特异性识别血管内皮生长因子的核酸适配体及用途的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种特异性识别血管内皮生长因子的核酸适配体与该核酸适配体的用途。


背景技术：

2.血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165，vegf165)是新生血管形成的必须因子和主要调节因子，也是肿瘤生长、新生血管性眼病和类风湿性关节炎等形成病理性血管生成的关键因子。大量的临床前和临床研究证明vegf-a与病理性眼部新生血管形成和血管通透性密切相关。肿瘤的生长和转移依赖于血管生成。在大多数肿瘤类型中，如前列腺癌、大肠癌，胃癌、结肠癌、胶质母细胞瘤、肾癌、肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌等组织中发现vegf165及其受体vegfr-2在肿瘤细胞和血管内皮细胞均有较高水平的表达，其表达量与肿瘤恶性程度呈正相关，其高表达还预示着癌症具有高复发率及高转移率；因此，检测vegf165的表达可作为诊断癌症和协助判断预后的一项重要指标。
3.检索我国专利数据库，关于血管内皮生长因子核酸适配体的专利申请cn202011408248.3主要是将vegf核酸适配体与载药纳米材料进行组装达到提高肿瘤渗透率的目的，该专利公布的核苷酸适配体序列为5
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tgtgggggtggacgggccgggtaga-3’。专利申请cn202110814225.0主要是将超支化聚硅氧烷、半胱氨酸和vegf核酸适配体进行接枝，最终实现靶向药物运输和体内示踪一体化。检索中国学位论文库，有关血管内皮生长因子核酸适配体的主要研究包括：筛选高亲和力与高特异性的vegf核酸适配体、将已经筛选到的适配体与其他生物、化学、物理材料进行组装用于肿瘤检测、治疗等。其中，论文《基于核酸适配体的载药体系构建及抗肿瘤活性研究》中所使用的vegf核酸适配体序列为：5
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tgtgggggtggacgggccgggtaga-3’。《基于dna自组装和金属纳米簇技术的电化学传感器用于microrna和vegf的检测》一文中将银铂双金属纳米簇(dna-ag/pt ncs)的过氧化物模拟酶活性，结合血管内皮生长因子(vegf)核酸适配体，设计研制了dna电化学生物传感器，用于高灵敏度和高特异性检测vegf，该vegf核酸适配体序列为5
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tgtgggggtggacgggccgggtaga-3’。检索外文文献，有关vegf核酸适配体的主要研究为筛选高亲和力与高特异性的vegf核酸适配体，所公开报道的序列均不涉及本发明所提出的vegf核酸适配体序列。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的在于提供一种核酸适配体。
5.本发明所述的核酸适配体，具有如seq id no.1所示的核酸序列，所述核酸适配体能特异性识别血管内皮生长因子。
6.发明人通过圆二色谱法对长度为40-50个bp的单链dna适配体随机候选文库进行初筛，选取cd谱发生较明显变化的序列进行等温滴定微量热法复筛，选取等温滴定微量热
法测定热量变化明显且拟合曲线符合预期的序列，用表面等离子共振法(spr)测定其亲和力，筛选得到有高亲和力的vegf165适配体。并将最终筛选到的适配体进行抑vegf165诱导的细胞增殖的效果评价，从而获得本发明所述的核酸适配体。
7.本发明的第二个目的在于提供所述的核酸适配体用于制备癌症诊断试剂中的用途。
8.本发明的第三个目的在于提供所述的核酸适配体用于制备治疗癌症的药物中的用途。
9.近年来，以vegf165为治疗靶标研制开发抗肿瘤药物和生物标志物研发检测试剂成为相关领域内研究的热点。而核酸适配体能特异性识别靶标物质，自20世纪90年代核酸适配体发展以来，因其具有相对于抗体的诸多优势而再医药、生物传感器等领域有广泛的研究和应用。因此，本发明以重组人vegf165蛋白(rhvegf165)为靶标筛选能与其高特异性和高亲和力结合的核酸适配体，能用于制备以vegf165为生物标志物的癌症诊断试剂，同时能用于制备以vegf165为治疗靶标的新的核酸适配体药物。
附图说明
10.图1为本发明的实施例1筛选得到的一个高亲和力的ss dna适配体二级结构图谱。
11.图2为本发明的实施例2得到的一个高亲和力的ss dna适配体的表面等离子共振法(spr)动力学分析。
12.图3为本发明所述的核酸适配体抑制vegf165促进huvec细胞增殖的实验结果。图中的“64”是指第64号序列的核酸适配体。
具体实施方式
13.下面通过具体实施例并结合附图对本发明做进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
14.实施例1：本发明所述的核酸适配体的筛选
15.1.随机设计长度为40-50个bp的单链dna序列，形成随机候选随机文库。
16.2.在形成候选随机文库后，采用计算机工作站运行核酸序列二级结构预测软件nupack以及mfold，筛选符合单一二级结构的序列，组成ssdna虚拟文库。
17.3.合成候选文库，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
18.4.核酸适配体的筛选
19.1)初筛：将合成回来的候选序列进行圆二色谱扫描。cd的运行参数设定为扫描波长220-320nm；扫描间隔1nm；扫描速度100nm/min；每次光谱采集重复3次。进行实验操作时分别对加入vegf165蛋白前后的ssdna溶液进行cd光谱采集；并比较对照组cd光谱数据减去背景cd光谱的数据，反应组cd光谱数据减去蛋白溶液cd光谱的数据，观察ssdna cd光谱在加入vegf165蛋白前后是否发生变化，将发生明显变化的序列用于下一步复筛。其中，初筛的实验组设置如下：
20.空白组：取300μl缓冲液置于25℃金属浴30min；
21.dna对照组：取20μl dna母液加入280μl缓冲液混匀后置于25℃金属浴反应30min；
22.蛋白对照组：取280μl 12μm的vegf165蛋白液加入20μl缓冲液混匀后置于25℃金
属浴反应30min；
23.蛋白实验组：取20μl dna母液加入280μl 12μm的vegf165蛋白液混匀后置于25℃金属浴反应30min。
24.2)复筛：使用itc-200进行实验。先用超纯水反复清洗样品池、参比池和滴定针，并进行水滴水实验，确定仪器正常且稳定。再使用dna溶液滴定tbse缓冲液作为背景数据；随后，向样品池注入280μl 10μm vegf165蛋白液，滴定针吸取60μl dna溶液，设置运行参数，输入样品池中被滴定液浓度和滴定针中滴定液浓度，运行滴定；分析itc滴定数据。
25.在以上两轮筛选实验中，圆二色谱初筛时选择cd谱发生了明显变化的核酸序列进行复筛；itc复筛时选择滴定过程中热量变化最明显的序列进行下一轮实验。
26.通过这两轮筛选，发明人得到了第64号序列，其序列为：
27.tgtaggggggcgggctatatgcaacgccccaggtcgacttcgacaat(seq id no.1)。
28.该序列核酸适配体的二级结构图谱见图1。
29.实施例2：本发明所述的核酸适配体的亲和力分析
30.挑选itc分析结果中kd值高的ss dna第64号序列进行表面等离子共振法(spr)测定亲和力。
31.将cm7芯片插入至biacore x-100生物大分子相互作用分析仪内，进样运行缓冲液，观察传感图基线是否水平。采用氨基偶联试剂盒将vegf165蛋白共价固定在cm7芯片上，先选取ph4.5的10mm naac溶液进行预偶联，芯片表面蛋白偶联总量设定为10000ru。选择50μm的ssdna溶液进样，用无盖1.5ml ep管装，离心除气泡后放在样品盘上，样品盘第16孔放一管超纯水，用于清洗进样针。用运行缓冲液将ssdna母液稀释成不同浓度(3.125μm,6.25μm,12.5μm,25μm,50μm)，根据软件提示制备的ssdna溶液不得低于检测所需体积，并按顺序放置在样品盘上。再生条件设置为缓冲液平衡10min，最后，运行仪器，并分析数据，根据拟合曲线计算出亲和力(affinity,kd)。
32.所筛选得到的第64号序列ss dna适配体的亲和力大小为79.3nm。图2为该序列ss dna适配体的表面等离子共振法(spr)动力学分析。观察其spr动力学分析图发现：它的动力学曲线属于快结合慢解离，若作为药物的话，需要高剂量来实现饱和，但药效持续时间较长。
33.实施例3抑制vegf165促进人脐静脉内皮细胞(huvec)增殖的效果评价
34.根据重组vegf165蛋白能促进人脐静脉内皮细胞(huvec)的增殖，本发明筛选到的核酸适配体能与vegf165蛋白特异性结合，故通过cck-8比色法比较加入rhvegf165蛋白后的huvec在加入核酸适配体前后的a450值变化来判断本发明所述的核酸适配体是否能起到抑制huvec增殖的作用。
35.具体实验操作如下：
36.(1)将25t培养瓶内细胞(细胞占85％-90％时)用0.25％胰酶消化后，用完全培养基dmem/f-12重悬细胞，各取160μl细胞悬液于无菌无酶的96孔板中，置于37℃，5％co2培养箱贴壁培养4h。
37.(2)抑增殖实验：往贴壁培养4h的96孔板内加入20μl cck-8溶液和20μl vegf165蛋白溶液、核酸适配体溶液、核酸适配体与蛋白混合液和对照pbs缓冲液，每组3个重复。加完所有样后，用枪头吸除孔内气泡，将96孔板置于37℃，5％co2培养箱继续培养之前测一次
a450值并记录数据，接着放在培养箱内继续培养，每隔1h测一次a450值并记录，直至a450值接近1.50则停止测量。
38.实验组设置：
39.1、对照组：(1)每孔加20μl pbs缓冲液(提前置于25℃金属浴中温育30mins)和20μl cck-8溶液做control对照；(2)不加细胞做空白对照，其他与实验组一样(排除细胞培养基和cck-8溶液对a450测量的影响)。
40.2、实验组：(1)每孔加20μl核酸蛋白混合液(2μm核酸适配体溶液10μl和10μl 20μg/ml vegf165蛋白的混合液混匀后置于25℃金属浴中提前温育30mins)和20μl cck-8溶液；(2)每孔加20μl 10μg/ml vegf165蛋白溶液(提前置于25℃金属浴中温育30mins)和20μl cck-8溶液；(3)每孔加1μm核酸溶液20μl(提前置于25℃金属浴中温育30mins)和20μl cck-8溶液。
41.第64号序列适配体进行抑增殖实验的结果如图3所示：只加入vegf165蛋白溶液的实验组能极显著地促进huvec的增殖(p《0.01)；与只加入vegf165蛋白液的实验组比较，加入ssdna和vegf165混合液的实验组能极显著地抑制huvec的增殖(p《0.01)，说明第64号序列能与vegf165特异性结合，从而降低vegf165的促增殖作用。