硫酸软骨素在作为抗冠状病毒及治疗所致疾病药物中的应用

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种或几种天然硫酸软骨素在作为抗冠状病毒及所致疾病药物中的应用。
技术背景
2.冠状病毒是自然界中广泛存在的一大类病毒，这种病毒是一种线性单股正链的rna病毒。冠状病毒往往会导致脊椎动物的感染，比如人，鼠，猪，猫，鸡等。目前所发现的能够感染人类的冠状病毒有七种，其中新型冠状病毒sars-cov-2就属于这七种的一种。感染症状取决于病毒种类以及患者自身身体状态，但常见的症状包括呼吸道症状，发热、咳嗽、呼吸急促和呼吸困难。在更严重的情况下，感染会导致肺炎，严重的急性呼吸道综合症，肾衰竭甚至死亡。
3.冠状病毒中对我们造成影响最大的是新型冠状病毒sars-cov-2，世界卫生组织将严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)引起的疾病命名为新冠肺炎， 2020年1月30日世界卫生组织宣布其为国际突发公共卫生事件。截止到2021年11月，新型冠状病毒sars-cov-2已经感染了全世界累计2.5亿人口表现出极其强大的传染性，同时 sars-cov-2在感染后的高隐蔽性使被感染的患者不能及时发现自己已经被感染，目前 sars-cov-2的治疗阶段也未发现良好治疗效果的药物。因此急需具有预防新型冠状病毒 sars-cov-2感染的药物，也需要一种抑制剂来迅速治疗已被新型冠状病毒sars-cov-2感染的患者。
4.冠状病毒是一种具有包膜结构的rna病毒。冠状病毒中的主要蛋白酶(mpro，又称为 3clpro)能够处理病毒中的多聚蛋白，在病毒rna进入人类细胞后最初被翻译成这种多聚蛋白。主要蛋白酶(mpro)从多聚蛋白中切割出12个更小的蛋白，而这些蛋白质将会参与病毒的组装即病毒的复制。因此冠状病毒的主要蛋白酶(mpro)是一个重要的潜在药物靶标，对抑制病毒的复制至关重要。
5.在欧洲、美国、日本等国家，硫酸软骨素(chondroitin sulfate，cs)主要作为保健食品或药品，被广泛用于防治心脑血管疾病、骨关节炎(osteoarthritis，oa)、神经保护、增强大脑发育等。此外，临床研究尚未发现硫酸软骨素的任何显着副作用或过量服用产生的不良反应，这表明长期使用硫酸软骨素的安全性。因此，在作为日常食品来预防冠状病毒和作为临床药物的开发中具有广阔的前景。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供不同动物来源的天然硫酸软骨素在作为抗冠状病毒及所致疾病药物的应用，以特定动物为原料，经提取分离，获得系列动物软骨来源的天然硫酸多糖，筛选其在抑制冠状病毒的主要蛋白酶活性，特别是抑制新型冠状病毒sars-cov-2的主要蛋白酶的活性，提供用于预防和治疗冠状病毒的药物，尤其是预防新型冠状病毒sars-cov-2和治疗新型冠状病毒肺炎的有效药物及其组合物。
7.本发明的技术方案是：
8.一种不同动物来源的天然硫酸软骨素在作为抗冠状病毒及所致疾病药物中的应用，其特征在于，不同动物来源的天然硫酸软骨素在制备主要蛋白酶(mpro)的抑制剂中的应用。所述不同动物来源的天然硫酸软骨素具有如下任一结构特点，其分子量范围为0.5～100kda，包括：(1)猪来源硫酸软骨素；(2)牛来源硫酸软骨素；(3)鲨鱼来源硫酸软骨素，均具备如下结构特征：主要由d-葡萄糖醛酸和n-乙酰基-d-氨基半乳糖以β-1，3糖苷键连接形成二糖，而二糖单位之间以β-1，4糖苷键连接而形成硫酸软骨素二糖重复单元组成生物大分子。
9.所述冠状病毒选自sars-cov-2、sars-cov、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、 hcov-hku1和mers-cov中的一种或多种。
10.所述的天然硫酸软骨素来源于海洋动物或陆地动物。
11.所述天然硫酸软骨素通过与冠状病毒的主要蛋白酶(mpro)结合，抑制冠状病毒主要蛋白酶(mpro)的活性，从而抑制病毒的复制和增殖。
12.所述的天然硫酸软骨素在预防和/或治疗冠状病毒感染，或预防和/或治疗与冠状病毒感染相关的疾病或症状药物中的应用。
13.所述的天然硫酸软骨素在制备冠状病毒主要蛋白酶(mpro)抑制剂中的应用。
14.所述的天然硫酸软骨素在制备主要蛋白酶(mpro)抑制剂的试剂盒或试剂中的应用。
15.所述的天然硫酸软骨素和另外的一种或多种预防和/或治疗冠状病毒的活性试剂，混合而制成预防和/或治疗冠状病毒感染的药物的组合物。
16.本发明的设计思想是：
17.本发明提供的天然硫酸软骨素具有明显的抑制冠状病毒复制和增殖作用，可以通过与冠状病毒的主要蛋白酶(mpro)结合，来抑制主要蛋白酶(mpro)的活性，从而有效阻断冠状病毒的复制和增殖。在安全的使用浓度下，使用本发明所提供的天然硫酸软骨素可以有效的抑制冠状病毒感染，具有进一步研发为抗冠状病毒和预防和治疗上治疗冠状病毒相关疾病的商业价值。
18.本发明的优点及有益效果是：
19.(1)本发明提供的天然硫酸软骨素可以与冠状病毒的主要蛋白酶紧密结合，从而抑制主要蛋白酶的活性，起到阻断冠状病毒的复制，其抑制活性水平优于目前被研究发现的新型冠状病毒的主要蛋白酶抑制剂gc376和boceprevir。
20.(2)本发明提供的天然硫酸软骨素在临床研究尚未发现任何显着副作用或过量服用产生的不良反应，因此可以作为预防冠状病毒的食品日常食用，同时还具备防治心脑血管疾病、骨关节炎、神经保护、增强大脑发育等良好的作用。
21.(3)本发明提供的天然硫酸软骨素具有抗凝血特性，在作为治疗感染冠状病毒的患者的药物时，可以替代一部分肝素的作用，同时弱于肝素的抗凝血活性也防止了患者大量出血的可能，同时易吸收的特性也使天然硫酸软骨素可以更迅速地抑制冠状病毒的主要蛋白酶。可以用于抗冠状病毒相关药物的制备和应用的领域。
附图说明
22.图1：硫酸软骨素二糖重复单元的结构，根据硫酸基的位置硫酸软骨素分为不同的
类型。
23.图2：向新冠病毒sars-cov-2主要蛋白酶中分别加入不同浓度的猪来源的硫酸软骨素 (a)、牛来源的硫酸软骨素(b)和鲨鱼来源的硫酸软骨素(c)，发现随着加入硫酸软骨素浓度的提高，新冠病毒sars-cov-2的主要蛋白酶在相同时间内水解底物(mca-avlq
↓
sgfr-lys(dnp)k-nh2)所产生的荧光强度(即水解底物的量)越来越少。图中，横坐(time)代表主要蛋白酶水解底物的时间(单位：min)，纵坐标fluorescence intensity 代表荧光强度。
24.图3：在加入不同浓度的猪来源的硫酸软骨素(a)、牛来源的硫酸软骨素(b)和鲨鱼来源的硫酸软骨素(c)后，通过底物的荧光强度随时间变化的直线的斜率，可以得到主要蛋白酶在不同浓度软骨素条件下的活性。根据主要蛋白酶活性随硫酸软骨素浓度的变化曲线可以计算出不同软骨素对主要蛋白酶的半数抑制浓度ic50和抑制常数ki。d和c是boceprevir (d)和gc376(e)两种公认的主要蛋白酶抑制剂对主要蛋白酶活性影响的实验结果，作为实验的阳性对照。
25.图4：猪来源的硫酸软骨素(a和d)、牛来源的硫酸软骨素(b和e)和鲨鱼来源的硫酸软骨素(c和f)分别对新冠病毒sars-cov-2的主要蛋白酶荧光猝灭的stern-volmer图(a、 b和c)和静态淬灭图(d、e和f)。通过图中的斜率可分别求得三种软骨素与主要蛋白酶的结合强度。
具体实施方式
26.下述实施例中所使用的实验方法、试剂和设备如无特殊说明，均为本技术领域的常规方法、试剂和设备。
27.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
28.在具体实施过程中，本发明涉及的天然硫酸软骨素在制备冠状病毒抑制剂的应用，所述天然硫酸软骨素具有如下结构特征：主要由d-葡萄糖醛酸和n-乙酰基-d-氨基半乳糖以β
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1，3糖苷键连接形成二糖，而二糖单位之间以β-1，4糖苷键连接而形成硫酸软骨素二糖重复单元组成生物大分子。
29.本发明的动物来源的硫酸软骨素均具有抑制冠状病毒复制和增殖，尤其是新型冠状病毒 (sars-cov-2)的作用。实验结果显示，本发明提供的各种天然硫酸软骨素均具有显著的抗新型冠状病毒作用，抑制mpro的ic50值在119nm～148nm之间，且效果均明显好于目前被研究发现的新型冠状病毒的主要蛋白酶抑制剂gc376和boceprevir。
30.作为优选方案，以上所述的应用，所述的冠状病毒包括但不限于新型冠状病毒 sars-cov-2、sars-cov、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku 1和 mers-cov。
31.本发明提供的天然硫酸软骨素在抗冠状病毒中的应用，可将天然硫酸软骨素制备成粉剂、片剂、胶囊、注射剂、喷雾剂。
32.本发明提供的天然硫酸软骨素可根据通常给药途径并且根据本领域已知方法以常规药物组合物(该药物组合物包含有效的活性成分和合适的药用载体)和剂型配制施用于需要治疗的冠状病毒感染患者。
33.所述“治疗有效量”是指当施用时，其足以防止所针对的疾病的一种或两种以上症状的发展，或在某种程度上缓解所述一种或两种以上症状。根据本发明施用的化合物的具
体剂量将由围绕该病例的具体情况确定，所述情况包括所施用的化合物、给药途径、治疗的具体病况以及类似的考虑因素。特别地，“治疗有效量的化合物”是指足以防止或在某种程度上缓解一种或两种以上冠状病毒感染的化合物的量。
34.进一步根据待治疗的冠状病毒感染的类型和严重性以及具体患者对药物治疗的反应，单个剂量以及日剂量不同。因此，将根据在医生的指导下的标准医学原理来确定准确的单个剂量。
35.用于在治疗冠状病毒所致疾病中使用本发明的动物来源天然硫酸软骨素、药学上可接受的人体有效日剂量为，10mg至约1000mg的注射或口服剂型。
36.本发明的动物来源天然硫酸多糖可以单独使用或与其他治疗剂的联合疗法使用，以预防和/或治疗冠状病毒感染。
37.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
38.所用天然硫酸软骨素分为如下三种：
39.1)猪来源硫酸软骨素：主含硫酸软骨素a，分子量为10～20kda。
40.2)牛来源硫酸软骨素：主含硫酸软骨素a，分子量为10～20kda。
41.3)鲨鱼来源硫酸软骨素：主含硫酸软骨素c，分子量为10～35kda。
42.所用主要蛋白酶：
43.选用新型冠状病毒sars-cov-2的主要蛋白酶(mpro)。我们合成了编码该蛋白的基因 (genbank，登录号为mn908947.3)，并将其基因克隆到pgex6p-1载体bamhi和ecori位点之间，构建成主要蛋白酶(mpro)和谷胱甘肽s-转移酶(gst)融合蛋白表达质粒，其中有一个prescission蛋白酶的酶切位点，用于去除gst片段。把构建的表达质粒转到大肠杆菌菌株bl21(de3)，用含有100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基在30℃培养到600nm吸光度1.0 后，在0.5mm iptg浓度下，在18℃诱导20小时。8000
×
g离心10分钟收菌，用清洗液(50mmtris-hcl，ph 8.0，0.15m nacl)洗收集的菌，菌存放在-80℃冰箱中。
44.用破碎缓冲液(50mm tris-hcl，ph 8.0，0.5m nacl，5mmβ-巯基乙醇，1mm edta，ph 8.0，200mg/l溶菌酶，1.0mm苯甲基磺酰氟(pmsf)，3mg ml/l leupeptin，3μg/ml pepstatina)悬浮细菌，用超声波破碎后，15000
×
g离心30分钟取上清。上清液用0.22μm滤膜过滤，过滤液加载到glutathione-sepharose 4b亲和柱，亲和柱事先用平衡缓冲液(50mm tris-hcl， ph 8.0，0.15m nacl，1mm edta，ph 8.0，5mmβ-巯基乙醇)平衡。加载上清于亲和柱，使融合蛋白和亲和柱结合，用prescission蛋白酶在4℃消化16小时，洗脱目的蛋白。用amiconultra-4(30kda cutoff)浓缩主要蛋白酶(mpro)。浓缩的蛋白用hiload 16/600 superdex 75pg 分子筛进一步纯化，分子筛用10mm磷酸盐、ph 7.4，0.15m nacl、1mm edta和1mm 二硫苏糖醇(dtt)平衡。将纯化后的主要蛋白酶浓缩至10mg/ml待用。
45.实施例1天然硫酸软骨素对新冠病毒sars-cov-2的主要蛋白酶活性的抑制作用
46.使用荧光共振能量转移(fret)肽底物mca-avlq
↓
sgfr-lys(dnp)k-nh2，通过荧光共振能量转移(fret)法测定主要蛋白酶的蛋白水解活性，其中mca是荧光供体，dnp是荧光受体或称为猝灭剂。当底物未被主要蛋白酶消化时，两基团之间的距离非常近，足以产生荧光共振能量转移，因此mca的荧光非常小，几乎检测不到。当底物被蛋白酶切割后，两基团分离导致mca的荧光增加，酶切的底物越多，mca荧光越强。mca的最大激发波长为 325nm，最大
发射波长为393nm。
47.使用victor nivo荧光酶标仪(perkinelmer)355/40nm激发405/10nm发射在37℃测定了三种硫酸软骨素对主要蛋白酶的蛋白水解活性的抑制效果(抑制常数ki和ic50)。黑色96孔板每孔总体积为100μl其中含有0.75μm的主要蛋白酶mpro、10μm底物，和不同浓度的硫酸软骨素，反应缓冲液为10mm磷酸钠，ph 7.4，0.15m nacl，1mm edta和1 mm dtt，震荡混合5分钟，然后每90秒记录每孔的荧光强度。阳性对照使用已知的主要蛋白酶抑制剂gc-376和boceprevir。荧光强度随时间变化的曲线的斜率定量地反映了酶的活性，有或无抑制剂时的荧光强度随时间变化曲线的斜率的比值反应了硫酸软骨素对酶的抑制率。反应开始时的荧光强度作为背景从反应后的荧光强度中减去。
48.结果如图1所示，在无抑制剂的情况下，底物的荧光随时间逐渐增强，说明底物多肽的分解量随时间增加。但是，在硫酸软骨素存在的情况下，可以清楚地观察到底物的荧光明显减弱，提示硫酸软骨素对mpro活性有明显的抑制作用。当硫酸软骨素的浓度足够高时，底物的荧光几乎完全被抑制。
49.将图1的结果使用orign9.0处理得到不同曲线的斜率后绘制成图2的抑制曲线，将图2 的数据输入到prism8中，就可计算出半数抑制浓度ic50和抑制常数ki。结果如下表1，
50.表1
51.抑制剂ic50(μm)ki(μm)猪来源硫酸软骨素0.148
±
0.0370.090牛来源硫酸软骨素0.121
±
0.0310.107鲨鱼来源硫酸软骨素0.119
±
0.0350.106boceprevir7.1
±
0.51.89gc3760.278
±
0.0450.182
52.我们通过实验所得的ic50和ki，发现三种不同来源的硫酸软骨素对主要蛋白酶抑制效果均优于已知的主要蛋白酶抑制剂boceprevir和gc376。
53.实施例2天然硫酸化软骨素和sars-cov-2主要蛋白酶的结合
54.为了阐明硫酸软骨素抑制主要蛋白酶活性的作用机制，我们使用rf-5301pc荧光光谱仪(日本岛津制)在25和35℃下使用荧光淬灭的方法测定了硫酸软骨素和主要蛋白酶的相互作用。用0.2mm的三种硫酸软骨素分别滴定1.5μm的主要蛋白酶溶液，所用的缓冲液为10mm 磷酸钠，ph值7.4，0.15m nacl，1mm edta和1mm dtt。每次添加的硫酸软骨素溶液的体积小于总体积的5％。激发波长为290nm，狭缝宽度为15nm，荧光发射光谱扫描范围为 300-500nm，狭缝宽度为15nm。
55.硫酸软骨素和主要蛋白酶mpro作用的荧光猝灭数据符合stern-volmer方程和静态猝灭方程。stern-volmer方程为：f0/f＝1 kqτ0[q]＝1 ksv[q]，静态猝灭方程为：1/(f0-f)＝1/ f0 1/(kaf0[q])＝1/f0 kd/(f0[q])。其中f0和f分别为无硫酸软骨素和有硫酸软骨素时的荧光强度。kq为淬灭猝灭速率常数；τ0为无淬灭剂时的分子平均寿命；[q]为硫酸软骨素的浓度；ksv为动态淬火常数；ka是结合常数；kd是解离常数。
[0056]
通过测得的数据代入公式计算出最为重要的解离常数kd，kd越小说明结合的越紧密，结果如下表(表2)所示。
[0057]
表2
[0058][0059]
三种硫酸软骨素都表现出了μm级的解离常数，证明硫酸软骨素与主要蛋白酶结合非常紧密。
[0060]
为了确定硫酸软骨素与主要蛋白酶之间的相互作用特性，如氢键、范德华力、静电和疏水相互作用等，采用以下三个方程：ln ka＝-δh/rt δs/r，ln(k2/k1)＝(1/t1-1/t2) δh/r，δg＝δh-tδs＝-rt ln k。式中，δh为焓变，δg为自由能，δs为熵变。将数据代入公式后得到下表(表3)所示数据。
[0061]
表3
[0062] δh(kj mol-1
)δs(j k-1
mol-1
)δg(kcal mol-1
)猪来源硫酸软骨素-27.1-3.8-6.16牛来源硫酸软骨素-29.2-10.8-6.14鲨鱼来源硫酸软骨素-46.9-67.6-6.27
[0063]
结合能越小表示结合的越紧密，从结果我们发现三种类型的硫酸软骨素的结合能都很小，再次证明软骨素与主要蛋白酶结合的很紧密。同时通过δh、δs和δg的数值我们得到了三种来源的硫酸软骨素与主要蛋白酶之间主要存在静电和氢键相互作用。从相互作用类型来看三者都具备作为药物的潜力。
[0064]
实施例3天然来源的硫酸软骨素的细胞毒性试验
[0065]
本实施例采用中性红吞噬法测定三种天然来源的硫酸软骨素对哺乳动物细胞的细胞毒性。具体操作如下：17cl-1细胞在25cm2培养瓶中培养到细胞密度为70-80％时传代铺96孔细胞培养板，每孔加100μl细胞培养液，24h后弃原有的培养液加入含有一定浓度的硫酸软骨素或/boceprevir/gc376的培养液(培养液中硫酸软骨素或/boceprevir/gc376的浓度分别为 20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml，160μg/ml，320μg/ml，640μg/ml，1280μg/ml共7个浓度)，以未加硫酸软骨素/boceprevir/gc376的细胞作为对照，每个条件均做5个孔，作用2h后，弃培养液，加入正常细胞培养液(不含硫酸软骨素、boceprevir和gc376)100μl，置于细胞培养箱中培养，48h后，每孔加入0.1％(0.1g/100ml)中性红25μl，于37℃中作用1.5h后，将每孔中的液体吸出，用pbs漂洗2次。每孔加入l00μl的细胞裂解液(乙酸∶乙醇∶水＝l∶50∶49，体积比)，每孔加入100μl，且设空白对照，利用victor nivo荧光酶标仪(perkinelmer)，设定吸收光波长为492nm，测定od值，通过单因素方差分析，比较各浓度组与对照组od值之间的统计学差异，确定实施例l的最大无毒性浓度(即与对照组od值相比无统计学差异的最大浓度)，结果如下表，可见三种天然来源的硫酸软骨素对17cl-1细胞的最大无毒性浓度大于1280μg/ml，远远好于上市药物boceprevir和gc376的最大无毒性浓度640μg/ml。可见天然来源的硫酸软骨素具有很好的安全性。
[0066][0067]
综合实例的实验结果可见，三种硫酸软骨素的细胞毒性不高于已经获得安全许可的对照样品boceprevir和gc376，在安全使用浓度下，预防性使用三种天然来源的硫酸软骨素可以有效的抑制冠状病毒的感染。