一种同时增强和抑制酿酒酵母7-脱氢胆固醇合成中多个关键基因的方法

1.本发明属于生物工程技术领域，尤其是指一种同时增强和抑制酿酒酵母7-脱氢胆固醇合成中多个关键基因的方法。


背景技术：

2.维生素d3(cholecalciferol,vd3)是人体中一种激素前体，具有能够调节细胞分化，促进骨质钙化等功能，vd3在人体的肝脏中被羟基化，形成25-羟基维生素d3(25-hydroxyvitamin d3，25-oh-vd3)，在肾脏中转化为1,25-二羟基维生素d3(1,25-dihydroxyvitamin d3，1,25-(oh)2-vd3。人体中的维生素d3主要来源是通过紫外线照射皮肤底层中的7-脱氢胆固醇(7-dehydrocholestero，7-dhc)转化而来的，同时也可以通过食物获取一部分，但由于每个人的饮食结构不同，通过饮食补充vd3效果不佳。我国居民vd3水平检测显示60％以上的居民缺乏vd3，并且vd3的巨大要用价值和广阔市场需求继续推动合成技术的改革和发展。7-脱氢胆固醇(7-dehydrocholestero，7-dhc)是合成vd3的重要前体物质，生产vd3的核心问题在于7-dhc的合成。
3.7-dhc的微生物代谢工程合成法大部分是基于含有天然甾醇合成路径的菌株所进行的，由于甾醇合成路径的代谢流占菌体总体代谢流的比例较低，主要集中在已知合成路径中基因的增强和分支路径的阻断，例如中国专利cn104988168a便通过增强天然甾醇合成的前体物质乙酰辅酶a的合成来提高7-dhc的产量，但也是通过传统的更换组成型强启动子，增强基因(acs、adh2、acl和ald6)的表达，但这样会造成菌体代谢压力过高。中国专利cn104988168a和中国专利cn103275997a通过直接敲除麦角甾醇合成路径中的关键基因：erg5和erg6，进一步增强7-dhc的合成，但是完全阻断麦角甾醇的合成会对菌株的生长产生不可逆的影响，不利于工业化的大规模生产。
4.vd3的微生物合成主要集中于菌株的筛选方面，如中国专利cn103275997a、中国专利cn107075551b、中国专利cn104988168a。筛选的菌株大部分都是应用于vd3合成活性vd3，很少筛选直接合成vd3的菌株，并且菌株的筛选费时费力，还需要花费大量金钱进行大规模后期筛选与发酵检测，才能获得vd3产量极低的菌株。
5.基因的调控工具无论是在酿酒酵母的基础研究还是工业应用中，都起着重要的作用。随着近几年crispr系统的研究发展，其被广泛的应用于各种生物的基因编辑与基因调控中，如中国专利cn112204147a，基于cpf1的植物转录调控系统，使用cpf1对植物进行转录激活与抑制，但是，使用单一的cas蛋白进行激活与抑制时，会使系统的正交性降低，往往效果不明显。如中国专利cn110468153a，构建一种响应远红光的cas9系统对基因转录进行调控，但是，其需要满足额外的因素，使用范围较窄。
6.目前合成vd3的方法主要包括：化学法合成，微生物转化和微生物代谢合成三种方法。化学合成法需要以价格较贵的羊毛脂胆固醇为原料，经过多步基团保护和脱保护，获得7-脱氢胆固醇，再经过光照反应，开环和异构化获得vd3，由于使用多种有机试剂，产物的分
离纯化过程复杂，产物收率较低。微生物转化法目前只用于将vd3转化为活性vd3，使用的微生物一般为链霉菌属、分枝杆菌属等微生物。随着合成生物学和基因工程的发展，微生物代谢工程法利用麦角甾醇生产菌株，进行7-dhc和vd3的生产具有巨大的潜力。


技术实现要素：

7.现有利用酿酒酵母进行7-dhc的生产技术利用的是酵母本身的甾醇合成路径，该路径包括13个p450酶，且在酵母中甾醇合成代谢比例不高，因此，如果只通过传统的增加拷贝数进行表达的增强，势必会导致酵母代谢紊乱，产生其他过量副产物，加大了目标产物的纯化难度。若单纯的通过敲除erg5和erg6基因阻断麦角甾醇的合成，虽然会有一定的7-dhc积累，但完全阻断麦角甾醇的合成势必会对生产菌株的生长产生不良影响，进而影响7-dhc和vd3的产量。为解决上述技术问题，本发明提供一种同时增强和抑制酿酒酵母7-脱氢胆固醇合成中多个关键基因的方法。
8.本发明的第一个目的在于提供一种同时增强和抑制酿酒酵母7-脱氢胆固醇合成中多个关键基因的方法，包括将酿酒酵母中乙醇脱氢酶(adh2)、截断的hmg-coa还原酶(thmg1)、异戊烯二磷酸异构酶(idi1)、角鲨烯环氧酶(erg1)、羊毛甾醇14-α-脱甲基酶(erg11)、c-14甾醇还原酶(erg24)、c-4甲基甾醇氧化酶(erg25)、c-3甾醇脱氢酶(erg26)、3-酮甾醇还原酶(erg27)以及外源基因甾醇
△
24-还原酶(dhcr24)进行同时增强表达，和/或对苹果酸合酶(mls1)、柠檬酸合酶(cit2)、delta(24)-甾醇c-甲基转移酶(erg6)进行同时抑制。
9.在本发明的一个实施方式中，所述乙醇脱氢酶(adh2)的编号为id:nm_001182812.1、截断的hmg-coa还原酶(thmg1)的编号为id:xm_033912352.1、异戊烯二磷酸异构酶(idi1)的编号为id:nm_001183931.1、角鲨烯环氧酶(erg1)的编号为id:nm_001181304.1、羊毛甾醇14-α-脱甲基酶(erg11)的编号为id:nm_001179137.1、c-14甾醇还原酶(erg24)的编号为id:nm_001183118.1、c-4甲基甾醇氧化酶(erg25)的编号为id:nm_001181189.3、c-3甾醇脱氢酶(erg26)的编号为id:nm_001180866.1、3-酮甾醇还原酶(erg27)的编号为id:nm_001181987.1，以及外源基因甾醇
△
24-还原酶(dhcr24)的编号为id:nm_001031288.1。
10.在本发明的一个实施方式中，所使用来源于鸡的外源基因dhcr24进行了酿酒酵母密码子偏好性优化，优化方法为：将来源于鸡的dhcr24基因输入网站https://www.genscript.com/tools/gensmart-codon-optimization，进行针对酿酒酵母密码子偏好性优化，优化后进行基因的合成。
11.在本发明的一个实施方式中，所述苹果酸合酶(mls1)的编号为id:nm_001182955.1、柠檬酸合酶(cit2)的编号为id:nm_001178718.1、delta(24)-甾醇c-甲基转移酶(erg6)的编号为id:nm_001182363.1。
12.在本发明的一个实施方式中，所述酿酒酵母为酿酒酵母s288c。
13.在本发明的一个实施方式中，所述乙醇脱氢酶(adh2)、截断的hmg-coa还原酶(thmg1)、异戊烯二磷酸异构酶(idi1)、角鲨烯环氧酶(erg1)、羊毛甾醇14-α-脱甲基酶(erg11)、c-14甾醇还原酶(erg24)、c-4甲基甾醇氧化酶(erg25)、c-3甾醇脱氢酶(erg26)、3-酮甾醇还原酶(erg27)以及外源基因甾醇
△
24-还原酶(dhcr24)通过使用诱导型启动子
gal1p和gal7p进行表达。
14.在本发明的一个实施方式中，所述诱导型启动子gal1p和gal7p的强度是使用dcpf1-vp激活系统进行增强，启动子gal1p的强度增加85％，启动子gal7p增加69％。
15.在本发明的一个实施方式中，所述dcpf1-vp激活系统发挥功能的基因片段为dpp1-kan-dcpf1-vp-crrna1-7-1，所述dpp1-kan-dcpf1-vp-crrna1-7-1的序列见seq id no 1。
16.在本发明的一个实施方式中，所述苹果酸合酶(mls1)、柠檬酸合酶(cit2)、delta(24)-甾醇c-甲基转移酶(erg6)通过dcas9-rd抑制系统进行抑制，erg6、mls1和cit2三个基因分别被抑制了88％、84％和72％。
17.在本发明的一个实施方式中，所述dcas9-rd抑制系统发挥功能的基因片段为gal80-kan-dcas9-rd-sgrnaemc，所述gal80-kan-dcas9-rd-sgrnaemc的序列见seq id no 2。
18.本发明的第二个目的在于提供一种工程酵母菌，所述工程酵母菌通过将酿酒酵母中乙醇脱氢酶(adh2)、截断的hmg-coa还原酶(thmg1)、异戊烯二磷酸异构酶(idi1)、角鲨烯环氧酶(erg1)、羊毛甾醇14-α-脱甲基酶(erg11)、c-14甾醇还原酶(erg24)、c-4甲基甾醇氧化酶(erg25)、c-3甾醇脱氢酶(erg26)、3-酮甾醇还原酶(erg27)以及外源基因甾醇
△
24-还原酶(dhcr24)进行同时增强表达，和/或对苹果酸合酶(mls1)、柠檬酸合酶(cit2)、delta(24)-甾醇c-甲基转移酶(erg6)进行同时抑制所得。
19.本发明的第三个目的在于提供工程酵母菌在合成7-脱氢胆固醇中的应用。
20.在本发明的一个实施例中，将所述工程酵母菌的种子液在ypd培养基中，在30℃、180-220rpm培养16-20h后，摇瓶发酵。按接种量1-5％接入含有ypd液体培养基的圆底摇瓶内培养发酵。
21.在本发明的一个实施例中，培养发酵的条件为：30℃，180-220rpm培养96-120h。
22.在本发明的一个实施例中，发酵至26h时，加入50-60％(体积分数)乙醇进行碳源的补充。发酵结束后，离心取沉淀。
23.在本发明的一个实施例中，所述碳源包括葡萄糖、蔗糖、甘油、乙醇。
24.本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
25.本发明以原始的酿酒酵母s288c为出发菌株，将dcpf1与vp(激活域)进行融合，构建以dcpf1为基础的激活系统。将酵母7-dhc合成路径中的乙醇脱氢酶(adh2)、截断的hmg-coa还原酶(thmg1)、异戊烯二磷酸异构酶(idi1)、角鲨烯环氧酶(erg1)、羊毛甾醇14-α-脱甲基酶(erg11)、c-14甾醇还原酶(erg24)、c-4甲基甾醇氧化酶(erg25)、c-3甾醇脱氢酶(erg26)、3-酮甾醇还原酶(erg27)以及外源基因甾醇
△
24-还原酶(dhcr24)分别使用诱导型启动子gal1p和gal7p进行表达，并使用dcpf1-vp激活系统对启动子gal1p和gal7p的强度进行增强，达到提高7-dhc产量的目的，产量为371.5mg/l。将dcas9依次与抑制域ume6、mig1、tup1串联融合，构建dcas9为基础的抑制系统，设计该系统识别的sgrna，对苹果酸合酶(mls1)、柠檬酸合酶(cit2)、delta(24)-甾醇c-甲基转移酶(erg6)进行抑制，进一步提升7-dhc的产量，使得7-dhc的产量达到464mg/l。
附图说明
26.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
27.图1是本发明dcpf1-vp激活系统的构建示意图。
28.图2是本发明dcas9-rd抑制系统的构建示意图。
29.图3是使用dcpf1-vp增强启动子gal1p和gal7p的强度图。
30.图4是使用dcas9-rd抑制效果图。
31.图5是本发明所得菌株工程酵母菌sx-6和工程酵母菌sx-7的7-dhc的产量图。
具体实施方式
32.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
33.本发明对7-dhc的检测使用的仪器为高效液相色谱，将发酵96h以上的工程酵母菌液进行高速离心，弃掉上清，使用无菌水进行重悬，加入0.5mm的玻璃珠，使用高速匀浆破碎仪破碎10min，取出破碎后的混合液，加入2％抗坏血酸和1％hbt，混匀，依次加入10％无水乙醇，2％的1.5mol/l的氢氧化钾甲醇溶液，在80℃的水域中皂化2小时，皂化结束后使用萃取液(异丙醇：正己烷＝1:3或石油醚或甲醇)进行超声震荡30分钟，使用分液漏斗除去下层杂质后，将萃取混合液进行冷冻干燥处理，处理结束后使用甲醇或乙腈或甲醇和乙腈的混合物复溶，0.55μm过滤后进行高效液相色谱分析。流动相使用甲醇和水，比例为90:10或者95:5或者98:2。检测器使用紫外检测器，检测波长为265-280nm。
34.为了区别于传统的通过增加基因拷贝数的方法，设计基于crispr多基因激活与抑制系统，对酿酒酵母7-dhc的合成路径关键基因进行激活与抑制，在尽可能不影响菌株生长状态的同时，提升7-dhc的产量，最终利用该系统对关键基因进行了激活与抑制，并且效果明显，在菌株生长状态正常，并且7-dhc的产量为464mg/l。
35.为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下技术方案：
36.本发明提供一种基于crispr技术的多个基因激活与抑制系统的构建方法；
37.本发明利用构建的上述系统对酿酒酵母7-dhc的合成路径进行调控；
38.其中使用上述系统进行增强的基因有：乙醇脱氢酶(adh2)、截断的hmg-coa还原酶(thmg1)、异戊烯二磷酸异构酶(idi1)、角鲨烯环氧酶(erg1)、羊毛甾醇14-α-脱甲基酶(erg11)、c-14甾醇还原酶(erg24)、c-4甲基甾醇氧化酶(erg25)、c-3甾醇脱氢酶(erg26)、3-酮甾醇还原酶(erg27)、甾醇
△
24-还原酶(dhcr24)；
39.其中使用上述系统进行抑制的基因有：苹果酸合酶(mls1)、柠檬酸合酶(cit2)、delta(24)-甾醇c-甲基转移酶(erg6)。
40.本发明的还提供工程酵母菌在合成7-脱氢胆固醇生产中的应用。
41.在本发明的一个实施例中，将所述工程酵母菌的种子液在ypd培养基中，在30℃、180-220rpm培养16-20h后，摇瓶发酵。按接种量1-5％接入含有ypd液体培养基的圆底摇瓶内培养发酵。
42.在本发明的一个实施例中，培养发酵的条件为：30℃，180-220rpm培养96-120h。
43.在本发明的一个实施例中，发酵至26h时，加入50-60％(体积分数)乙醇作为碳源
进行补充。发酵结束后，离心取沉淀。
44.在本发明的一个实施例中，所述碳源包括葡萄糖、蔗糖、甘油、乙醇。
45.实施例1构建产7-dhc的酿酒酵母菌及强化路径中相关基因
46.(a)以酿酒酵母工程菌s288c基因组为模板，采用引物adh-f，adh-r扩增得到基因片段adh2，采用引物idi-f，idi-r扩增得到基因片段idi1，采用引物e1-f、e1-r扩增得到基因片段erg1，采用引物e11-f、e11-r扩增得到基因片段erg11，采用引物e24-f、e24-r扩增得到基因片段erg24，采用引物e25-f、e25-r扩增得到基因片段erg25，采用引物e26-f、e26-r扩增得到基因片段erg26，采用引物e27-f、e27-r扩增得到基因片段erg27，采用引物gal1-f、gal1-r扩增得到启动子基因片段gal1p，采用引物gal7-f、gal7-r扩增得到启动子基因片段gal7p。通过基因合成，获得片段dhcr24和thmg1。采用引物208up-f、208up-r扩增得到上游同源臂片段208up，采用引物208down-f、208down-r扩增得到下游同源臂片段208down，采用引物1622up-f、1622up-r扩增得到上游同源臂片段1622up，采用引物1622down-f、1622down-r扩增得到下游同源臂片段1622down，采用引物308up-f、308up-r扩增得到上游同源臂片段308up，采用引物308down-f、308down-r扩增得到下游同源臂片段308down，采用引物1021up-f、1021up-r扩增得到上游同源臂片段1021up，采用引物1021down-f、1021down-r扩增得到下游同源臂片段1021down，采用引物911up-f、911up-r扩增得到上游同源臂片段911up，采用引物911down-f、911down-r扩增得到下游同源臂片段911down。
47.(b)将上述得到的启动子片段gal1p和gal7p分别与步骤(a)获得的基因片段进行重叠pcr，获得基因片段208-gal1p-dhcr24-gal7p-adh2、1622-gal1p-thmg1-gal7p-idi1、308-gal1p-erg1-gal7p-erg11、1021-gal1p-erg24-gal7p-erg25、911-gal1p-erg26-gal7p-erg27。
48.(c)以pml104质粒为模板，分别使用引物208-f、208-r进行质粒环p，得到能识别片段208-gal1p-dch24-gal7p-adh2插入位点的质粒，命名为pml104-1，以引物1622-f、1622-r进行质粒环p，得到能识别片段1622-gal1p-thmg1-gal7p-idi1插入位点的质粒，命名为pml104-2，以引物308-f、308-r进行质粒环p，得到能识别片段308-gal1p-erg1-gal7p-erg11插入位点的质粒，命名为pml104-3，以引物1021-f、1021-r进行质粒环p，得到能识别片段1021-gal1p-erg24-gal7p-erg25插入位点的质粒，命名为pml104-4，以引物911-f、911-r进行质粒环p，得到能识别片段911-gal1p-erg26-gal7p-erg27插入位点的质粒，命名为pml104-5。
49.(d)将步骤(b)和(c)获得的片段和质粒分别倒入酿酒酵母中，经过测序验证后，将正确的单菌落在5-foa的ypd平板上划线，30℃培养2-3天，分别得到菌株命名为sx-1、sx-2、sx-3、sx-4、sx-5。
50.引物序列：
51.adh-f：aaaacagttgaatattccctcaaaaatgatgtctattccagaaactcaaaaagcc
52.adh-r：aagatattcagtttttgtcattgccgtcttatttagaagtgtcaacaacgtatct
53.idi-f：gttgaatattccctcaaaaatgatgactgccgacaacaatagtatg
54.idi-r：ttacttcttcaattcgtacattatattatagcattctatgaatttg
55.e1-f：atacctctatactttaacgtcaaggagatgtctgctgttaacgttgcacc
56.e1-r：gtccatatctttccatagatttttaaccaatcaactcaccaaacaaaaatggg
57.e11-f：acagttgaatattccctcaaaaatgatgtctgctaccaagtcaatcgttg
58.e11-r：ctattgtgtaatagaagttagatcttttgttctggatttctcttttccca
59.e24-f：atactttaacgtcaaggagatggtatcagctttgaatcccag
60.e24-r：ccgtccatatctttccatagatttttaataaacatatggaatgatcttgtaagga
61.e25-f：aatattccctcaaaaatgatgtctgccgttttcaacaacg
62.e25-r：tatttcacagaatgaatttcttagttagtcttcttttgagcattgttttcagc
63.e26-f：ttaacgtcaaggagatgtcaaagatagattcagttttaattatcggtggtt
64.e26-r：tccatatctttccatagatttttacaaaccttcgtccatccaggc
65.e27-f：gaatattccctcaaaaatgatgaacaggaaagtagctatcgtaacgg
66.e27-r：atttctgttttaaatttaaatgggggttctagtttcaacaatttg
67.gal1-f：cggattagaagccgccgagcgggc
68.gal1-r：ctccttgacgttaaagtatagaggtata
69.gal7-f：aaatctatggaaagatatggacgg
70.gal7-r：catttttgagggaatattcaactg
71.208up-f：tggtgaattggctaaacatgccgtc
72.208up-r：cccgctcggcggcttctaatccggactctgctagtatttctgatt
73.208down-f：gacggcaatgacaaaaactgaatat
74.208down-r：agacacttgtatcctatactatca
75.1622up-f：ctaaatgtgttgctagtattattt
76.1622up-r：cgctcggcggcttctaatccgtgtttttgctgttaccttctgcac
77.1622down-f：ttcatagaatgctataatataatgtacgaattgaagaagtaaatt
78.1622down-r：gtcctctttttaacgcgtctactaa
79.308up-f：gatatatgcagagaaggagcaaat
80.308up-r：ccgctcggcggcttctaatccgatgttgaaatttcacttatttta
81.308down-f：agaacaaaagatctaacttctattacacaatagtttcaatag
82.308down-r：tgaattttaattctacgtcaacga
83.1021up-f：gagtccgcgtttgaaattgcagtt
84.1021up-r：gtcgcccgctcggcggcttctaatccgacactggaaaatttgagtcatgg
85.1021down-f：ctcaaaagaagactaactaagaaattcattctgtgaaatatcacg
86.1021down-r：ttgtttatttccagatttctatttt
87.911up-f：agtttattttcaaactgtattttga
88.911up-r：tgtcgcccgctcggcggcttctaatccgtcaacatccgatttttttctataaaat
89.911down-f：ttgttgaaactagaacccccatttaaatttaaaacagaaatgaaatgagc
90.911down-r：tattaataggaatagtaatcatagtac
91.208-f：tttctagctctaaaacagatcttttgtttagcggacgatcatttatctttcactgcggag
92.208-r：gtccgctaaacaaaagatctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagt
93.1622-f：tttctagctctaaaactttgcgatgtggtggctttagatcatttatctttcactgcggag
94.1622-r：taaagccaccacatcgcaaagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtcc
95.308-f：tttctagctctaaaactatattctgtttgacaagtggatcatttatctttcactgcggag
vp-crrna1-7-1，将其与获得的片段dpp1up、dpp1down进行重叠pcr，获得片段dpp1-kan-dcpf1-vp-crrna1-7-1(见seq id no 1)。
106.dpp1-kan-dcpf1-vp-crrna1-7-1片段序列(见seq id no 1)：
107.actagtactcgatttctggcgcagcaaaaatatagcattatgtccgataaacacagttgtgatctgtcttgtgatcgcatactctgcagataatcagttgaaatagcagcttttaagtgagaatcttattcttagtctacatcgttacattgtatcagtcacaggtacggagagaaattatacttttcgatttcattcaatgtagtttcttttttacattaaatatagttttccagtagtgcactattattaaggcgcttctgtttttagtcaacactttttcagatagtacctttcaggtggttagagtgcgatccctttaaaaaaaagtattcgtcaacgatgacagggtaaagaataaatgcagcacgcctggcgtatactgctataattgtacatcatgttatcggcgttgattctcaattgtttggtgattagcttttatatatagatagaaacccaacgttggataacctcacgactaacttttttgtattttagaaataatttgtcgatcggttgtatatttttgtcatatattatctagaaacgttagggaataaactgttatctagggtccactaacatacgcgcagttcggaaatcagcaaacatcacttaaaggacacctgctataaactgaattgtgtccaatttttcgagtagttagcagttcaataaagggcacgttatcaattgttaaaggcaaagaatcagaattaaatcatagcaaacgaccaaaatgaacagagtttcgtttattaaaacgcctttcaacataggggcgaaatggagattagaagatgtctttttgctcattatcatgatacttcttaactacccagtgtattaccaacaaccgttcgaacgtcagttttacattaacgatctcactatatcgcatccttatgcgaccgctgcaggtcgacgaattctaccgttcgtataatgtatgctatacgaagttatagatctgtttagcttgcctcgtccccgccgggtcacccggccagcgacatggaggcccagaataccctccttgacagtcttgacgtgcgcagctcaggggcatgatgtgactgtcgcccgtacatttagcccatacatccccatgtataatcatttgcatccatacattttgatggccgcacggcgcgaagcaaaaattacggctcctcgctgcagacctgcgagcagggaaacgctcccctcacagacgcgttgaattgtccccacgccgcgcccctgtagagaaatataaaaggttaggatttgccactgaggttcttctttcatatacttccttttaaaatcttgctaggatacagttctcacatcacatccgaacataaacaaccatgggtaaggaaaagactcacgtttcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccggcaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataagcttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaatcagtactgacaataaaaagattcttgttttcaagaacttgtcatttgtatagtttttttatattgtagttgttctattttaatcaaatgttagcgtgatttatattttttttcgcctcgacatcatctgcccagatgcgaagttaagtgcgcagaaagtaatatcatgcgtcaatcgtatgtgaatgctggtcgctatactgctgtcgattcgatactaacgccgccatccagtgtcgaaaacgagctcataacttcgtataatgtatgctatacgaacggtacccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattgggtaccttttctttttttgcggtcacccccatgtggcggggaggcagaggagtaggtagagcaacgaatcctactatttatccaaattagtctaggaactctttttctagattttttagatttgagggcaagcgctgttaacgactcagaaatgtaagcactacggagtagaacgagaaatccgccataggtggaaatcctagcaaaa
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ttctacaagcaatccatttccaagcatccagaatggaaggatttcggtttcagattctctgacactcaaagatacaactccattgatgaattctacagagaagtcgaaaaccaaggttacaagttgactttcgaaaacatctctgaatcttacattgattccgtcgttaaccaaggtaagttgtacttgttccaaatctacaacaaggacttctccgcctactccaagggtagaccaaacttgcacaccttgtactggaaggctttgtttgacgaaagaaacttgcaagatgttgtctacaagctgaacggtgaagctgaattgttttacagaaagcaaagtattccaaagaaaatcactcacccagctaaggaagccattgccaacaagaataaagacaaccctaagaaggaatctgtttttgaatacgacttaatcaaggataagagattcaccgaagacaaattcttcttccattgtccaatcaccatcaacttcaagtcctctggagctaacaagttcaacgatgaaatcaacttgttattgaaggaaaaggctaacgatgttcacatcttgtctatcgctcgtggtgaaagacacttggcttactacactttggttgatggtaagggtaacatcattaagcaagacacctttaacattatcggtaacgacagaatgaagaccaactaccacgacaaattggctgctattgaaaaggacagagactctgctagaaaggactggaaaaagatcaataacatcaaggaaatgaaggaaggttacttgtctcaagttgtccatgaaattgctaagttggttatcgaatacaatgctatcgttgtcttcgaggatttgaacttcggttttaagagaggtagattcaaggttgaaaagcaagtttaccaaaaattggaaaagatgttgattgaaaagttgaactacttagtcttcaaggacaatgaatttgacaagactggtggtgtcttgagagcttaccaattgactgctccattcgaaactttcaagaagatgggtaagcaaaccggtatcatctactacgttccagctggtttcacttctaaaatctgtccagttaccggtttcgtcaaccaattgtacccaaagtacgaatccgtttccaagtcccaagaatttttctccaagttcgacaagatctgttacaacttagacaagggttatttcgagttttccttcgattacaaaaactttggtgacaaagccgctaagggtaaatggactatcgcttctttcggttctagattgatcaacttccgtaactccgataagaaccacaactgggacactagagaagtttacccaaccaaggaattagaaaaattgttgaaggactactctattgaatacggtcacggtgaatgtatcaaggctgccatctgtggtgaatctgataagaagttcttcgctaagctaacttccgtcttgaacaccattttgcaaatgagaaactccaagaccggtactgaattggactacttgatttctccagttgccgatgttaacggtaacttcttcgactctagacaagctccaaagaacatgccacaagacgctgatgctaacggtgcctaccacattggtttgaagggtttgatgttgttgggtcgtattaagaacaaccaagaaggtaagaagttgaacctagtcattaagaacgaagaatacttcgaatttgttcaaaacagaaacaactccagagctgacccaaagaagaagagaaaagtcccgaaaaagaaacgcaaagttgggcgcgccgaggccagcggttccggacgggctgacgcattggacgattttgatctggatatgctgggaagtgacgccctcgatgattttgaccttgacatgcttggttcggatgcccttgatgactttgacctcgacatgctcggcagtgacgcccttgatgatttcgacctggacatgctgattaactctagaagttccggatctccgaaaaagaaacgcaaagttggtagccagtacctgcccgacaccgacgaccggcaccggatcgaggaaaagcggaagcggacctacgagacattcaagagcatcatgaagaagtcccccttcagcggccccaccgaccctagacctccacctagaagaatcgccgtgcccagcagatccagcgccagcgtgccaaaacctgccccccagccttaccccttcaccagcagcctgagcaccatcaactacgacgagttccctaccatggtgttccccagcggccagatctctcaggcctctgctctggctccagcccctcctcaggtgctgcctcaggctcctgctcctgcaccagctccagccatggtgtctgcactggctcaggcaccagcacccgtgcctgtgctggctcctggacctccacaggctgtggctccaccagcccctaaacctacacaggccggcgagggcacactgtctgaagctctgctgcagctgcagttcgacgacgaggatctgggagccctgctgggaaacagcaccgatcctgccgtgttcaccgacctggccagcgtggacaacagcgagttccagcagctgctgaaccagggcatccctgtggcccctcacaccaccgagcccatgctgatggaataccccgaggccatcacccggctcgtgacaggcgctcagaggcctcctgatccagctcctgcccctctgggagcaccaggcctgcctaatggactgctgtctggcgacgaggacttcagctctatcgccgatatggatttctcagccttgctgtaatctttgaaaagataatgtatgattatgctttcactcatatttatacagaaacttgatgttttctttcgagtatatacaaggtgattacatgtacgtttgaagtacaactctagattttgtagtgccctcttgggctagcggtaaaggtgcgcatttttt
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108.(e)将步骤(d)得到片段，导入工程菌sx-5的感受态中，通过g418平板进行筛选，使用验证引物yzdcpf1-f和yzdcpf1-r进行菌落pcr验证。验证正确的单菌落，将其在5-foa的ypd平板进行划线，在30℃培养2-3d，筛选去掉g418标签的单菌落，命名为sx-6。
109.引物序列：
110.dcpf1tu-f:cgatgttcacatcttgtctatcgctcgtggtgaaagacacttggcttac
111.dcpf1tu-r:gccaagtgtctttcaccacgagcgatagacaagatgtgaacatcgttagcct
112.gal1p23-f1:actggtctcaagatagtaatacgcttaactgctcattggtaagaaattgtctg
113.gal1p23-r1:aatgagcagttaagcgtattactatcttgagaccagtgatcatttatctttcactgcggagaag
114.gal7p23-f1:actggtctcaagatgttacttttgatatcactcacaaggtaagaaattgtctg
115.gal7p23-r1:ttgtgagtgatatcaaaagtaacatcttgagaccagtgatcatttatctttcactgcggagaag
116.gal1p23-f2:actggtctcaagattggttatgaagaggaaaaattggggtaagaaattgtctg
117.gal1p23-r2:ccaatttttcctcttcataaccaatcttgagaccagtgatcatttatctttcactgcggagaag
118.gal7p23-f2:actggtctcaagatcttaacccaaaaataagggaaagggtaagaaattgtctg
119.gal7p23-r2:ctttcccttatttttgggttaagatcttgagaccagtgatcatttatctttcactgcggagaag
120.gal1p23-f3:actggtctcaagatatctattaacagatatataaatgggtaagaaattgtctg
pcit-gfp与ura-dcas9-rd-cit、pfa6a-trp1-perg6-gfp与ura-dcas9-rd-erg6分别导入酵母sc288c中，得到菌株sg-mls、sg-cit、sg-erg6，分别使用酶标仪进行绿色荧光强度的检测，结果如图4。
147.(b)以质粒pfa6a-trp1-perg6-gfp为模板，采用引物cas-rd-f、cas-rd-r扩增得到基因片段dcas9-rd-erg6，以购自addgene的质粒pcsn068为模板，采用引物kan2-f、kan2-r扩增得到基因片段kan-cas，以酿酒酵母sc288c基因组为模板，采用引物trna-g-f和trna-g-r扩增得到基因片段trna-gly，直接采用引物mls-f和mls-r重叠合成片段mls-20。直接采用引物cit-f和cit-r重叠合成片段cit2-20，以酿酒酵母sc288c的基因组为模板，采用引物gal80up-f和gal80up-r扩增得到基因片段gal80up，采用引物gal80down-f和gal80down-r扩增得到基因片段gal80down。
148.(c)将步骤(b)中获得的片段：dcas9-rd-erg6、kan-cas、trna-gly、、mls-20、cit2-20、gal80up、gal80down进行重叠pcr，获得片段gal80-kan-dcas9-rd-sgrnaemc(见seq id no 2)。gal80-kan-dcas9-rd-sgrnaemc片段序列(见seq id no 2)：
149.aggcatacctaatgctggggatgaaacacgttggacgttttggggcgcctgtctacaggataaagacgggtcggatacctgcacaagcaatttggcacctgcataccccatttccccagtagataacttcaacacacacatcaatgtccctcaccagtttatttccaaaagagacgctttttactacctgactagattttcattttgtttcttttggattgcgcttgcctttgtaggtgtgtcgtttatcctttacgttttgacttggtgctcgaagatgctttcagagatggtgcttatcctcatgtcttttgggtttgtcttcaatacggcagccgttgtcttgcaaacggccgcctctgccatggcaaagaatgctttccatgacgatcatcgtagtgcccaattgggtgcctctatgatgggtatggcttgggcaagtgtctttttatgtatcgtggaatttatcctgctggtcttctggtctgttagggcaaggttggcctctacttactccatcgacaattcaagatacagaacctcctccagatggaatcccttccatagagagaaggagcaagcaactgacccaatattgactgccactggacctgaagacatgcaacaaagtgcaagcatagtggggccttcttccaatgctaatccggtcactgccactgctgctacggaaaaccaacctaaaggtattaacttcttcactataagaaaatcacacgagcgcccggacgatgtctctgtttaaatggcgcaagttttccgctttgtaatatatatttatacccctttcttctctcccctgcaatataatagtttaattctaatattaataatatcctatattttcttcatttaccggcgcactctcgcccgaacgacctcaaaatgtctgctacattcataataaccaaaagctcataacttttttttttgaacctgaatatatatacatcacatatcactgctggtccttgccgaccagcgtatacaatctcgatagttggtttcccgttctttccactcccgtcatggactacaacaagagatcttcggtctcaaccgtgcctaatgcagctcccataagagtcggattcgtcggtctcaacgcagccaaaggatgggcaatcaagacacattaccccgccatcgctgcaggtcgacgaattctaccgttcgtataatgtatgctatacgaagttatagatctgtttagcttgcctcgtccccgccgggtcacccggccagcgacatggaggcccagaataccctccttgacagtcttgacgtgcgcagctcaggggcatgatgtgactgtcgcccgtacatttagcccatacatccccatgtataatcatttgcatccatacattttgatggccgcacggcgcgaagcaaaaattacggctcctcgctgcagacctgcgagcagggaaacgctcccctcacagacgcgttgaattgtccccacgccgcgcccctgtagagaaatataaaaggttaggatttgccactgaggttcttctttcatatacttccttttaaaatcttgctaggatacagttctcacatcacatccgaacataaacaaccatgggtaaggaaaagactcacgtttcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccggcaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgat
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150.(d)将步骤(c)得到片段，导入工程菌sx-6的感受态中，通过g418平板进行筛选，使用验证引物yzdcas-f和yzdcas-r进行菌落pcr验证。验证正确的单菌落，将其在5-foa的ypd平板进行划线，在30℃培养2-3d，筛选去掉g418标签的单菌落，命名为sx-7。
151.引物序列：
152.dcas-f1:tattctatcggactggctatcgggactaatagcgtcgggt
153.dcas-r1:atagccagtccgatagaatacttcttgtccatggtg
154.dcas-f2:gacgctatcgtccctcagagcttcctcaaag
155.dcas-r2:ctctgagggacgatagcgtccacgtcgtagtctgagagcc
156.cit-f:agctctaaaactttgctttcaatgtttttgagatcatttatctttcactgcggagaag
157.cit-r:tcaaaaacattgaaagcaaagttttagagctagaaatagcaagttaaaataagg
158.mls1-f:agctctaaaacgctcaaatcagtgggcgtcggatcatttatctttcactgcggagaag
159.mls1-r:cgacgcccactgatttgagcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataagg
160.erg6-f:agctctaaaacgtttcggcgttttctggcttgatcatttatctttcactgcggagaag
161.erg6-r:aagccagaaaacgccgaaacgttttagagctagaaatagcaagttaaaataagg
162.ura-104-f:cggcatcagagcagattgta
163.ura-104-r:agcgagtcagtgagcgag
164.pmls-f:tattgaagtatgtctaatgcgaaggtactttt
165.pmls-r:aattcttcagcagttttcttaattcttttatgt
166.perg6-f:cattgctatattgaagtattcgggtgttttctcctatcctctgctgct
167.perg6-r:ttttttcttatgctgcctactatattattatt
168.pcit-f:tatattgaagtaaattggtgacgttaatctaaa
169.pcit-r:ccgggttttttttttcttgttactagtattatt
170.cas-rd-f：tcgtataatgtatgctatacgaacggtatcattatcaatactgccatttc
171.cas-rd-r：gcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccga
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173.kan2-r:tgaaatggcagtattgataatgataccgttcgtatagcatacatt
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181.cit-r：tccgggcttgcgcaaatactagtaacaagaaaaagttttagagctagaaat
182.gal80up-f：aggcatacctaatgctggggatga
183.gal80up-r：aattcgtcgacctgcagcgatggcggggtaatgtgtcttgatt
184.gal80down-f：agctccagcttttgaatgcaaggtttcgatttcgaagg
185.gal80down-r：tgatgcacttcatgaacctgttgg
186.yzdcas-f：cctcatccaccagagcatcac
187.yzdcas-r：caaaagctggagctccaccg
188.实施例4构建成功的工程酵母菌进行发酵培养
189.在2mlypd培养基中接种固体ypd平板上的工程酵母菌sx-6和sx-7单菌落，30℃，220rpm培养16-20h后，按接种量1％接入含有25mlypd液体培养基的250ml圆底摇瓶内，30℃，220rpm培养96h。发酵至26h时，使用50％(体积浓度)乙醇作为碳源，进行补充。发酵结束后，离心取沉淀。使得7-dhc的产量分别达到371.5mg/l、464mg/l。
190.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变
动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。