一种同时增强和抑制酿酒酵母7-脱氢胆固醇合成中多个关键基因的方法

技术特征：
1.一种同时增强和抑制酿酒酵母7-脱氢胆固醇合成中多个关键基因的方法，其特征在于，包括将酿酒酵母中乙醇脱氢酶adh2、截断的hmg-coa还原酶thmg1、异戊烯二磷酸异构酶idi1、角鲨烯环氧酶erg1、羊毛甾醇14-α-脱甲基酶erg11、c-14甾醇还原酶erg24、c-4甲基甾醇氧化酶erg25、c-3甾醇脱氢酶erg26、3-酮甾醇还原酶erg27以及经过密码子优化的外源基因甾醇
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24-还原酶dhcr24进行同时增强表达，和/或对苹果酸合酶mls1、柠檬酸合酶cit2、delta(24)-甾醇c-甲基转移酶erg6进行同时抑制。2.根据权利要求1中所述的同时增强和抑制酿酒酵母7-脱氢胆固醇合成中多个关键基因的方法，其特征在于，所述乙醇脱氢酶adh2的编号为id:nm_001182812.1、截断的hmg-coa还原酶thmg1的编号为id:xm_033912352.1、异戊烯二磷酸异构酶idi1的编号为id:nm_001183931.1、角鲨烯环氧酶erg1的编号为id:nm_001181304.1、羊毛甾醇14-α-脱甲基酶erg11的编号为id:nm_001179137.1、c-14甾醇还原酶erg24的编号为id:nm_001183118.1、c-4甲基甾醇氧化酶erg25的编号为id:nm_001181189.3、c-3甾醇脱氢酶erg26的编号为id:nm_001180866.1、3-酮甾醇还原酶erg27的编号为id:nm_001181987.1以及外源基因甾醇
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24-还原酶dhcr24的编号为id:nm_001031288.1、苹果酸合酶mls1的编号为id:nm_001182955.1、柠檬酸合酶cit2的编号为id:nm_001178718.1、delta(24)-甾醇c-甲基转移酶erg6的编号为id:nm_001182363.1。3.根据权利要求1所述的同时增强和抑制酿酒酵母7-脱氢胆固醇合成中多个关键基因的方法，其特征在于，所述乙醇脱氢酶adh2、截断的hmg-coa还原酶thmg1、异戊烯二磷酸异构酶idi1、角鲨烯环氧酶erg1、羊毛甾醇14-α-脱甲基酶erg11、c-14甾醇还原酶erg24、c-4甲基甾醇氧化酶erg25、c-3甾醇脱氢酶erg26、3-酮甾醇还原酶erg27以及经过密码子优化的外源基因甾醇
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24-还原酶dhcr24通过使用诱导型启动子gal1p和gal7p进行表达。4.根据权利要求3所述的同时增强和抑制酿酒酵母7-脱氢胆固醇合成中多个关键基因的方法，其特征在于，所述诱导型启动子gal1p和gal7p的强度是使用dcpf1-vp激活系统进行增强。5.根据权利要求4所述的同时增强和抑制酿酒酵母7-脱氢胆固醇合成中多个关键基因的方法，其特征在于，所述dcpf1-vp激活系统发挥功能的基因片段为dpp1-kan-dcpf1-vp-crrna1-7-1，所述dpp1-kan-dcpf1-vp-crrna1-7-1的序列见seq id no 1。6.根据权利要求1中所述的同时增强和抑制酿酒酵母7-脱氢胆固醇合成中多个关键基因的方法，其特征在于，所述苹果酸合酶mls1、柠檬酸合酶cit2、delta(24)-甾醇c-甲基转移酶erg6通过dcas9-rd抑制系统进行抑制。7.根据权利要求6中所述的同时增强和抑制酿酒酵母7-脱氢胆固醇合成中多个关键基因的方法，其特征在于，所述dcas9-rd抑制系统发挥功能的基因片段为gal80-kan-dcas9-rd-sgrnaemc，所述gal80-kan-dcas9-rd-sgrnaemc的序列见seq id no 2。8.一种工程酵母菌，其特征在于，所述工程酵母菌通过将酿酒酵母中乙醇脱氢酶adh2、截断的hmg-coa还原酶thmg1、异戊烯二磷酸异构酶idi1、角鲨烯环氧酶erg1、羊毛甾醇14-α-脱甲基酶erg11、c-14甾醇还原酶erg24、c-4甲基甾醇氧化酶erg25、c-3甾醇脱氢酶erg26、3-酮甾醇还原酶erg27以及经过密码子优化的外源基因甾醇
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24-还原酶dhcr24进行同时增强表达，和/或对苹果酸合酶mls1、柠檬酸合酶cit2、delta(24)-甾醇c-甲基转移酶erg6进行同时抑制所得。
9.权利要求8中所述的工程酵母菌在合成7-脱氢胆固醇中的应用。10.根据权利要求9中所述的应用，其特征在于，将所述工程酵母菌的种子液在培养基中摇瓶发酵。

技术总结
本发明提供了一种同时增强和抑制酿酒酵母7-脱氢胆固醇合成中多个关键基因的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过dCpf1-VP激活系统和dCas9-RD抑制系统，实现13个P450酶的同时表达和抑制的目的，构建出一种高产7-脱氢胆固醇的工程酵母菌，使得7-DHC的产量达到464mg/L。464mg/L。464mg/L。


技术研发人员：刘龙 陈坚 吕雪芹 堵国成 李江华 刘延峰 修翔
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2022.03.15
技术公布日：2022/6/10