探针组在检测BIM基因缺失多态性中的应用的制作方法

探针组在检测bim基因缺失多态性中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域。具体地，本发明涉及探针组在检测bim基因缺失多态性中的应用。


背景技术：

2.bim基因是编码细胞凋亡基因bcl2蛋白家族中一员。bim基因缺失是指bim基因外显子3和外显子4之间存在的2903bp的缺失，这种缺失会使得其转录的mrna优先形成含有外显子3的剪切体，而不是正常的含有外显子4的剪切体，最终表达出的bim蛋白亚型缺少bh3结构域，而导致bh3结构域依赖性细胞凋亡受阻，表现为患有慢性骨髓白血病(cml)和表皮生长因子突变的肺癌患者(egfr nsclc)具有酪氨酸激酶抑制剂(tki)耐药性，无法从这类药物中受益。有研究表明，在癌症病人体内，这种删除与药物反应的持续时间相关联，并且能够被用来预测病人在没有疾病恶化时的存活时间，如携带这种删除突变的患者的平均无疾病恶化存活期限大约为6个半月时间，而没有这种突变的患者则为12个月左右。对2597个健康人体进行筛查，发现这种缺失多态性在将近八分之一的东亚个人体内发生，但是在非洲人和欧洲人体内并没有发现，说明bim缺失多态性具有人种差异。因此，业内认为bim缺失的检测对于我国肺癌患者的诊疗，具有相当重要的现实意义。
3.目前，小规模的临床实践和科研中，bim基因突变检测的方法主要包括：电泳、sanger测序、变性高效液相色谱(dhplc)、荧光定量pcr法、基因芯片、液相芯片以及基于pcr的检测试剂盒。
4.sanger测序法由于可以读到dna每个碱基的变化，目前被认为是检测的金标准方法，但因为该方法存在灵敏度低的缺陷，检测异质性较高的临床肿瘤组织样本时假阴性率高，同时，还存在测序步骤繁琐、耗时长，对设备和操作人员要求较高等缺陷，因此，不易形成标准化操作的临床诊断产品。另外，dhplc、基因芯片、液相芯片、pcr扩增等方法也存在操作复杂，对设备要求高等缺陷，因此，目前主要应用场景也局限于科研单位和实验室。
5.在大规模临床肿瘤基因检测时，基于二代测序的sv检测软件缺乏针对性，使用同一类算法检测不同类型的变异，兼容的同时也损失了一定的灵敏度。就目前的检测结果来看，这些软件对bim基因缺失的检出效果并不理想，存在漏检的情况。
6.综上所述，为了临床最终实现治疗肺癌的目标，本领域迫切需要寻求简单易行、快速高效的检测bim基因缺失多态性的方法以及检测试剂盒。


技术实现要素：

7.本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题，为此，本发明提出了探针组、试剂盒、芯片、检测bim基因缺失多态性的方法及应用，利用本发明的探针组对bim基因缺失多态性检测的准确性强，灵敏度高，分析速度快，探针覆盖范围小，成本低，检测流程搭建容易实现，流程化的操作无需额外人工参与，应用前景好。
8.在本发明的一个方面，本发明提出了一种探针组。根据本发明的实施例，所述探针
组包括：第一探针，所述第一探针具有如seq id no：1所示的核苷酸序列或与其具有至少80％同源性的核苷酸序列；第二探针，所述第二探针具有如seq id no：2所示的核苷酸序列或与其具有至少80％同源性的核苷酸序列。
9.根据本发明实施例的探针组可对bim基因第三、第四处显子之间内含子上2903bp缺失突变断点区域进行靶向捕获，断点位置为chr2：111125617，hg38，该断点区域的覆盖率高达100％，高特异性捕获率可达70％～80％，从而可以实现bim基因缺失多态性检测，具体可以检测出缺失突变断点区域是否存在缺失，以及缺失的类型，如纯合型或杂合型。由此，利用本发明的探针组对bim基因缺失多态性检测的准确性强，灵敏度高，分析速度快，探针覆盖范围小，成本低，检测流程搭建容易实现，流程化的操作无需额外人工参与，应用前景好。
10.tcaacaaacccatcagaacagacactggaacaaaatgacatttctaaataccatccagctctgtcttcataggcttcagtgaggtaaatcaggcaggcctttgcccatgttatagaattg(seqidno：1)
11.ctgtcttcataggcttcagtgaggtaaatcaggcaggcctttgcccatgttatagaattggaaagaacctcagagtggtggtcacttgtcagaggttgggcacacctgtgaggtggtggg(seqidno：2)
12.在本发明的另一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前面所述的探针组。由此，利用根据本发明实施例的试剂盒对bim基因缺失多态性检测的准确性强，灵敏度高，分析速度快，探针覆盖范围小，成本低，检测流程搭建容易实现，流程化的操作无需额外人工参与，应用前景好。
13.在本发明的又一方面，本发明提出了一种芯片。根据本发明的实施例，所述芯片上设置有前面所述的探针组。由此，利用根据本发明实施例的芯片对bim基因缺失多态性检测的准确性强，灵敏度高，分析速度快，探针覆盖范围小，成本低，检测流程搭建容易实现，流程化的操作无需额外人工参与，应用前景好。
14.在本发明的又一方面，本发明提出了一种检测bim基因缺失多态性的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：获取测序文库；将测序文库与前面所述探针组、所述试剂盒中的探针组或者所述芯片上设置的探针组进行杂交捕获，得到捕获序列；将所述捕获序列进行测序，得到测序数据；对所述测序数据进行分析，以确定bim基因缺失多态性。由此，根据本发明实施例的方法对bim基因缺失多态性检测的准确性强，灵敏度高，分析速度快，探针覆盖范围小，成本低，检测流程搭建容易实现，流程化的操作无需额外人工参与，应用前景好。
15.需要说明的是，本发明对于获取测序文库的方法不做严格限定，可以采用本领域的常规技术手段，例如包括：提取dna或rna、基因片段化、末端加a或磷酸化等等，具体可以根据实际情况灵活选择。
16.根据本发明的实施例，所述分析包括：基于测序数据，分别获得断点前nbp区域read的平均深度和断点后nbp区域read的平均深度，按照下列公式计算断点深度变化率，断点深度变化率＝(断点前nbp区域read的平均深度-断点后nbp区域read的平均深度)/断点前nbp区域read的平均深度；基于所述断点深度变化率，判断bim基因缺失多态性；其中，当所述断点深度变化率不小于0.9是存在bim基因缺失且为纯化型的指示；当所述断点深度变化率不小于0.1且小于0.9是存在bim基因缺失且为杂合型的指示；当所述断点深度变化率小于0.1是不存在bim基因缺失的指示；所述断点为chr2：111125617，hg38；n选自5～10的整
数。
17.在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述探针组、试剂盒或芯片在检测bim基因缺失多态性中的应用。如前面所述探针组、试剂盒或芯片对bim基因缺失多态性检测的准确性强，灵敏度高，分析速度快，探针覆盖范围小，成本低，检测流程搭建容易实现，流程化的操作无需额外人工参与，应用前景好。具体地，本发明的应用不以疾病的诊断和治疗为目的。
18.在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述探针组在制备试剂盒或芯片中的应用。根据本发明的实施例，所述试剂盒或芯片用于检测bim基因缺失多态性。如前面所述探针组、试剂盒或芯片对bim基因缺失多态性检测的准确性强，灵敏度高，分析速度快，探针覆盖范围小，成本低，检测流程搭建容易实现，流程化的操作无需额外人工参与，应用前景好。具体地，本发明的应用不以疾病的诊断和治疗为目的。
19.根据本发明的实施例，所述试剂盒或芯片用于预测受试者是否具有耐药性或者预测受试者在没有病情恶化时的存活时间。
20.bim基因缺失可以表现为耐药性，尤其是患有慢性骨髓白血病(cml)和表皮生长因子突变的肺癌患者(egfr nsclc)具有酪氨酸激酶抑制剂(tki)耐药性，进而，通过对其进行bim基因缺失多态性检测，可以预测出受试者是否具有耐药性。
21.在癌症病人体内，bim基因缺失与药物反应的持续时间相关联，并且能够被用来预测病人在没有疾病恶化时的存活时间，如携带这种bim基因缺失突变的患者的平均无疾病恶化存活期限大约为6个半月时间，而没有这种突变的患者则为12个月左右。因此，通过对其进行bim基因缺失多态性检测，可以预测出受试者在没有病情恶化时的存活时间。
22.根据本发明的实施例，所述受试者选自患有慢性骨髓白血病或者表皮生长因子突变的肺癌患者。
23.根据本发明的实施例，所述耐药性为酪氨酸激酶抑制剂耐药性。
24.有益效果
25.(1)本发明利用探针，可以有针对性的检测bim基因第三、第四外显子之间内含子上2903bp缺失突变，目标区域覆盖率高达100％，高特异性捕获效率可达70％-80％。
26.(2)本发明的试剂盒所含探针覆盖区域小，仅覆盖一个断点区间就可以满足bim基因缺失多态性检测需求，成本更低。
27.(3)基于二代测序数据，本发明对于bim缺失多态性的检测方法更灵敏，通过缺失断点区间的read变化率来判断缺失情况，首先保障检测到的bim缺失位置绝对准确，而sv软件存在突变缺失检测位置跳跃的情况；其次对于一些低频，支持read比较少的bim缺失也能有较好的检测效果，而sv软件有明显的漏检的情况。
28.(4)同样是基于原始bam文件，本发明可以几乎瞬时获得深度变化率，有针对性的检测bim缺失多态性，检测速度相比sv检测软件更快。
29.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
30.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得
明显和容易理解，其中：
31.图1显示了根据本发明一个实施例的检测bim基因缺失多态性的方法流程示意图；
32.图2显示了根据本发明一个实施例的qc指标箱线图；
33.图3显示了根据本发明一个实施例的roc曲线，其中a为方法a、b为方法b、rc为实施例1。
具体实施方式
34.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
35.实施例1
36.本实施例使用已知的25例bim缺失阳性样本和5例阴性样本，其中纯合缺失1例，杂合缺失24例。
37.使用bim基因缺失多态性检测试剂盒对待测样本进行bim基因缺失多态性检测方法，参考图1，具体步骤为：
38.1)提取待测样本的dna，并使用200bp模式物理打断，构建文库。
39.2)样本文库采用如下设计的探针进行杂交捕获，然后进行测序，获得的测序数据经过常规的拆分、质控和比对，获得原始bam文件。
40.p1：
41.tcaacaaacccatcagaacagacactggaacaaaatgacatttctaaataccatccagctctgtcttcataggcttcagtgaggtaaatcaggcaggcctttgcccatgttatagaattg
42.p2：
43.ctgtcttcataggcttcagtgaggtaaatcaggcaggcctttgcccatgttatagaattggaaagaacctcagagtggtggtcacttgtcagaggttgggcacacctgtgaggtggtggg
44.3)基于步骤2)获得的原始bam文件，使用samtools depth工具，获得断点前后n bp区间的平均深度，定义为depth1、depth2。使用断点1(简称pos1，chr2：111125617，hg38)的深度变化率对bim基因缺失多态性进行判断。
45.depth1：pos1前n bp区域read的平均深度(n＝5，chr2:111125613-111125617)；
46.depth2：pos1后n bp区域read的平均深度(n＝5，chr2:111125618-111125622)；
47.read深度变化率计算公式：ratio＝(depth1-depth2)/depth1。
48.4)bim基因缺失多态性的判断
49.前期调研时，通过igv软件观察到阳性样本断点前后区间read存在显著的深度变化，体现在数据上可以表示为read深度变化率。根据调研和测试结果，定义不同变化率(ratio)对应不同的缺失类型。ratio≥0.9，存在bim缺失，并且为纯合型；0.1≤ratio《0.9，存在缺失，并且为杂合型；ratio《0.1，不存在缺失。
50.经统计，可达到100％目标区域覆盖以及平均70％-80％的高特异性捕获效果(图2)。
51.实施例2
52.将实施例1的步骤2)获得的原始bam文件使用结构变异常用检测方法a(采用lumpy软件分析)和方法b(采用delly软件分析)默认参数对bim缺失进行检测，结果如表1、表2和图3所示。
53.表1：检测结果汇总表
[0054][0055][0056]
注：0表示未检出，1表示检出。
[0057]
表2：方法a和b的检出效果x2检验
[0058][0059]
本发明的检测方法检测出25例bim缺失，其中包含1例纯合缺失，检出率100％。
[0060]
方法a检出21例缺失，检出率84％，4例未检出的样本，核查其vcf结果，发现bim 2903bp的缺失起点出现不同程度偏差，导致未识别其检出，且方法a不能区分缺失类型；方法b检出例缺失9例，检出率仅为36％；用chisq.test进行卡方检验，得到p值等于0.00097，方法a和方法b检出率不理想，存在明显漏检。
[0061]
综上，基于二代测序数据，相比于sv检测软件，本方法能够快速，高效的对bim缺失多态性进行检测。
[0062]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0063]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。