环境下，不同浓度的hafer与5637细胞孵育4小时，在450nm激光照射(30mw/cm2，10分钟)下细胞活力检测。(n＝3)。
59.*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001和****p《0.0001。
60.图3为hafer的体内抗肿瘤活性。(a)使用dcfh-da荧光探针检测肿瘤组织中的总ros产生。(b)实验结束时不同组解剖肿瘤的代表性照片。(c)所有组的肿瘤生长曲线。(d)在实验结束时收集的肿瘤的重量统计图。
具体实施方式
61.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，显然所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明的保护的范围。
62.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
63.本发明将铁死亡药物rsl3搭载入光敏纳米材料fetbp中，同时将透明质酸(ha)修饰于fetbp外层，形成一个新型的针对非肌层浸润性膀胱肿瘤的更具有生物相容性、靶向性和更具杀伤效果的光敏纳米材料。其中透明质酸与铁死亡药物rsl3均通过电子静电吸附作用结合在fetbp上，其中大分子透明质酸包覆在fetbp表面，同时多孔的内部结构为铁死亡药物rsl3提供了良好的搭载平台。整体的结构以fetbp为主，透明质酸和铁死亡药物rsl3占的比例很小，透明质酸的质量约占整体质量的1.57％，rsl3是小分子药物，投入的质量在微克级别。
64.实施例1：透明质酸与铁死亡药物rsl3共同修饰的光敏纳米材料hafer制备及表征；
65.本实施例通过下述过程制备透明质酸与铁死亡药物rsl3共同修饰的光敏纳米材料：
66.步骤1)、制备fe3o(oac)6(h2o)3(oac)。将fe(no3)3·
9h2o(10mmol,4.04g)和ch3co2na
·
3h2o(20mmol,2.72g)在研钵中研磨成糊状，然后将橙色糊状物溶解在甲醇(30ml)中并转移到圆底烧瓶回流搅拌12小时。过滤反应混合物并静置结晶；
67.步骤2)、制备fetbp。在4ml玻璃小瓶中加入0.5ml fe3o(oac)6(h2o)3(oac)溶液[2.2mg/ml，溶解于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)]、0.5ml h4tbp溶液[1.32mg/ml，溶解于dmf]和100μl甲酸。将反应混合物在80度烘箱中保持24小时。通过离心(15000g)15分钟收集紫色沉淀，并用dmf和乙醇洗涤。最后，通过在室温下干燥制备fetbp；
[0068]
步骤3)、制备终产物hafer。将4mg透明质酸钠溶解在2ml双蒸水中制成透明质酸溶液(2mg/ml)并转移到20ml玻璃瓶中。在超声处理下加入40μl fetbp(50mg/ml，dmf)和4μl rsl3(2mm，dmf)，持续5分钟。然后将混合溶液在室温下在黑暗中搅拌24小时。通过离心(15000g)收集沉淀物并用水洗涤。通过冻干获得最终的hafer。
[0069]
图1a-图1j为hafer的表征图，从图1a和图1b可以看出，所制备的hafer为350nm大小左右的米粒状纳米颗粒。
[0070]
图1c-g分别用不同方法验证了hafer可以产生明显的单线氧(1o2)和羟自由基(
·
oh)，这是两种不同的活性氧。
[0071]
1、使用电子顺磁共振光谱检测1o2和
·
oh的产生；
[0072]
分别选择2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮(temp)和5,5-二甲基-1-吡咯啉-n-氧化物(dmpo)作为捕获剂来识别单线态氧(1o2)和羟基自由基(
·
oh)。具体如下，将200μg hafer分散在2ml pbs中并与20μl temp混合或分散在2ml无水乙醇中并在h2o2(100μm)存在下与10μl dmpo混合，然后用450nm激光(30mw/cm2)照射15分钟。使用esr光谱仪立即检测到特征峰信号。将激光未照射组和无hafer溶液组设置为对照。从图1c和图1d中可以看出，hafer经过450nm激光照射后可以产生1o2和
·
oh。
[0073]
2、单线态氧(1o2)的检测；
[0074]
使用sosg(singlet oxygen sensor green)检测1o2，将不同浓度的hafer(2ml)与sosg(2μl,5mm)在pbs中混合，然后用450nm激光(30mw/cm2)照射液体60秒。每隔15秒取出100μl液体，记录530nm处的荧光强度，激发波长为488nm。将激光未照射组和无hafer溶液组设置为对照。从图1e中可以看出(纵坐标是处理组的荧光强度f1与对照组的荧光强度f0的比值)，hafer经过450nm激光照射后可以产生1o2，且hafer浓度越高，产生的1o2的量越多；相同浓度下，照射时间越长，产生1o2的量越多。
[0075]
3、羟基自由基(
·
oh)的检测；
[0076]
使用apf(aminophenyl fluorescein)检测羟基自由基
·
oh。将不同浓度的hafer(2ml)与apf(2μl,5mm)在pbs中混合，然后使用450nm激光(30mw/cm2)照射液体60秒。每隔15秒取出100μl液体，记录515nm处的荧光强度，激发波长为488nm。将激光未照射组和无hafer溶液组设置为对照。从图1f中可以看出，hafer经过450nm激光照射后可以产生
·
oh，且hafer浓度越高，产生
·
oh的量越多；相同浓度下，照射时间越长，产生
·
oh的量越多。
[0077]
4、检测总ros生成情况；
[0078]
利用下述方法检测总ros生成情况。dpbf(1,3-diphenylisobenzofuran)易被ros氧化，导致其在415nm处的吸收降低。实验中，将不同浓度的hafer(2ml)在pbs中与溶解在乙醇(20μl,10mm)中的dpbf混合，连续振荡。然后用450nm激光(30mw/cm2)照射液体60秒。每隔15秒取100μl，记录dpbf在415nm处的吸光度。将激光未照射组和无hafer溶液组设置为对照。从图1g可以看出(图中纵坐标为处理组的吸收强度a1与对照组的吸收强度a0的比值)，hafer经过450nm激光照射后可以产生ros。hafer浓度越高，产生总ros的量越多；相同浓度下，照射时间越长，产生总ros的量越多。
[0079]
图1h-图1j证明了hafer具有消耗体内的抗氧化剂gsh以及消耗h2o2产生氧气的功能。
[0080]
1.用rosgreen h2o2探针检测细胞外h2o2；
[0081]
将不同浓度的hafer(1ml)与rosgreenh2o2探针(2μl，5mm)在pbs中混合，然后将液体用100μm h2o2处理4小时。最后，取出100μl混合物，记录515nm处的荧光强度，激发波长为488nm。pbs组和h2o2组分别作为阴性和阳性对照。从图1h中可以看出hafer可以降解h2o2。hafer浓度越高，降解h2o2的量越多。
[0082]
2.使用gsh检测试剂盒检测细胞外gsh；
[0083]
将不同浓度的hafer(2ml)与gsh(终浓度为100μg/ml)在pbs中混合，然后用450nm激光(30mw/cm2)照射液体15分钟。之后，通过离心(15000g)收集上清液并根据检测盒说明书的步骤测量上清液中gsh的含量。从图1i中可以看出，haferpdt产生的活性氧可以消耗抗
氧化剂gsh，且hafer浓度越高，消耗gsh的量越多。
[0084]
3.检测氧气的产生。
[0085]
为了研究hafer降解细胞内h2o2和产生氧气的能力，将h2o2(100μm)与hafer(50μg/ml)在pbs中孵育，然后用溶氧仪每隔5分钟测量溶解的o2浓度，持续监测1小时。从图1j可以看出，hafer具有过氧化氢酶的活性，可以降解h2o2产生o2。
[0086]
实施例2：透明质酸与rsl3共同修饰的光敏纳米材料hafer的细胞内协同pdt和铁死亡杀伤效果；
[0087]
为证明fetbp可以作为外源性铁促进rsl3的杀伤效果，本实施例用不同浓度的fetbp与200nm rsl3共同孵育，处理253j细胞24h后，观察细胞活力(n＝4)，结果如图2a所示，从图中可以看出，单纯的fetbp和rsl3处理细胞时对细胞活性没有影响，当两者共同孵育时，fetbp显著提高了rsl3的杀伤效果，并且rsl3的杀伤具有fetbp的浓度依赖特性；证明fetbp可以作为外源性铁促进rsl3的杀伤效果，这样可以降低rsl3在体内的使用剂量，降低了rsl3的毒性。
[0088]
为证明最终材料hafer的成功制备，以及它相比于初材料fetbp以及单纯包被透明质酸，未携带rsl3的中间材料hafe具有更明显的杀伤效果，本实施例将5637细胞与fetbp、hafe和hafer(25或50μg/ml)一起孵育4小时，在有或没有450nm激光照射(30mw/cm2，15分钟)下，查看细胞活力。结果如图2b至图2d所示，从图中可以看出，fetbp和hafe显示出可忽略不计的暗细胞毒性。相比之下，含有相似浓度rsl3的hafer表现出中等的细胞致死率(25.3％和39.2％)，这是由于外源性铁的自我补充促进了rsl3的铁死亡。在450nm激光照射15分钟后，与fetbp相比，hafe显示出更高的pdt效率，这是因为通过透明质酸介导的细胞摄取增强(22.1％和33.7％对49.6％和59.0％)。hafer显示出最明显的杀伤(77.4％和86.5％)，这是由于pdt与铁死亡的协同作用所致(图2b)。此外，不同mof处理和照射后的细胞凋亡测定证实了这种杀伤趋势，表明hafer在肿瘤细胞中具有最强的诱导细胞凋亡的能力(图2c)。钙黄绿素-am(绿色，活细胞)和碘化丙啶(红色，死细胞)双染色测定也显示出相似的结果。结果证明，hafer相较于初材料fetbp以及中间材料hafe具有更优秀的杀伤能力。
[0089]
为证明450nm激光相较于常用的近红外630nm激光具有更好的pdt效果，本实验例用不同浓度的hafer与5637细胞孵育4小时，在450nm或630nm激光照射(30mw/cm2，10分钟)下检测细胞活力。(n＝3)。结果如图2e所示，450nm激光介导的pdt杀伤明显优于630nm激光。
[0090]
为证明hafer在缺氧环境中依然具有良好的pdt杀伤效果，本实验例在缺氧环境与常氧环境下，用不同浓度的hafer与5637细胞孵育4小时，在450nm激光照射(30mw/cm2，10分钟)下检测细胞活力。(n＝3)。结果如图2f所示，450nm激光介导的pdt在缺氧环境下的效果与常氧环境中差别不明显。
[0091]
实施例3：透明质酸与rsl3共同修饰的光敏纳米材料hafer的体内抗肿瘤活性；
[0092]
为了证明hafer在小动物肿瘤模型的杀伤效果，本实施例构建了mb49小鼠皮下瘤模型，待肿瘤体积增长至75
–
150mm3，将小鼠随机分成各实验组(每组8只)，分别为：(i)盐水 450nm激光照射，(ii)rsl3，(iii)hafer，(iv)fetbp 450nm激光照射，(v)hafer 450nm激光照射。在第0天，对于rsl3和hafer组，将100μl的rsl3(12μm，与hafer中含有的rsl3浓度相同)和3mg/ml的hafer盐水溶液注射到mb49荷瘤小鼠的肿瘤周围。在生理盐水 450nm激光照射、fetbp 450nm激光照射和hafer 450nm激光照射组的情况下，在瘤周注射盐水、fetbp和
hafer(300μg fetbp和hafer溶解在100μl盐水中)，4小时后，小鼠用2％(v/v)异氟烷麻醉，用450nm激光以100mw/cm2的剂量照射肿瘤10分钟。使用带有孔(d＝1.5cm)的一次性无菌手术巾遮盖小鼠，仅将肿瘤区域暴露于激光照射。随机选出一只小鼠使用探针dcfh-da检测照射后肿瘤组织内的ros产生。治疗后每隔一天测量肿瘤大小和小鼠体重，持续14天(肿瘤体积＝(长
×
宽2)/2。)
[0093]
肿瘤切片的共聚焦荧光图像(图3a)显示，相较于对照组，hafer pdt组中观察到高强度而且广泛的绿色荧光(≈25倍)，表明产生了大量的ros。如图3b-c，fetbp和hafer pdt组的肿瘤生长受到抑制，而单用hafer治疗的小鼠在早期仅部分延迟了肿瘤的生长，后期观察到其快速生长，与对照组的体积没有差异。平均肿瘤重量(图3d)也说明hafer pdt具有最大的抗肿瘤效率。从这些数据可以看出，hafer结合450nm激光照射的pdt联合铁死亡治疗模式可以在肿瘤组织内产生大量的ros抑制肿瘤生长，而未结合rsl3药物组与未接受450nm激光照射组都不能达到最明显的治疗效果。