一株表达骨桥蛋白的毕赤酵母菌株

1.本发明涉及一株表达骨桥蛋白的毕赤酵母菌株，属于基因工程领域。


背景技术：

2.骨桥蛋白(osteopontin,opn)，亦称唾液酸糖蛋白，是一种高度磷酸化，且具有o-糖基化修饰的酸性蛋白，可由体内多种组织细胞合成或分泌，最早在成骨细胞中被发现，因而最初认为opn是一种重要的骨基质蛋白，与骨的形成和发展密切相关。而近年的研究发现，opn在母乳尤其是初乳中的含量甚高，是母乳中非常重要的一类免疫活性蛋白。不同物种间的母乳的opn的含量存在明显差异，比如，牛乳中opn的含量约为18mg/l，而人乳中opn的浓度高达138mg/l。同时，母乳opn还呈现明显的地区差异性，我国的母乳中的opn水平显著高于其他国家及地区，且在生命的不同发育时期，opn的含量也明显不同。有研究指出，在新生儿脐带血血浆、3月龄婴儿血浆中，opn含量非常高，约为成人的7-10倍，这表明opn对婴幼儿早期发育具有积极作用，特别是在生命早期的肠道生长、神经系统发育、免疫调节等方面。
3.胞内opn和分泌型opn在免疫调节中均存在重要作用，已经有不少动物研究和随机临床试验来调查母乳opn对生命早期免疫发育的影响。比如，将opn注入大鼠真皮质能够诱导高表达opn受体的巨噬细胞向注射处聚集，且这种局部浸润作用可被抗opn中和抗体明显抑制。同时，opn还可以诱导树突状细胞表达人白细胞dr抗原，使得树突状细胞刺激能力增强，亦可通过与cd44和整合素受体的互作来调控树突状细胞从表皮向淋巴结回流。此外，对婴儿(1-6个月)进行随机临床试验，也显示opn对婴儿免疫具有较好的调节作用。母乳喂养、常规配方奶粉喂养或添加opn的配方奶粉中含有65或130mg/l opn(分别为母乳中平均opn浓度的50％或100％)。与食用常规配方奶粉的婴儿相比，食用添加了opn的配方奶粉的婴儿的血清tnf-α水平显著降低，患病天数减少。与食用常规配方奶粉的婴儿相比，食用添加opn配方奶粉的婴儿的免疫细胞特征与母乳喂养的婴儿更相似。在婴儿4个月和6个月时，母乳喂养婴儿和添加opn配方奶粉婴儿的血浆样本中的opn水平高于常规配方奶粉婴儿的血浆样本。这些发现表明，在婴儿配方奶粉中添加牛乳opn可能通过增加内源性opn合成发挥其有益作用。
4.目前，市场上opn的获取方式主要来自新鲜牛乳的提取，使用阴离子交换技术从牛乳清中对opn进行分离，最终获取的产物中约含有78％的蛋白质，这些蛋白质中近95％为opn。通过该方法获取的opn含有灰分、水分和不到1％的脂肪和乳糖。
5.上述方法获取的opn是目前市面上销售的唯一的opn成品，经质谱和功能研究分析发现，这类成品具有高度磷酸化和糖基化。但在牛乳中opn的含量极低，从1l原料奶中可以提取大约11mg的opn，按照这样的提取量来计算，约90吨牛乳中才能提取1公斤的opn。因此，通过新鲜牛乳提取很难实现opn的大规模市场化，且成本高昂。


技术实现要素：

6.人源蛋白的大量表达，需经过表达后的修饰加工和糖基化，大部分菌种没有类似功能，本发明所要解决的技术问题是成功将骨桥蛋白在毕赤酵母中表达并正确修饰加工，同时能够快速的分泌到细胞外，实现增强骨桥蛋白的高效表达。
7.本发明的第一个目的是提供一种毕赤酵母基因工程菌，所述毕赤酵母基因工程菌基因组上整合有表达盒，所述表达盒包含p
aox1
启动子、α信号肽和骨桥蛋白。
8.在本发明的一种实施方式中，所述p
aox1
启动子的核苷酸序列如seq id no.1所示、α信号肽的氨基酸序列如seq id no.2所示，骨桥蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
9.在本发明的一种实施方式中，所述骨桥蛋白由p
aox1
启动子启动表达。
10.在本发明的一种实施方式中，所述骨桥蛋白的n端连接有α信号肽。
11.在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母以毕赤酵母p.pastoris x33为宿主。
12.在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母基因工程菌以piczαa质粒为表达载体。
13.在本发明的一种实施方式中，所述表达盒整合在毕赤酵母基因组的aox1位点。
14.本发明的第二个目的是提供一种制备骨桥蛋白的方法，所述方法为将上述毕赤酵母基因工程菌接种于培养基中诱导表达骨桥蛋白。
15.在本发明的一种实施方式中，所述方法为将上述毕赤酵母基因工程菌先接种于发酵培养基中发酵培养获得发酵液，再将发酵液接种于诱导培养基进行诱导表达。
16.在本发明的一种实施方式中，所述发酵液的od
600
为80～100。
17.在本发明的一种实施方式，所述发酵培养基为蛋白胨18～22g/l，酵母粉8～12g/l，甘油8～12ml/l，ynb 10～15g/l，生物素4
×
10-4
g/l，磷酸钾缓冲液80～120mm/l。
18.在本发明的一种实施方式中，所述诱导培养基为蛋白胨18～22g/l，酵母粉8～12g/l，甲醇4～7ml/l，ynb 10～15g/l，生物素4
×
10-4
g/l，磷酸钾缓冲液80～120mm/l。
19.在本发明的一种实施方式中，所述诱导培养基中的甲醇终浓度为0.8～1.2％。
20.在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养的条件为28～32℃，200～240rpm。
21.在本发明的一种实施方式中，所述诱导表达的条件为28～32℃，200～240rpm。
22.本发明还提供所述毕赤酵母基因工程菌和所述方法在制备含有骨桥蛋白的产品中的应用。
23.有益效果：
24.本发明在毕赤酵母基因组上aox1位点成功整合骨桥蛋白表达框。通过发酵实验发现，骨桥蛋白能够成功表达并部分分泌至胞外，但发酵后期蛋白分泌迟滞，大部分蛋白进入液泡。通过western blot验证和elisa定量测定，确定骨桥蛋白成功表达，且表达量达到32.2mg/l。
附图说明
25.图1ppiczαa-αfactor-opn载体示例图。
26.图2十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)验证图谱，1-10:实验组发酵液上清液,11:空白对照发酵液上清液,m:蛋白质marker。
27.图3蛋白质印迹(western blot)验证图谱，1-10:实验组发酵液上清液,11:空白对
照发酵液上清液,m:蛋白质marker。
28.图4骨桥蛋白标准曲线。
29.图5样品elisa检测结果。
具体实施方式
30.下述实施例中涉及到的培养基：
31.bmgy培养基：蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，甘油10ml/l，ynb 13.4g/l，生物素4
×
10-4
g/l，磷酸钾缓冲液100mm/l。
32.bmmy培养基为：蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，甲醇5ml/l，ynb 13.4g/l，生物素4
×
10-4
g/l，磷酸钾缓冲液100mm/l。
33.实施例1表达质粒的构建
34.(1)以人工合成的opn基因为模板，利用表1中的引物opn-f和opn-r扩增得到骨桥蛋白，以实验室保藏的质粒ppiczαa为模板，利用表1中的引物aopn-z-f和aopn-z-r扩增得到α-信号肽。将扩增得到骨桥蛋白和α-信号肽连接至用ecorⅰ和notⅰ双酶切的ppiczαa质粒，得到重组质粒ppiczαa-αfactor-opn。质粒图谱如图1所示。
35.pcr体系为：
36.表1 pcr反应体系
[0037][0038][0039]
pcr条件为：
[0040]
表2 pcr扩增条件
[0041][0042]
设计ppiczαa-αfactor-opn重组质粒，质粒图谱和引物序列分别如图1和表3所示。
[0043]
表3 ppiczαa-αfactor-opn引物序列
[0044][0045]
实施例2重组毕赤酵母的构建
[0046]
将实施例1中的重组质粒ppiczαa-αfactor-opn用dra i线性化，取80μl毕赤酵母x33感受态细胞与10μl线性化重组质粒混合均匀，并转移到-20℃条件下冰浴过的0.2cm电转化杯中，并将装有混合液的电转化杯冰浴5min。调整好电转化仪的参数，置于毕赤酵母档，电压1.5千伏，电容25微法，电阻200欧姆，时间约为5毫秒。电击后，迅速向转化杯中加入1ml冰上预冷的1m山梨醇溶液，轻轻吸打混匀，将混合液吸出转移到离心管中。30℃静置培养1-2h，2000g离心5min。弃800μl上清，剩余菌体吹匀，涂布于ypd平板上，30℃培养箱中培养2-4天，直至长出单菌落。
[0047]
实施例3重组毕赤酵母中发酵生产骨桥蛋白
[0048]
从实施例2中ypd平板上挑取单菌落并接种至含有2ml ypd培养基的圆底试管过夜培养，取1ml过夜培养菌液接种至25ml bmgy培养基中进行摇瓶发酵，30℃，220rpm条件下培养至od
600
为90左右，4℃，3500g，离心10min，收集细胞，弃上清，并用无菌水清洗两次，每次清洗后同样条件离心，取上清。用bmmy培养基重悬细胞，在30℃，220rpm条件下进行诱导表达，每24h加甲醇至终浓度1％。经甲醇诱导7d后，离心并收集上清液，通过离心浓缩，使用sds-page和western blot对骨桥蛋白进行定量分析。结果如图2、图3所示，在35kda处出现了opn的目标条带，最高产量达到32.2mg/l。
[0049]
使用人源骨桥蛋白elisa试剂盒，梯度稀释骨桥蛋白的标准品直至浓度分别为0、50、100、200、400、800μg/l，与样品共同检测，最终得到吸光度如表4，并作出回归曲线如图4。
[0050]
表4标准品检测吸光度
[0051]
标准品浓度(μg/l)050100200400800吸光度(od
450
)0.0650.2650.5360.8981.4132.126
[0052]
取8个发酵样品和2个阴性对照各1ml，并梯度稀释100倍，然后对这10个样品进行平行检测，结果如表5和图5。
[0053]
表5发酵样品检测吸光度
[0054][0055]
样品1-8为发酵样品，9-10位阴性对照。
[0056]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。