用于预防哮喘的包含2
’‑
岩藻糖基乳糖的组合物
技术领域
1.本文披露的发明涉及包含2
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岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)的组合物，该组合物用于预防人类受试者的哮喘。
背景技术：
2.哮喘通常被描述为过敏性疾病，其中过敏原(如花粉或螨)或某些工作场所暴露可能触发气道狭窄发作，并通过持续暴露导致气道炎症和气道反应性增强。然而，这种关联主要来自西方高收入国家的观察结果，而在中低收入国家过敏和哮喘之间的关联则弱得多。哮喘的某些职业原因似乎不涉及过敏。现在，人们普遍认识到，过敏机制仅与一半或更少的哮喘患者有相关性。在许多人中，哮喘可能涉及气道的非过敏性炎症，然而我们对所涉及的机制并不十分了解。
3.如本文所用，哮喘定义为“异质性疾病”，通常以慢性气道炎症为特征(根据全球哮喘防治倡议(global initiative for asthma，gina))。其定义依据为随时间变化且严重程度不同的诸如喘鸣、气短、胸闷和咳嗽等呼吸道症状，并伴有可变呼气气流受限。哮喘症状最常首次发生在儿童早期。哮喘是一种常见的慢性疾病，据估计影响全世界多达3.39亿人。在世界各地所有年龄段的人中，这是造成包括过早死亡和生活质量下降在内的重大疾病负担的一个原因。
4.治疗哮喘有两种主要方法：(i)通过放松气道平滑肌来逆转气道狭窄的支气管扩张剂(最常见的是β2-激动剂)，以及(ii)治疗潜在气道炎症的皮质类固醇(globalasthmareport.org)。因为哮喘通常以慢性气道炎症为特征，所以哮喘的治疗也具有持续时间长的特征。
5.thorburn等人已经证明，给小鼠喂高纤维饮食会使其产生独特的肠道菌群，从而使包括乙酸在内的短链脂肪酸的含量增加。对小鼠的高纤维或乙酸喂养可使其过敏性气道疾病(aad，一种人类哮喘模型)得到显著抑制。对妊娠小鼠的高纤维/乙酸喂养可使其成年后代无法发展明显的aad。他们的研究结果为高纤维饮食和乙酸的生成在防止后代发展气道疾病方面的作用提供了证据。在人体内也观察到了母体乙酸水平等于或高于小鼠中位值的影响。研究表明，人的哮喘与母体饮食有相关性，并且妊娠晚期通过对母亲施用高水平膳食纤维可以减少哮喘症状。这种饮食与血清中的高乙酸水平相关，并且与前12个月需要两次或两次以上全科医生(gp)诊视咳嗽或喘鸣的婴儿百分比下降有关(thorburn等人2015nature communications[自然通讯]6:7320|doi:10.1038/ncomms8320)。
[0006]
因此，需要治疗性和非治疗性方法来预防或至少减少哮喘症状。考虑到成本和健康舒适性两者，还希望减少或最少化使用哮喘治疗的需要。
[0007]
此外，期望这种治疗与正常和/或健康饮食可以共同进行。优选对(食物的)味道和/或口感没有负面影响。其他期望的特性或效果包括但不限于保持受试者的其他一般健康体征(例如保持正常血压、保持健康排便、正常排便等)、易于实施、易于准备、增加微生物群的多样性以及所使用的化合物、组合和/或组合物的商业可用性。
[0008]
另外还期望提供用于在哮喘的非治疗性治疗中使用的组合物。优选地，治疗或预防哮喘不需要幼儿使用药物。
[0009]
本发明的目的是提供能够更好地解决至少一种上述预期的组合物。
技术实现要素：
[0010]
在一方面中，本发明提供一种组合物，其包含2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)，用于在人类受试者中通过在受试者于母体内孕育期间向母亲施用该组合物来预防哮喘。
[0011]
在另一方面中，本发明提供一种在人类受试者中预防哮喘的方法，该方法包括在受试者于母体内孕育期间向受试者的母亲施用包含2’fl的组合物的步骤。该方法可以是治疗性的或非治疗性的。
[0012]
在另一方面中，本发明涉及包含2’fl的组合物在人类受试者中预防哮喘的用途，其特征在于：在受试者于母体内孕育期间，向该受试者的母亲施用该组合物。
[0013]
本文所述的本发明基于以下发现：可优选地经口施用人类受试者特定膳食纤维，即2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
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fl)，以实现至少一种上述期望。特别地，发现包含2
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fl的组合物显著增加了人类受试者结肠远端的乙酸水平。因此，本发明涉及一种组合物，其包含2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)，用于在人类受试者中通过在受试者于母体内孕育期间向母亲施用该组合物来治疗或预防哮喘。
具体实施方式
[0014]
关于给定疾病或病症的术语“治疗”包括但不限于抑制疾病或病症，例如阻止疾病或病症发展；缓解疾病或病症，例如引起疾病或病症消退；或缓解由疾病或病症导致或由疾病或病症引起的状况，例如缓解、预防或治疗疾病或病症的症状。
[0015]
与给定疾病或病症相关的术语“预防”是指：当尚未发生该疾病或病症时，预防其发生；在可能尚未被诊断为患有该疾病或病症的受试者中预防发生该疾病或病症；和/或当该疾病或病症已经存在时，预防疾病/病症的进一步发展。
[0016]
如本文所用，“哮喘的预防”或“预防哮喘”定义为改善出生后患哮喘的风险。例如，幼儿患哮喘的程度可通过在孩子出生后前12个月到24个月内咳嗽和/或喘鸣的全科医生(gp)诊视次数进行衡量。
[0017]2’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)是一种低聚糖，更确切地说，是由l-岩藻糖、d-半乳糖和d-葡萄糖单元组成的岩藻糖基化中性三糖(连接的fuc(α1-2)gal(β1-4)glc)；cas nr 41263-94-9。它是人类母乳中自然存在的最常见的人乳低聚糖(hmo)，约占所有hmo的30％——至少在所谓的分泌型母亲(即fut2阳性)中是这样。hmo是不可消化的碳水化合物，并且是人乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大组分。目前已在人乳中鉴定出200多种不同的寡糖。临床试验表明，2
’‑
fl在保护和促进新生婴儿的健康，特别是在免疫系统方面起着关键作用。研究表明，在婴儿配方制品中添加2
’‑
fl是安全且耐受性良好的。此外，对于所有其他年龄段的人(尤其是成年人)，2
’‑
fl是安全且耐受性良好的。
[0018]
可以使用本领域技术人员已知的方法获得hmo。例如，hmo可以从人乳中纯化获得。可使用本领域已知的方法进一步分离单个hmo，例如使用毛细管电泳、hplc(例如，具有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱；hpaec-pad)和薄层色谱法。参见，例如，美国专利申请号
2009/0098240。可替代地，可以使用酶促方法合成hmo。生产hmo的另一方法是通过工程细菌中的生物合成。例如，wo 2012/112777披露了制备2
’‑
fl的方法。可替代地，2
’‑
fl可商购获得，例如，可商购自皇家菲仕兰公司(frieslandcampina)或其他公司。
[0019]
如本文所用，化合物(例如2’fl)在组合物中的量，以“每天食用的克(或毫克)数”表示，是指该化合物在组合物中的量应使得当向受试者施用推荐的每日份(即每日剂量)时将向受试者施用该克数的化合物。因此，如果推荐的每日剂量为100克组合物，分为2份，则一个单份包含50克组合物；每日份包括2份这样的单份。
[0020]
如本文所用，膳食纤维是指既不被人体消化也不被人体吸收，但会被肠道微生物利用的碳水化合物。它们可从植物中分离出来或由糖类合成，并且包含至少3个单糖单元(即聚合度dp≥3)。它们在胃肠道中的发酵影响细菌群落的组成以及微生物代谢活性，包括在宿主肠道中生成发酵终产物。一些膳食纤维也可以归类为益生元。益生元定义为促进宿主肠道中有益微生物生长的不可消化的食物成分。益生元的摄入可使胃肠道微生物群的组成和/或活性发生特定变化，从而使宿主健康受益。
[0021]
益生元膳食纤维来源可选自由β葡聚糖、fos(包括菊粉)、gos、异麦芽低聚糖、瓜尔胶、乳果糖、抗性淀粉(rs)、麦芽糊精、低聚木糖和阿拉伯低聚糖组成的组中的一种或多种。优选地，益生元膳食纤维选自由fos和gos组成的组中的一种或多种。益生元膳食纤维据称具有多种健康效应，例如对肠道微细菌的效应、可对宿主产生许多积极影响的代谢产物(如短链脂肪酸(scfa))、对矿物质吸收的效应、对蛋白质发酵的效应、细菌致病种群的变化、对过敏风险的效应、对肠道屏障通透性的效应以及对免疫系统防御的效应。例如，参见calson等人的health effects and sources of prebiotic dietary fiber[益生元膳食纤维的健康影响和来源],2018,curr dev nutr[营养学最新进展]2018；2:nzy005doi:https://doi.org/10.1093/cdn/nzy005.
[0022]
低聚果糖(fos)，有时也称为果聚糖(oligofructose)或寡果聚糖(oligofructan)，是低聚糖果聚糖类。它们可使用本领域已知的方法通过菊粉降解或转果糖作用方法获得。fos可通过降解菊粉或聚果糖(一种通过β(2
→
1)键与末端α(1
→
2)连接的d-葡萄糖连接的d-果糖残基聚合物)产生。菊粉的聚合度范围为10至60。菊粉可以酶法或化学法降解为具有一般结构glu-frun(缩写为gfn)的低聚糖，其中n的范围为1至7。第二类fos通过曲霉(例如黑曲霉)的β-果糖苷酶对蔗糖的转果糖作用制备。所得混合物的通式为gfm，其中m的范围为1至5。
[0023]
还必须注意，如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“该(the)”包括复数个对象，除非上下文另外明确指出。例如，以单数形式提及的组分旨在包含多种组分。
[0024]
应当理解，在本披露内容中，除非另有说明，否则对重量、重量比等的任何提及均指的是干物质，特别是组合物的干物质。
[0025]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语一般具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
[0026]
在一第一方面中，本发明提供一种组合物，其包含2
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岩藻糖基乳糖(2
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fl)，用于在人类受试者中通过在受试者于母体内孕育期间向母亲施用该组合物来预防哮喘。到目前为止，尚不清楚母亲使用2’fl对胎儿健康的影响情况。
[0027]
在另一方面中，本发明涉及一种在人类受试者中预防哮喘的方法，该方法包括在受试者于母体内孕育期间向受试者的母亲施用包含2’fl的组合物的步骤。
[0028]
在又一方面中，本发明涉及包含2’fl的组合物在人类受试者中预防哮喘的用途，其特征在于：在受试者于母体内孕育期间，向该受试者的母亲施用该组合物。该组合物在本发明此方面中的用途可为治疗性的和/或非治疗性的。优选地，在本发明的各个方面和实施例中的用途是非治疗性的。
[0029]
在本发明的任一方面的一实施例中，如本发明的各个方面和实施例中所述的人类受试者可以具有任何年龄，例如婴儿(0-12个月)、幼儿(1-3岁)、学龄前儿童(3-5岁)、小学生(5-12岁)、青少年(12-18岁)、年轻成人(18-21岁)或成人(》21岁)。因为在一实施例中难以向幼儿施用哮喘药物，所以受试者优选为婴儿、幼儿或学龄前儿童，更优选为婴儿或幼儿，最优选为婴儿。可替代地，因为哮喘具有慢性特征，患有哮喘的受试者必须用药多年，所以在另一个实施例中，受试者为青少年或年轻成人。在另一实施例中，受试者为成人。
[0030]
优选地，如在本发明的各个方面和/或实施例中所提及的母亲不患有哮喘，因为有人提出，如果母亲不患有哮喘，则母亲的乙酸水平在孩子出生后第一年对孩子的哮喘水平具有更大的影响(thorburn等人2015nature communications[自然通讯]6:7320|doi:10.1038/ncomms8320)。
[0031]
包含2’fl的组合物可在整个妊娠期间向母亲施用。可替代地，在一实施例中，该组合物可在妊娠的前3个月期间、优选地在妊娠的前6个月期间向母亲施用。在又一实施例中，包含2’fl的组合物在妊娠的最后2个月期间、优选在妊娠的最后3个月期间、更优选在妊娠的最后6个月期间、甚至更优选在妊娠的最后8个月期间向母亲施用。最优选地，包含2’fl的组合物在妊娠的第2个半期期间向母亲施用。妊娠年龄，也称为胎龄，从怀孕女性最后一个月经期开始算起。医学专业人员认为人类的正常妊娠持续时间为40周。
[0032]
对大多数人而言，存在一个每天可摄入膳食纤维的最大数量，超过此数量，就开始出现胃肠道不适。可通过逐渐增加膳食纤维的每日食用量并监测是否出现不良反应来确定每天可消耗的最大膳食纤维量，例如，可从每天1克2’fl开始，每周增加3克。对于2’fl，20g的每日剂量已被测试为安全用量。本发明中使用的组合物中2
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fl的量也取决于受试者的体重(即质量)；据认为，体重较重的人可耐受更多的膳食纤维。因此，在一实施例中，本发明中使用的组合物中每日份的2
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fl的量大于0.01克，优选大于0.1克。在另一实施例中，每日份的2’fl的量为0.01至30克/每日份，优选为0.1至30克/每日份，更优选为0.5至25克/每日份，甚至更优选为1到20克/每日份，最优选为1至10克/每日份。在再一个实施例中，2’fl的量为0.01至1.0克/每日份。
[0033]
在另一实施例中，本发明所用组合物中2’fl的量相对于该组合物的总干重为至少0.1wt.％，例如至少0.5wt.％，或至少1wt.％。在一实施例中，该量相对于组合物的总干重为至少5wt.％，优选至少10wt.％，更优选至少15wt.％，甚至更优选至少20wt.％，特别优选至少30wt.％，最优选至少40wt.％。
[0034]
如本文所用，术语“gos”表示低聚半乳糖(gos)，其通常包括半乳糖单元链和还原端处的葡萄糖单元。gos是由β-半乳糖苷酶(酶类ec.3.2.1.23)催化的连续反式半乳糖基化反应产生的。β-半乳糖苷酶可在例如环状芽孢杆菌(bacillus circulans)、米曲霉(aspergillus oryzae)、马克思克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、脆弱克鲁维酵母
(kluyveromyces fragilis)、单链孢霉(sporobolomyces singularis)和发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)等多种微生物中产生。β-半乳糖苷酶的三维结构不同，导致在反式半乳糖基化反应期间形成的糖苷键具有立体选择性和区域选择性。例如，通常来源于曲霉的真菌β-半乳糖苷酶主要产生β1-6键(因此得到主要包含β1-6键的gos制剂，可称为“6
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gos”)，而来源于芽孢杆菌的细菌β-半乳糖苷酶主要产生β1-4键(得到主要包含β1-4键的gos制剂，也可称为“4
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gos”)。此外，环状芽孢杆菌(b.circulans)产生的β-半乳糖苷酶具有特别强的反式半乳糖基化活性，常用于合成gos。最近，如ep 3399032和wo 2019/002304中所述，在gos合成中使用了源于土生隐球菌(cryptococcus terrestris，最近更名为土生蝶孢银耳(papiliotrema terrestris))的β-半乳糖苷酶。因此，gos在本领域中为人们所熟知。
[0035]
某些gos成分在母乳和初乳中天然存在。典型的gos制剂主要包括二糖至六糖，但也可能出现较大的低聚糖。
[0036]
已经报道了gos的各种生理功能，包括刺激肠道中双歧杆菌生长、支持正常肠道转运、促进自然防御和增强矿物质吸收的能力。gos因其促进双歧杆菌、乳杆菌和其他肠道细菌生长的益生元效应而受到了特别关注。因此，gos通常用于婴儿配方食品、乳杆菌发酵饮料和酸奶中。某些含gos的食品经日本消费者事务管理局认证为“特定健康用途食品”，而gos被美国食品和药物管理局认证为公认安全(gras)物质(gras公告：grn 233、236、285、286、334、484、489、495、518和569)。
[0037]
优选地，gos的聚合度(dp)在2至10的范围内，更优选在3至8的范围内。合适的gos制剂商购获得，例如可从frieslandcampina nederland b.v.购得的gos。在这方面，应注意的是，gos制剂(例如gos)除含低聚半乳糖外，还可能含有乳糖和/或单糖。关于本发明，本技术中提及的gos的量涉及制剂中的实际gos含量，即，低聚半乳糖的实际量，其中既不包括乳糖也不包括单糖(如果存在)。
[0038]
已经知道，结肠中不同益生元膳食纤维的发酵速度和位置取决于纤维的类型。例如，已知低聚半乳糖(gos)在到达盲肠至结肠处和结肠近端后迅速发酵。gos发酵产生的大量乙酸转化为其他代谢物。gos发酵不会导致远端结肠中乙酸水平(即乙酸浓度)升高(canfora等人gastroenterology[胃肠病学],2017,第153卷,第1期,第87-97页)。
[0039]
不希望受到任何特定理论的约束，本发明人认为，当将包括gos和2
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fl在内的膳食纤维混合物施用至受试者时，结肠微生物群首先使gos发酵充当能量源。因此，据信(更多的)2
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fl可到达远端结肠，在那里由产生乙酸的其他肠道微生物发酵。然后，远端结肠中的乙酸生成可能导致其对代谢产生影响。例如，乙酸可能在局部发挥有益作用和/或可能进入体循环。当2’fl与其他膳食纤维(例如益生元膳食纤维，如低聚果糖(fos)、菊粉、低聚木糖(xos)或抗性淀粉)结合时，可能会产生类似作用。
[0040]
如本文所用，“远端结肠”指降结肠(结肠左侧)和乙状结肠(连接直肠的结肠s形节段)。
[0041]
因此，在另一个实施例中，本发明使用的组合物进一步包含一种或多种膳食纤维，优选其中所述膳食纤维为益生元膳食纤维。在又一实施例中，其进一步包含一种或多种益生元膳食纤维，其中所述益生元膳食纤维选自一或多个由gos、fos、菊粉和抗性淀粉组成且优选由gos、fos和菊粉组成的组，特别其进一步包含由fos、菊粉和抗性淀粉组成的组。特别
优选地，本发明所用组合物进一步包含低聚半乳糖(gos)。换句话说，在一些实施例中，本发明中使用的组合物包含2
’‑
fl和gos作为膳食纤维。
[0042]
在一实施例中，在与本发明相关的2
’‑
fl和益生元膳食纤维的组合中，2
’‑
fl与膳食纤维之间的重量比在0.5:10至10:0.5的范围内。优选地，与该组合物的总干重相比，该组合物包含至少5wt.％的2
’‑
fl和至少5wt.％的膳食纤维，更优选地，该组合物包含至少10wt.％的2’fl和至少10wt.％的膳食纤维，甚至更优选地，该组合物包含至少20wt.％的2’fl和至少20wt.％的膳食纤维。
[0043]
与本发明相关的2
’‑
fl和gos的组合可提供更好的结果，因为其可使更多的2
’‑
fl到达结肠的远端部分。在一实施例中，该组合物中2
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fl与gos之间的重量比在0.5:10至10:0.5的范围内。
[0044]
与本发明相关的2
’‑
fl和fos的组合可提供更好的结果，因为其可使更多的2
’‑
fl到达结肠的远端部分。在一实施例中，该组合物中2
’‑
fl与fos之间的重量比在0.5:10至10:0.5的范围内。在另一实施例中，该组合物中2
’‑
fl与菊粉之间的重量比在0.5:10至10:0.5的范围内。
[0045]
在本发明的组合物中，gos和fos(包括菊粉)可以以1:9至9:1的比例存在。
[0046]
在一实施例中，包含2
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fl和膳食纤维的组合物可为组合部分，其中2
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fl和膳食纤维未混合在单一组合物中，即2
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fl和膳食纤维包含在两种单独的组合物中，当与任选的其他组分一起使用时，这些单独的组合物可生成本发明组合物。如本领域技术人员将理解的，本发明的益处可通过顺续或同时施用2
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fl和膳食纤维获得。此类治疗用途和方法也在本发明的范围内。优选地，2
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fl和膳食纤维同时施用。当顺续施用2
’‑
fl和膳食纤维时，施用第一化合物与第二化合物之间的时间小于1小时，优选小于45分钟，更优选小于30分钟，更优选小于20分钟，更优选小于15分钟，更优选小于10分钟，更优选小于5分钟，最优选小于1分钟。
[0047]
可以理解，当2
’‑
fl和膳食纤维顺序施用时，通常是首先施用两种组分中任意一种。因此，在一适宜实施例中，首先施用膳食纤维gos，然后施用2
’‑
fl，而在另一适宜实施例中，首先施用2
’‑
fl，然后施用膳食纤维。
[0048]
如本文前面已经指出的，本发明在于发现向受试者(口服)施用2
’‑
fl或2
’‑
fl和膳食纤维(优选gos)可导致结肠远端部分中乙酸水平的增加。怀孕的母亲体内乙酸水平的这种升高被认为有益于预防儿童哮喘。
[0049]
在一实施例中，当本发明组合物包含2
’‑
fl和膳食纤维时，与该组合物的总干重相比，这些优选以至少0.1wt.％的2
’‑
fl和1wt.％的膳食纤维的量存在。在一实施例中，与该组合物的总干重相比，该组合物包含至少0.01wt.％的2
’‑
fl和至少5wt.％的膳食纤维。在一实施例中，与该组合物的总干重相比，该组合物包含至少0.1wt.％的2
’‑
fl和至少5wt.％的膳食纤维。在另一实施例中，与该组合物的总干重相比，其包含至少5wt.％的2
’‑
fl和5wt.％的膳食纤维。在又一实施例中，与该组合物的总干重相比，2
’‑
fl以至少至少0.01wt.％、至少01.wt％、至少1wt.％、10wt.％、至少20wt.％、至少30wt.％、至少40wt.％、至少50wt.％、至少60wt.％、至少70wt.％、至少80wt.％、至少90wt.％，例如至多91wt.％、92wt.％、93wt.％或94wt.％的量存在。
[0050]
在再一实施例中，当本发明组合物包含2
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fl和gos时，与该组合物的总干重相比，
这些优选以至少0.1wt.％的2
’‑
fl和1wt.％的gos的量存在。在另一实施例中，与该组合物的总干重相比，其包含至少5wt.％的2
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fl和5wt.％的gos。在又一实施例中，与该组合物的总干重相比，2
’‑
fl以至少10wt.％、至少20wt.％、至少30wt.％、至少40wt.％、至少50wt.％、至少60wt.％、至少70wt.％、至少80wt.％、至少90wt.％，例如至多91wt.％、92wt.％、93wt.％或94wt.％的量存在。在另一实施例中，与该组合物的总干重相比，gos以至少10wt.％、至少20wt.％、至少30wt.％、至少40wt.％、至少50wt.％、至少60wt.％、至少70wt.％、至少80wt.％、至少90wt.％，例如至多91wt.％、92wt.％、93wt.％或94wt.％的量存在。
[0051]
在一实施例中，2
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fl和gos以在0.5:10至10:0.5范围内的重量比提供、优选以在1:8至8:1范围内的重量比提供、更优选以在2:6至6:2范围内的重量比提供、最优选以在3:5至5:3范围内的重量比提供。在一替代实施例中，在根据本发明使用的组合物中，2
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fl和gos以约1:1的重量比提供；或者甚至以1:1的重量比提供。
[0052]
在另一实施例中，本发明使用的组合物包含2
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fl和膳食纤维，其中i.2
’‑
fl的量大于0.01克及ii)2
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fl和膳食纤维的总量小于30克，优选小于25克，更优选小于20克，最优选小于15克。在另一实施例中，本发明使用的组合物包含2
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fl和膳食纤维，其中i.2
’‑
fl的量大于0.1克及ii)2
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fl和膳食纤维的总量小于30克，优选小于25克，更优选小于20克，最优选小于15克。在又一实施例中，本发明使用的组合物包含2
’‑
fl及膳食纤维，其中2
’‑
fl的量介于0.1和8克/每日份之间，并且膳食纤维的量介于1和6克/每日份之间。
[0053]
在一特定实施例中，本发明使用的组合物包含2
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fl和gos，其中i.2
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fl的量大于0.01克及ii)2
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fl和gos的总量小于30克，优选小于25克，更优选小于20克，最优选小于15克。在另一实施例中，本发明使用的组合物包含2
’‑
fl和gos，其中i.2
’‑
fl的量大于0.1克及ii)2
’‑
fl和gos的总量小于30克，优选小于25克，更优选小于20克，最优选小于15克。在又一实施例中，本发明使用的组合物包含2
’‑
fl及gos，其中2
’‑
fl的量介于0.1和8克/每日份之间，并且gos的量介于1和6克/每日份之间。
[0054]
根据本发明使用的组合物为一食品，优选地，选自由下列组成的组：乳制品，如奶制品、奶昔、巧克力牛奶、酸奶、奶油、奶酪、布丁、冰淇淋等；棒(bar)，如营养棒、能量棒、零食棒(snack bar)、谷物棒、针对糖尿病的棒等；液体产品，如营养饮料、低糖饮料、液体代餐(liquid meal replacer)、运动饮料和其他强化饮料；美味小吃(savory snack)，如薯片、玉米饼、膨化和烘烤的小吃、饼干、咸脆饼干；美味饼干(savory biscuit)，焙烤食品，如松饼、蛋糕、饼干；意式面食，如意大利式细面条；以及食品补充剂，如丸剂、胶囊剂或干粉。食品补充剂可以随时食用，或者可能需要溶解在液体(如水)中。干粉形式的产品可以与如汤匙之类的装置一起使用，以测量所需量的粉末(例如每日或单位剂量)。食物补充剂可进一步包含食物补充剂中常用的其他成分，如维生素、矿物质、盐等。所述食品优选地选自由乳制品、液体产品和食品补充剂组成的组。可替代地，该组合物为食品补充剂，如丸剂或粉剂，优选为丸剂。食品最好附有说明，说明每天应食用多少产品。
[0055]
如本文定义的组合物或如本文定义的食品可以在罐、瓶、小袋、纸箱、包装纸等中提供。
[0056]
通常，治疗需要以单位剂量形式施用2
’‑
fl和任选的不可消化低聚糖(在一实施例中为gos)。在一实施例中，治疗需要以单位剂量形式施用根据本发明的组合物。在一优选实
施例中，该组合物以单份的形式提供，任选地，每一单份为单独包装，并且每一份包含单位剂量的2
’‑
fl和任选的膳食纤维。可替代地，根据本发明使用的组合物存在于包含多个单份的容器中，如5个、7个、10个、30个、50个、100个、200个、300个、365个单份。此类容器优选随附说明书，注明代表单份或每日份的该组合物的量。在再一实施例中，包含本发明组合物的容器包含至少7个、如至少14个或至少31个单份。优选地，该膳食纤维选自一或多个由gos、fos、菊粉和抗性淀粉组成的组，更优选地选自一或多个由gos、fos和菊粉组成的组。最优选地，膳食纤维为gos。
[0057]
在一实施例中，2
’‑
fl的单位剂量为至少0.01克，优选地，至少0.1克、1克、如至少1.5克、至少2克、至少2.5克、至少3克、至少3.5克或至少4克。
[0058]
在另一实施例中，2
’‑
fl的单位剂量为至多30克，如至多25克，如至多20克、至多15克、至多12.5克、至多10克、至多9克、至多8克、至多7克、至多6克或至多5克。
[0059]
在一实施例中，膳食纤维的单位剂量为0.5至10克，并且2
’‑
fl的单位剂量为3至8克，优选为4至8克，更优选为5至8克2
’‑
fl。在另一实施例中，膳食纤维的单位剂量为2至8克，并且2
’‑
fl的单位剂量为0.5至10克，优选为1至7克，更优选为2至4克2
’‑
fl。在再一实施例中，膳食纤维的单位剂量为至少1克，至少1.5克、至少2克、至少2.5克、至少3克、至少3.5克、或至少4克。在另一实施例中，膳食纤维的单位剂量为最多25克，最多20克、最多15克、最多12.5克、最多10克、最多9克、最多8克、最多7克、最多6克或最多5克。在一实施例中，gos的单位剂量为0.5至10克，更具体而言为2至8克。优选地，该膳食纤维选自一或多个由gos、fos、菊粉和抗性淀粉组成的组，更优选地选自一或多个由gos、fos和菊粉组成的组。最优选地，膳食纤维为gos。
[0060]
本发明组合物(如2
’‑
fl和任选的gos)的单位剂量优选至少每周施用一次，优选至少每3天施用一次，更优选至少每隔一天施用一次，最优选至少每天施用一次。在本发明一实施例中，治疗包括每日施用单位剂量的本发明组合物。据认为，每日施用本发明组合物可使远端结肠中更连续地产生乙酸，这增加了对未出生儿童的健康影响。
[0061]
根据本发明，本文之前定义的治疗优选持续至少2周的时间段，例如至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月或甚至至少6个月。
[0062]
在一实施例中，将本发明的组合以0.1至20克/天范围内的量，优选为1至15克/天范围内的量施用至受试者。
[0063]
在本发明另一实施例中，治疗包括施用平均量为0.01至32克/天的2
’‑
fl，在另一实施例中该治疗包括施用平均量为0.1至32克/天的2’fl，优选平均量为1至24克/天，更优选平均量为2至16克/天，例如约5或12克/天；及任选地，施用平均量为2至24克/天的gos，该平均量优选为3至16克/天，更优选为4至12克/天，例如约7.5克/天，时间段为至少2周、优选至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月或至少6个月。在再一实施例中，该治疗包括每日施用包含0.01至5克的2’fl和任选2至24克的膳食纤维的组合物。优选地，该膳食纤维选自一或多个由gos、fos、菊粉和抗性淀粉组成的组，更优选地选自一或多个由gos、fos和菊粉组成的组。最优选地，膳食纤维为gos。
[0064]
人乳低聚糖(hmo)是人乳的关键成分。它们是结构上和生物学上不同的一组复杂的难消化的碳水化合物。迄今为止，已鉴定出超过200种不同的低聚糖，其大小从3至22个单糖单元不等。最常见的hmo是岩藻糖基化和非岩藻糖基化的中性低聚糖。这些hmo的数量和
结构在女性之间显著不同，并且取决于分泌腺和lewis血型状况(l.bode,j.nutr.[营养学杂志]136:2127-2130,2006)。2’fl是hmo。在一实施例中，如在本发明的方面中使用的组合物包含一种或多种除2’fl之外的hmo。人乳的hmo由各种单糖(即葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、n-乙酰葡糖胺)和唾液酸(n-乙酰神经氨酸)组成。岩藻糖是一种不寻常的分子，因为它具有l-构型，而体内的其他糖分子具有d-构型。hmo的结构是乳糖单元，其可以被一个或多个半乳糖和/或n-乙酰葡糖胺残基延长(核心结构)。hmo核心结构可以被一个或多个岩藻糖残基修饰(即岩藻糖基化的hmo)以及被一个或多个唾液酸单元修饰(即，唾液酸化的hmo)。hmo也可以被岩藻糖基化和唾液酸化。在一实施例中，本发明组合物中的hmo选自一或多个由下列组成的组：核心hmo、唾液酸化的hmo和岩藻糖基化的hmo。已从人乳中鉴定出近200种hmo。已发现岩藻糖基化的hmo是最主要的成分(约77％)，而唾液酸化的hmo占hmo总丰度的约16％。岩藻糖基化的hmo为中性分子，而唾液酸化的hmo为酸性分子。优选hmo为3
’‑
唾液乳糖(3’sl)；6
’‑
唾液乳糖(6’sl)；3-岩藻糖基乳糖(3-fl)；乳糖-n-四糖(lnt)、乳糖-n-新四糖(lnnt)和二唾液酸乳糖-n-四糖(dslnt)。可以使用本领域技术人员已知的方法获得hmo。例如，可以使用本领域已知的方法(如毛细管电泳、hplc(例如，配有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱；hpaec-pad)和薄层色谱)从人乳中纯化得到hmo，或者可商业购得hmo。
[0065]
在一实施例中，出于非医学原因实施本发明的非治疗方法。本发明的非治疗方法通常将依赖于相同组合、组合物和产品以及如本文所定义的相同施用途径和相同剂量方案(例如对于使用的组合物)的使用。
[0066]
在另一方面中，本发明涉及一种在人类受试者中预防哮喘的方法，该方法包括在受试者于母体内孕育期间向受试者的母亲施用包含2’fl的组合物(即，一种上述本文中所定义的组合物)的步骤。优选地，该方法为非治疗性方法。
[0067]
在又一方面中，本发明涉及包含2’fl和任选gos的组合物(即，一种上述本文中所定义的组合物)在人类受试者中预防哮喘的用途，其特征在于：在受试者于母体内孕育期间，向该受试者的母亲施用该组合物。该组合物在本发明此方面中的用途可为治疗性的和/或非治疗性的。优选地，该用途为非治疗性用途。
[0068]
在另一方面中，本发明涉及2’fl和任选的gos(即，如上述本文所定义的组合物)在制备用于在人类受试者中预防哮喘的药物中的用途，其特征在于：在受试者于母体内孕育期间，向该受试者的母亲施用该组合物。
[0069]
在本发明一特定实施例中，该使用的组合物对单独包装单份的形式呈现。如本文所用，术语“单份(single serving)”是指一定量和/或大小的产品，其足以作为单个部分供单人食用。此类产品可以是即食型或即用型的形式，或者可以是需要进一步处理(如加热或添加一定量的热水或冷水)的形式。在一实施例中，本发明组合物以单独包装的单份的形式呈现，其中每份包含如本文别处定义的单位剂量，优选每份包含0.1至8克、优选0.5至8克、更优选1至4克的2
’‑
fl，并且包含0.5至8克、优选1至4克的gos。
[0070]
本发明中使用的组合物的优选产品形式为可食用棒，例如营养棒、能量棒、饮食棒或食物补充棒、零食棒等，其实例为本领域技术人员所熟知。在一实施例中，可食用棒可以是包含谷物混合物和结合糖浆的谷物组合物。结合糖浆可包括例如葡萄糖浆、砂糖、甘油、水、乳化剂、脂肪和调味剂。本发明的膳食纤维组合物可适当地掺入结合糖浆中。本领域技术人员熟知这类产品，例如案号为wo 2017/078519的国际专利公开案中的产品。
[0071]
在本发明一实施例中，本发明中使用的组合物不包含抗性淀粉。
[0072]
通常优选在所述的数值限度内实施。另外，除非明确说明与此相反，否则：百分比、“份数”和比率值按重量计；适合于或优选用于与本发明有关的给定目的的材料的组或类的描述意味着该组或类的任何两个或更多个组成部分的混合物可以同样地是适合的或优选的；化学术语中成分的描述是指添加到说明书中指定的任何组合时的成分，并且不一定排除一旦混合后混合物的成分之间的化学相互作用；首字母缩写词或其他缩写词的第一个限定适用于相同缩写的本文所有的后续使用，并且将必要的修改应用于最初限定的缩写的正常语法变化；并且，除非明确说明与此相反，否则特性的测量通过与先前或以后引用的同一特性相同的技术确定。
[0073]
还应理解的是，本发明不限于本文描述的特定实施例和方法，因为具体的组分和/或条件当然可以变化。此外，本文所使用的术语仅出于描述本发明的特定实施例的目的而使用，并不旨在以任何方式进行限制。
[0074]
在整个本技术中，在引用了出版物的情况下，这些出版物的披露内容通过引用以其整体特此并入本技术，以更充分地描述本发明所属的技术水平。
[0075]
在下文中，参考以下非限制性实例说明本发明。
[0076]
实例
[0077]
体外发酵模型tim-2
[0078]
使用tim-2模型进行体外发酵研究。这是经过验证的动态计算机控制模型，其模仿人结肠，模拟体温、管腔ph值，通过模型内部的半透膜吸收水和微生物代谢物，通过蠕动运动混合和运输肠内容物，使用人源厌氧微生物群，它基本上对应于如minekus,m.,等人appl.microbiol.biotechnol.[应用微生物学与生物技术]1999 53,108-114.doi:10.1007/s002530051622和kortman等人,frontiers in microbiology[微生物学前沿]2016,6,1481所述的模型。
[0079]
使用minekus,m(1998.development and validation of a dynamic model of the gastrointestinal tract.[胃肠道动力学模型的开发和验证]phd thesis[博士论文],荷兰代尔夫特理工大学(delft university of technology,the netherlands))中描述的蠕动泵，通过增加系统中内容物的ph值和蠕动来模拟tim-2系统中内容物的运动特征。
[0080]
scfa分析
[0081]
scfa分析在荷兰芬洛的布赖特实验室(brightlabs b.v.,venlo,the netherlands)根据(s
á
yago-ayerdi sg等人,food research international[国际食物研究],电子发表日期2017年12月13日；sayago ayerdi等人food research international[国际食物研究]118(2019)89-95)进行。
[0082]
接种
[0083]
采用20名bmi≥18.5kg/m2(包括消瘦型(18.5kg/m2≤bmi《25kg/m2)和肥胖型(bmi≥30kg/m2)受试者)的无任何代谢性疾病健康受试者的粪便混合微生物样本接种tim-2体外发酵模型。
[0084]
维生素混合物
[0085]
使用的维生素混合物含有(每升)：1mg甲萘醌、2mg d-生物素、0.5mg维生素b12、10mg泛酸酯、5mg烟酰胺、5mg对氨基苯甲酸和4mg硫胺素。
[0086]
透析液
[0087]
tim-2系统中使用的透析液含有(每升)：2.5g k2hpo4·
3h2o、4.5g nacl、0.005g feso4·
7h2o、0.5g mgso4·
7h2o、0.45g cacl2·
2h2o、0.05g胆汁和0.4g半胱氨酸
·
hcl，加1ml的维生素混合物。
[0088]
实例1
[0089]
新鲜取样粪便微生物群并在厌氧条件下于冰上直接保存(2h内)。接下来，在厌氧箱中，将样品用透析液按1:1稀释，并以大约相等的重量合并，然后添加甘油(终浓度为12-13w/w)，并将等分试样(30ml/管)冷冻在液氮中且于-80℃储存。
[0090]
接种前，从-80℃冰箱中取出4x 30-ml等分试样，并在37℃的水浴中解冻整1小时(仍在厌氧条件下)。在厌氧箱中，合并来自4个管的微生物群，并添加相同体积的预先还原的(即无氧的)透析液，轻轻混合并分到4个注射器中，每个注射器包含约60ml含微生物群的液体。用小软管密封注射器，软管用管夹封闭。每个tim-2单元均用4个注射器中的1个(即60ml微生物群/透析液混合物)进行接种，并使用一个单个样品端口接种tim-2单元。将微生物群引入该单元后，将另外的60ml预还原的透析液添加到tim-2单元中，以使终体积为每单元(即系统)120ml。
[0091]
为了模拟结肠近端区域、横结肠和结肠远端部分的状况，在24小时的时间段内，使用1m naoh使微生物群/透析液混合物的ph值从ph 5.8升至ph 7.0。ph值升高模拟了24小时实验期间纤维通过结肠运输(其中最近16小时模拟了远端结肠位置(即横结肠 远端结肠))。
[0092]
在插入试验品后的1、2、4、6、8和24h后，取样品(1ml)用于短链脂肪酸(scfa)分析；确定scfa的累积绝对量。
[0093]
将样品以14,000rpm离心10min，通过0.45μm pfte过滤器过滤，并在流动相(1.5mm硫酸水溶液)中稀释。使用自动进样器730(万通公司(metrohm)，海利绍(herisa)，瑞士)，将十微升装入柱中。根据它们的pka洗脱酸。使用配备了transgenomic ic sep ice-ion-300柱(30cm
×
7.8mm
×
7μm)和metrosep rp2 guard的883色谱仪(ic，万通公司)通过离子排阻色谱法(iec)进行分析。使用0.4ml/min柱流速和65℃柱温度。使用抑制型电导检测法来检测酸的含量。分析由布赖特实验室(brightlabs)(芬洛，荷兰)进行。
[0094]
试验品的添加：
[0095]
适应40h后，(在周三)通过样品端口将7.5克2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)作为单次注射加入tim-2装置。
[0096]
实验周包含以下步骤：
[0097]
周一：启动tim-2系统的所有4个单元(ph 5.8)。
[0098]
周二：模拟回肠流出物环境培养基(siem)进食(maathuis等人2009journal of the american college of nutrition[美国营养学院学报]28(6):657-66doi:10.1080/07315724.2009.10719798)；
[0099]
模拟回肠流出物培养基(siem)包含5.7克/升bd bacto胰蛋白(bd公司)、2.4克/升d-葡萄糖(西格玛-奥德里奇公司(sigma-aldrich))、6.14克/升nacl(roth公司，德国)、0.68克/升kh2po4(默克公司(merck)，德国)、0.3克/升nah2po4(默克公司，德国)、1.01克/升nahco3(默克公司，德国)、5.6克/升胆盐3号(difco公司)、0.2克/升溶菌酶(赛瓦公司
(serva)，德国)、1,000uα-淀粉酶(fluka公司，德国)、110u胰蛋白酶(西格玛-奥德里奇公司)、380u胰凝乳蛋白酶(calbiochem公司，德国)和960u脂肪酶(西格玛-奥德里奇公司)。在添加前将d( )-葡萄糖和酶过滤除菌。
[0100]
周三：饥饿期3h，然后单次插入试验品；通过样品端口加入2
’‑
fl(7.5克2
’‑
fl)；引入试验品后，在1h、2h、4h、6h和8h后取样品用于scfa分析。
[0101]
周四：插入试验品后24h：取最后一个样品用于scfa分析；
[0102]
周五：清洁(实验在一周内进行)。
[0103]
结果
[0104]
在最后两个采样点之间(即，在插入试验品后8至24小时之间)乙酸累积绝对数量增加被视为指示远端结肠中scfa和乙酸增加。
[0105]
实验结果显示在下表1中。
[0106]
表1.tim-2实验的结果，使用接受2
’‑
fl的微生物群样品受试者。
[0107]
试验品乙酸产生*2
’‑
fl17mmol
[0108]
*乙酸的量是指在插入试验品后8小时至24小时内产生的量；代表远端结肠产生的乙酸和scfa的量。
[0109]
实验表明，在模型系统中插入2’fl(7.5克)导致远端结肠中乙酸生成量增加了17mmol。在tim-2模型系统中使用消瘦受试者和肥胖受试者的粪便微生物群样品时，均观察到了乙酸生成量增加。
’‑
岩藻糖基乳糖的组合物
技术领域
1.本文披露的发明涉及包含2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)的组合物，该组合物用于预防人类受试者的哮喘。
背景技术：
2.哮喘通常被描述为过敏性疾病，其中过敏原(如花粉或螨)或某些工作场所暴露可能触发气道狭窄发作，并通过持续暴露导致气道炎症和气道反应性增强。然而，这种关联主要来自西方高收入国家的观察结果，而在中低收入国家过敏和哮喘之间的关联则弱得多。哮喘的某些职业原因似乎不涉及过敏。现在，人们普遍认识到，过敏机制仅与一半或更少的哮喘患者有相关性。在许多人中，哮喘可能涉及气道的非过敏性炎症，然而我们对所涉及的机制并不十分了解。
3.如本文所用，哮喘定义为“异质性疾病”，通常以慢性气道炎症为特征(根据全球哮喘防治倡议(global initiative for asthma，gina))。其定义依据为随时间变化且严重程度不同的诸如喘鸣、气短、胸闷和咳嗽等呼吸道症状，并伴有可变呼气气流受限。哮喘症状最常首次发生在儿童早期。哮喘是一种常见的慢性疾病，据估计影响全世界多达3.39亿人。在世界各地所有年龄段的人中，这是造成包括过早死亡和生活质量下降在内的重大疾病负担的一个原因。
4.治疗哮喘有两种主要方法：(i)通过放松气道平滑肌来逆转气道狭窄的支气管扩张剂(最常见的是β2-激动剂)，以及(ii)治疗潜在气道炎症的皮质类固醇(globalasthmareport.org)。因为哮喘通常以慢性气道炎症为特征，所以哮喘的治疗也具有持续时间长的特征。
5.thorburn等人已经证明，给小鼠喂高纤维饮食会使其产生独特的肠道菌群，从而使包括乙酸在内的短链脂肪酸的含量增加。对小鼠的高纤维或乙酸喂养可使其过敏性气道疾病(aad，一种人类哮喘模型)得到显著抑制。对妊娠小鼠的高纤维/乙酸喂养可使其成年后代无法发展明显的aad。他们的研究结果为高纤维饮食和乙酸的生成在防止后代发展气道疾病方面的作用提供了证据。在人体内也观察到了母体乙酸水平等于或高于小鼠中位值的影响。研究表明，人的哮喘与母体饮食有相关性，并且妊娠晚期通过对母亲施用高水平膳食纤维可以减少哮喘症状。这种饮食与血清中的高乙酸水平相关，并且与前12个月需要两次或两次以上全科医生(gp)诊视咳嗽或喘鸣的婴儿百分比下降有关(thorburn等人2015nature communications[自然通讯]6:7320|doi:10.1038/ncomms8320)。
[0006]
因此，需要治疗性和非治疗性方法来预防或至少减少哮喘症状。考虑到成本和健康舒适性两者，还希望减少或最少化使用哮喘治疗的需要。
[0007]
此外，期望这种治疗与正常和/或健康饮食可以共同进行。优选对(食物的)味道和/或口感没有负面影响。其他期望的特性或效果包括但不限于保持受试者的其他一般健康体征(例如保持正常血压、保持健康排便、正常排便等)、易于实施、易于准备、增加微生物群的多样性以及所使用的化合物、组合和/或组合物的商业可用性。
[0008]
另外还期望提供用于在哮喘的非治疗性治疗中使用的组合物。优选地，治疗或预防哮喘不需要幼儿使用药物。
[0009]
本发明的目的是提供能够更好地解决至少一种上述预期的组合物。
技术实现要素：
[0010]
在一方面中，本发明提供一种组合物，其包含2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)，用于在人类受试者中通过在受试者于母体内孕育期间向母亲施用该组合物来预防哮喘。
[0011]
在另一方面中，本发明提供一种在人类受试者中预防哮喘的方法，该方法包括在受试者于母体内孕育期间向受试者的母亲施用包含2’fl的组合物的步骤。该方法可以是治疗性的或非治疗性的。
[0012]
在另一方面中，本发明涉及包含2’fl的组合物在人类受试者中预防哮喘的用途，其特征在于：在受试者于母体内孕育期间，向该受试者的母亲施用该组合物。
[0013]
本文所述的本发明基于以下发现：可优选地经口施用人类受试者特定膳食纤维，即2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)，以实现至少一种上述期望。特别地，发现包含2
’‑
fl的组合物显著增加了人类受试者结肠远端的乙酸水平。因此，本发明涉及一种组合物，其包含2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)，用于在人类受试者中通过在受试者于母体内孕育期间向母亲施用该组合物来治疗或预防哮喘。
具体实施方式
[0014]
关于给定疾病或病症的术语“治疗”包括但不限于抑制疾病或病症，例如阻止疾病或病症发展；缓解疾病或病症，例如引起疾病或病症消退；或缓解由疾病或病症导致或由疾病或病症引起的状况，例如缓解、预防或治疗疾病或病症的症状。
[0015]
与给定疾病或病症相关的术语“预防”是指：当尚未发生该疾病或病症时，预防其发生；在可能尚未被诊断为患有该疾病或病症的受试者中预防发生该疾病或病症；和/或当该疾病或病症已经存在时，预防疾病/病症的进一步发展。
[0016]
如本文所用，“哮喘的预防”或“预防哮喘”定义为改善出生后患哮喘的风险。例如，幼儿患哮喘的程度可通过在孩子出生后前12个月到24个月内咳嗽和/或喘鸣的全科医生(gp)诊视次数进行衡量。
[0017]2’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)是一种低聚糖，更确切地说，是由l-岩藻糖、d-半乳糖和d-葡萄糖单元组成的岩藻糖基化中性三糖(连接的fuc(α1-2)gal(β1-4)glc)；cas nr 41263-94-9。它是人类母乳中自然存在的最常见的人乳低聚糖(hmo)，约占所有hmo的30％——至少在所谓的分泌型母亲(即fut2阳性)中是这样。hmo是不可消化的碳水化合物，并且是人乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大组分。目前已在人乳中鉴定出200多种不同的寡糖。临床试验表明，2
’‑
fl在保护和促进新生婴儿的健康，特别是在免疫系统方面起着关键作用。研究表明，在婴儿配方制品中添加2
’‑
fl是安全且耐受性良好的。此外，对于所有其他年龄段的人(尤其是成年人)，2
’‑
fl是安全且耐受性良好的。
[0018]
可以使用本领域技术人员已知的方法获得hmo。例如，hmo可以从人乳中纯化获得。可使用本领域已知的方法进一步分离单个hmo，例如使用毛细管电泳、hplc(例如，具有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱；hpaec-pad)和薄层色谱法。参见，例如，美国专利申请号
2009/0098240。可替代地，可以使用酶促方法合成hmo。生产hmo的另一方法是通过工程细菌中的生物合成。例如，wo 2012/112777披露了制备2
’‑
fl的方法。可替代地，2
’‑
fl可商购获得，例如，可商购自皇家菲仕兰公司(frieslandcampina)或其他公司。
[0019]
如本文所用，化合物(例如2’fl)在组合物中的量，以“每天食用的克(或毫克)数”表示，是指该化合物在组合物中的量应使得当向受试者施用推荐的每日份(即每日剂量)时将向受试者施用该克数的化合物。因此，如果推荐的每日剂量为100克组合物，分为2份，则一个单份包含50克组合物；每日份包括2份这样的单份。
[0020]
如本文所用，膳食纤维是指既不被人体消化也不被人体吸收，但会被肠道微生物利用的碳水化合物。它们可从植物中分离出来或由糖类合成，并且包含至少3个单糖单元(即聚合度dp≥3)。它们在胃肠道中的发酵影响细菌群落的组成以及微生物代谢活性，包括在宿主肠道中生成发酵终产物。一些膳食纤维也可以归类为益生元。益生元定义为促进宿主肠道中有益微生物生长的不可消化的食物成分。益生元的摄入可使胃肠道微生物群的组成和/或活性发生特定变化，从而使宿主健康受益。
[0021]
益生元膳食纤维来源可选自由β葡聚糖、fos(包括菊粉)、gos、异麦芽低聚糖、瓜尔胶、乳果糖、抗性淀粉(rs)、麦芽糊精、低聚木糖和阿拉伯低聚糖组成的组中的一种或多种。优选地，益生元膳食纤维选自由fos和gos组成的组中的一种或多种。益生元膳食纤维据称具有多种健康效应，例如对肠道微细菌的效应、可对宿主产生许多积极影响的代谢产物(如短链脂肪酸(scfa))、对矿物质吸收的效应、对蛋白质发酵的效应、细菌致病种群的变化、对过敏风险的效应、对肠道屏障通透性的效应以及对免疫系统防御的效应。例如，参见calson等人的health effects and sources of prebiotic dietary fiber[益生元膳食纤维的健康影响和来源],2018,curr dev nutr[营养学最新进展]2018；2:nzy005doi:https://doi.org/10.1093/cdn/nzy005.
[0022]
低聚果糖(fos)，有时也称为果聚糖(oligofructose)或寡果聚糖(oligofructan)，是低聚糖果聚糖类。它们可使用本领域已知的方法通过菊粉降解或转果糖作用方法获得。fos可通过降解菊粉或聚果糖(一种通过β(2
→
1)键与末端α(1
→
2)连接的d-葡萄糖连接的d-果糖残基聚合物)产生。菊粉的聚合度范围为10至60。菊粉可以酶法或化学法降解为具有一般结构glu-frun(缩写为gfn)的低聚糖，其中n的范围为1至7。第二类fos通过曲霉(例如黑曲霉)的β-果糖苷酶对蔗糖的转果糖作用制备。所得混合物的通式为gfm，其中m的范围为1至5。
[0023]
还必须注意，如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“该(the)”包括复数个对象，除非上下文另外明确指出。例如，以单数形式提及的组分旨在包含多种组分。
[0024]
应当理解，在本披露内容中，除非另有说明，否则对重量、重量比等的任何提及均指的是干物质，特别是组合物的干物质。
[0025]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语一般具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
[0026]
在一第一方面中，本发明提供一种组合物，其包含2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)，用于在人类受试者中通过在受试者于母体内孕育期间向母亲施用该组合物来预防哮喘。到目前为止，尚不清楚母亲使用2’fl对胎儿健康的影响情况。
[0027]
在另一方面中，本发明涉及一种在人类受试者中预防哮喘的方法，该方法包括在受试者于母体内孕育期间向受试者的母亲施用包含2’fl的组合物的步骤。
[0028]
在又一方面中，本发明涉及包含2’fl的组合物在人类受试者中预防哮喘的用途，其特征在于：在受试者于母体内孕育期间，向该受试者的母亲施用该组合物。该组合物在本发明此方面中的用途可为治疗性的和/或非治疗性的。优选地，在本发明的各个方面和实施例中的用途是非治疗性的。
[0029]
在本发明的任一方面的一实施例中，如本发明的各个方面和实施例中所述的人类受试者可以具有任何年龄，例如婴儿(0-12个月)、幼儿(1-3岁)、学龄前儿童(3-5岁)、小学生(5-12岁)、青少年(12-18岁)、年轻成人(18-21岁)或成人(》21岁)。因为在一实施例中难以向幼儿施用哮喘药物，所以受试者优选为婴儿、幼儿或学龄前儿童，更优选为婴儿或幼儿，最优选为婴儿。可替代地，因为哮喘具有慢性特征，患有哮喘的受试者必须用药多年，所以在另一个实施例中，受试者为青少年或年轻成人。在另一实施例中，受试者为成人。
[0030]
优选地，如在本发明的各个方面和/或实施例中所提及的母亲不患有哮喘，因为有人提出，如果母亲不患有哮喘，则母亲的乙酸水平在孩子出生后第一年对孩子的哮喘水平具有更大的影响(thorburn等人2015nature communications[自然通讯]6:7320|doi:10.1038/ncomms8320)。
[0031]
包含2’fl的组合物可在整个妊娠期间向母亲施用。可替代地，在一实施例中，该组合物可在妊娠的前3个月期间、优选地在妊娠的前6个月期间向母亲施用。在又一实施例中，包含2’fl的组合物在妊娠的最后2个月期间、优选在妊娠的最后3个月期间、更优选在妊娠的最后6个月期间、甚至更优选在妊娠的最后8个月期间向母亲施用。最优选地，包含2’fl的组合物在妊娠的第2个半期期间向母亲施用。妊娠年龄，也称为胎龄，从怀孕女性最后一个月经期开始算起。医学专业人员认为人类的正常妊娠持续时间为40周。
[0032]
对大多数人而言，存在一个每天可摄入膳食纤维的最大数量，超过此数量，就开始出现胃肠道不适。可通过逐渐增加膳食纤维的每日食用量并监测是否出现不良反应来确定每天可消耗的最大膳食纤维量，例如，可从每天1克2’fl开始，每周增加3克。对于2’fl，20g的每日剂量已被测试为安全用量。本发明中使用的组合物中2
’‑
fl的量也取决于受试者的体重(即质量)；据认为，体重较重的人可耐受更多的膳食纤维。因此，在一实施例中，本发明中使用的组合物中每日份的2
’‑
fl的量大于0.01克，优选大于0.1克。在另一实施例中，每日份的2’fl的量为0.01至30克/每日份，优选为0.1至30克/每日份，更优选为0.5至25克/每日份，甚至更优选为1到20克/每日份，最优选为1至10克/每日份。在再一个实施例中，2’fl的量为0.01至1.0克/每日份。
[0033]
在另一实施例中，本发明所用组合物中2’fl的量相对于该组合物的总干重为至少0.1wt.％，例如至少0.5wt.％，或至少1wt.％。在一实施例中，该量相对于组合物的总干重为至少5wt.％，优选至少10wt.％，更优选至少15wt.％，甚至更优选至少20wt.％，特别优选至少30wt.％，最优选至少40wt.％。
[0034]
如本文所用，术语“gos”表示低聚半乳糖(gos)，其通常包括半乳糖单元链和还原端处的葡萄糖单元。gos是由β-半乳糖苷酶(酶类ec.3.2.1.23)催化的连续反式半乳糖基化反应产生的。β-半乳糖苷酶可在例如环状芽孢杆菌(bacillus circulans)、米曲霉(aspergillus oryzae)、马克思克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、脆弱克鲁维酵母
(kluyveromyces fragilis)、单链孢霉(sporobolomyces singularis)和发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)等多种微生物中产生。β-半乳糖苷酶的三维结构不同，导致在反式半乳糖基化反应期间形成的糖苷键具有立体选择性和区域选择性。例如，通常来源于曲霉的真菌β-半乳糖苷酶主要产生β1-6键(因此得到主要包含β1-6键的gos制剂，可称为“6
’‑
gos”)，而来源于芽孢杆菌的细菌β-半乳糖苷酶主要产生β1-4键(得到主要包含β1-4键的gos制剂，也可称为“4
’‑
gos”)。此外，环状芽孢杆菌(b.circulans)产生的β-半乳糖苷酶具有特别强的反式半乳糖基化活性，常用于合成gos。最近，如ep 3399032和wo 2019/002304中所述，在gos合成中使用了源于土生隐球菌(cryptococcus terrestris，最近更名为土生蝶孢银耳(papiliotrema terrestris))的β-半乳糖苷酶。因此，gos在本领域中为人们所熟知。
[0035]
某些gos成分在母乳和初乳中天然存在。典型的gos制剂主要包括二糖至六糖，但也可能出现较大的低聚糖。
[0036]
已经报道了gos的各种生理功能，包括刺激肠道中双歧杆菌生长、支持正常肠道转运、促进自然防御和增强矿物质吸收的能力。gos因其促进双歧杆菌、乳杆菌和其他肠道细菌生长的益生元效应而受到了特别关注。因此，gos通常用于婴儿配方食品、乳杆菌发酵饮料和酸奶中。某些含gos的食品经日本消费者事务管理局认证为“特定健康用途食品”，而gos被美国食品和药物管理局认证为公认安全(gras)物质(gras公告：grn 233、236、285、286、334、484、489、495、518和569)。
[0037]
优选地，gos的聚合度(dp)在2至10的范围内，更优选在3至8的范围内。合适的gos制剂商购获得，例如可从frieslandcampina nederland b.v.购得的gos。在这方面，应注意的是，gos制剂(例如gos)除含低聚半乳糖外，还可能含有乳糖和/或单糖。关于本发明，本技术中提及的gos的量涉及制剂中的实际gos含量，即，低聚半乳糖的实际量，其中既不包括乳糖也不包括单糖(如果存在)。
[0038]
已经知道，结肠中不同益生元膳食纤维的发酵速度和位置取决于纤维的类型。例如，已知低聚半乳糖(gos)在到达盲肠至结肠处和结肠近端后迅速发酵。gos发酵产生的大量乙酸转化为其他代谢物。gos发酵不会导致远端结肠中乙酸水平(即乙酸浓度)升高(canfora等人gastroenterology[胃肠病学],2017,第153卷,第1期,第87-97页)。
[0039]
不希望受到任何特定理论的约束，本发明人认为，当将包括gos和2
’‑
fl在内的膳食纤维混合物施用至受试者时，结肠微生物群首先使gos发酵充当能量源。因此，据信(更多的)2
’‑
fl可到达远端结肠，在那里由产生乙酸的其他肠道微生物发酵。然后，远端结肠中的乙酸生成可能导致其对代谢产生影响。例如，乙酸可能在局部发挥有益作用和/或可能进入体循环。当2’fl与其他膳食纤维(例如益生元膳食纤维，如低聚果糖(fos)、菊粉、低聚木糖(xos)或抗性淀粉)结合时，可能会产生类似作用。
[0040]
如本文所用，“远端结肠”指降结肠(结肠左侧)和乙状结肠(连接直肠的结肠s形节段)。
[0041]
因此，在另一个实施例中，本发明使用的组合物进一步包含一种或多种膳食纤维，优选其中所述膳食纤维为益生元膳食纤维。在又一实施例中，其进一步包含一种或多种益生元膳食纤维，其中所述益生元膳食纤维选自一或多个由gos、fos、菊粉和抗性淀粉组成且优选由gos、fos和菊粉组成的组，特别其进一步包含由fos、菊粉和抗性淀粉组成的组。特别
优选地，本发明所用组合物进一步包含低聚半乳糖(gos)。换句话说，在一些实施例中，本发明中使用的组合物包含2
’‑
fl和gos作为膳食纤维。
[0042]
在一实施例中，在与本发明相关的2
’‑
fl和益生元膳食纤维的组合中，2
’‑
fl与膳食纤维之间的重量比在0.5:10至10:0.5的范围内。优选地，与该组合物的总干重相比，该组合物包含至少5wt.％的2
’‑
fl和至少5wt.％的膳食纤维，更优选地，该组合物包含至少10wt.％的2’fl和至少10wt.％的膳食纤维，甚至更优选地，该组合物包含至少20wt.％的2’fl和至少20wt.％的膳食纤维。
[0043]
与本发明相关的2
’‑
fl和gos的组合可提供更好的结果，因为其可使更多的2
’‑
fl到达结肠的远端部分。在一实施例中，该组合物中2
’‑
fl与gos之间的重量比在0.5:10至10:0.5的范围内。
[0044]
与本发明相关的2
’‑
fl和fos的组合可提供更好的结果，因为其可使更多的2
’‑
fl到达结肠的远端部分。在一实施例中，该组合物中2
’‑
fl与fos之间的重量比在0.5:10至10:0.5的范围内。在另一实施例中，该组合物中2
’‑
fl与菊粉之间的重量比在0.5:10至10:0.5的范围内。
[0045]
在本发明的组合物中，gos和fos(包括菊粉)可以以1:9至9:1的比例存在。
[0046]
在一实施例中，包含2
’‑
fl和膳食纤维的组合物可为组合部分，其中2
’‑
fl和膳食纤维未混合在单一组合物中，即2
’‑
fl和膳食纤维包含在两种单独的组合物中，当与任选的其他组分一起使用时，这些单独的组合物可生成本发明组合物。如本领域技术人员将理解的，本发明的益处可通过顺续或同时施用2
’‑
fl和膳食纤维获得。此类治疗用途和方法也在本发明的范围内。优选地，2
’‑
fl和膳食纤维同时施用。当顺续施用2
’‑
fl和膳食纤维时，施用第一化合物与第二化合物之间的时间小于1小时，优选小于45分钟，更优选小于30分钟，更优选小于20分钟，更优选小于15分钟，更优选小于10分钟，更优选小于5分钟，最优选小于1分钟。
[0047]
可以理解，当2
’‑
fl和膳食纤维顺序施用时，通常是首先施用两种组分中任意一种。因此，在一适宜实施例中，首先施用膳食纤维gos，然后施用2
’‑
fl，而在另一适宜实施例中，首先施用2
’‑
fl，然后施用膳食纤维。
[0048]
如本文前面已经指出的，本发明在于发现向受试者(口服)施用2
’‑
fl或2
’‑
fl和膳食纤维(优选gos)可导致结肠远端部分中乙酸水平的增加。怀孕的母亲体内乙酸水平的这种升高被认为有益于预防儿童哮喘。
[0049]
在一实施例中，当本发明组合物包含2
’‑
fl和膳食纤维时，与该组合物的总干重相比，这些优选以至少0.1wt.％的2
’‑
fl和1wt.％的膳食纤维的量存在。在一实施例中，与该组合物的总干重相比，该组合物包含至少0.01wt.％的2
’‑
fl和至少5wt.％的膳食纤维。在一实施例中，与该组合物的总干重相比，该组合物包含至少0.1wt.％的2
’‑
fl和至少5wt.％的膳食纤维。在另一实施例中，与该组合物的总干重相比，其包含至少5wt.％的2
’‑
fl和5wt.％的膳食纤维。在又一实施例中，与该组合物的总干重相比，2
’‑
fl以至少至少0.01wt.％、至少01.wt％、至少1wt.％、10wt.％、至少20wt.％、至少30wt.％、至少40wt.％、至少50wt.％、至少60wt.％、至少70wt.％、至少80wt.％、至少90wt.％，例如至多91wt.％、92wt.％、93wt.％或94wt.％的量存在。
[0050]
在再一实施例中，当本发明组合物包含2
’‑
fl和gos时，与该组合物的总干重相比，
这些优选以至少0.1wt.％的2
’‑
fl和1wt.％的gos的量存在。在另一实施例中，与该组合物的总干重相比，其包含至少5wt.％的2
’‑
fl和5wt.％的gos。在又一实施例中，与该组合物的总干重相比，2
’‑
fl以至少10wt.％、至少20wt.％、至少30wt.％、至少40wt.％、至少50wt.％、至少60wt.％、至少70wt.％、至少80wt.％、至少90wt.％，例如至多91wt.％、92wt.％、93wt.％或94wt.％的量存在。在另一实施例中，与该组合物的总干重相比，gos以至少10wt.％、至少20wt.％、至少30wt.％、至少40wt.％、至少50wt.％、至少60wt.％、至少70wt.％、至少80wt.％、至少90wt.％，例如至多91wt.％、92wt.％、93wt.％或94wt.％的量存在。
[0051]
在一实施例中，2
’‑
fl和gos以在0.5:10至10:0.5范围内的重量比提供、优选以在1:8至8:1范围内的重量比提供、更优选以在2:6至6:2范围内的重量比提供、最优选以在3:5至5:3范围内的重量比提供。在一替代实施例中，在根据本发明使用的组合物中，2
’‑
fl和gos以约1:1的重量比提供；或者甚至以1:1的重量比提供。
[0052]
在另一实施例中，本发明使用的组合物包含2
’‑
fl和膳食纤维，其中i.2
’‑
fl的量大于0.01克及ii)2
’‑
fl和膳食纤维的总量小于30克，优选小于25克，更优选小于20克，最优选小于15克。在另一实施例中，本发明使用的组合物包含2
’‑
fl和膳食纤维，其中i.2
’‑
fl的量大于0.1克及ii)2
’‑
fl和膳食纤维的总量小于30克，优选小于25克，更优选小于20克，最优选小于15克。在又一实施例中，本发明使用的组合物包含2
’‑
fl及膳食纤维，其中2
’‑
fl的量介于0.1和8克/每日份之间，并且膳食纤维的量介于1和6克/每日份之间。
[0053]
在一特定实施例中，本发明使用的组合物包含2
’‑
fl和gos，其中i.2
’‑
fl的量大于0.01克及ii)2
’‑
fl和gos的总量小于30克，优选小于25克，更优选小于20克，最优选小于15克。在另一实施例中，本发明使用的组合物包含2
’‑
fl和gos，其中i.2
’‑
fl的量大于0.1克及ii)2
’‑
fl和gos的总量小于30克，优选小于25克，更优选小于20克，最优选小于15克。在又一实施例中，本发明使用的组合物包含2
’‑
fl及gos，其中2
’‑
fl的量介于0.1和8克/每日份之间，并且gos的量介于1和6克/每日份之间。
[0054]
根据本发明使用的组合物为一食品，优选地，选自由下列组成的组：乳制品，如奶制品、奶昔、巧克力牛奶、酸奶、奶油、奶酪、布丁、冰淇淋等；棒(bar)，如营养棒、能量棒、零食棒(snack bar)、谷物棒、针对糖尿病的棒等；液体产品，如营养饮料、低糖饮料、液体代餐(liquid meal replacer)、运动饮料和其他强化饮料；美味小吃(savory snack)，如薯片、玉米饼、膨化和烘烤的小吃、饼干、咸脆饼干；美味饼干(savory biscuit)，焙烤食品，如松饼、蛋糕、饼干；意式面食，如意大利式细面条；以及食品补充剂，如丸剂、胶囊剂或干粉。食品补充剂可以随时食用，或者可能需要溶解在液体(如水)中。干粉形式的产品可以与如汤匙之类的装置一起使用，以测量所需量的粉末(例如每日或单位剂量)。食物补充剂可进一步包含食物补充剂中常用的其他成分，如维生素、矿物质、盐等。所述食品优选地选自由乳制品、液体产品和食品补充剂组成的组。可替代地，该组合物为食品补充剂，如丸剂或粉剂，优选为丸剂。食品最好附有说明，说明每天应食用多少产品。
[0055]
如本文定义的组合物或如本文定义的食品可以在罐、瓶、小袋、纸箱、包装纸等中提供。
[0056]
通常，治疗需要以单位剂量形式施用2
’‑
fl和任选的不可消化低聚糖(在一实施例中为gos)。在一实施例中，治疗需要以单位剂量形式施用根据本发明的组合物。在一优选实
施例中，该组合物以单份的形式提供，任选地，每一单份为单独包装，并且每一份包含单位剂量的2
’‑
fl和任选的膳食纤维。可替代地，根据本发明使用的组合物存在于包含多个单份的容器中，如5个、7个、10个、30个、50个、100个、200个、300个、365个单份。此类容器优选随附说明书，注明代表单份或每日份的该组合物的量。在再一实施例中，包含本发明组合物的容器包含至少7个、如至少14个或至少31个单份。优选地，该膳食纤维选自一或多个由gos、fos、菊粉和抗性淀粉组成的组，更优选地选自一或多个由gos、fos和菊粉组成的组。最优选地，膳食纤维为gos。
[0057]
在一实施例中，2
’‑
fl的单位剂量为至少0.01克，优选地，至少0.1克、1克、如至少1.5克、至少2克、至少2.5克、至少3克、至少3.5克或至少4克。
[0058]
在另一实施例中，2
’‑
fl的单位剂量为至多30克，如至多25克，如至多20克、至多15克、至多12.5克、至多10克、至多9克、至多8克、至多7克、至多6克或至多5克。
[0059]
在一实施例中，膳食纤维的单位剂量为0.5至10克，并且2
’‑
fl的单位剂量为3至8克，优选为4至8克，更优选为5至8克2
’‑
fl。在另一实施例中，膳食纤维的单位剂量为2至8克，并且2
’‑
fl的单位剂量为0.5至10克，优选为1至7克，更优选为2至4克2
’‑
fl。在再一实施例中，膳食纤维的单位剂量为至少1克，至少1.5克、至少2克、至少2.5克、至少3克、至少3.5克、或至少4克。在另一实施例中，膳食纤维的单位剂量为最多25克，最多20克、最多15克、最多12.5克、最多10克、最多9克、最多8克、最多7克、最多6克或最多5克。在一实施例中，gos的单位剂量为0.5至10克，更具体而言为2至8克。优选地，该膳食纤维选自一或多个由gos、fos、菊粉和抗性淀粉组成的组，更优选地选自一或多个由gos、fos和菊粉组成的组。最优选地，膳食纤维为gos。
[0060]
本发明组合物(如2
’‑
fl和任选的gos)的单位剂量优选至少每周施用一次，优选至少每3天施用一次，更优选至少每隔一天施用一次，最优选至少每天施用一次。在本发明一实施例中，治疗包括每日施用单位剂量的本发明组合物。据认为，每日施用本发明组合物可使远端结肠中更连续地产生乙酸，这增加了对未出生儿童的健康影响。
[0061]
根据本发明，本文之前定义的治疗优选持续至少2周的时间段，例如至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月或甚至至少6个月。
[0062]
在一实施例中，将本发明的组合以0.1至20克/天范围内的量，优选为1至15克/天范围内的量施用至受试者。
[0063]
在本发明另一实施例中，治疗包括施用平均量为0.01至32克/天的2
’‑
fl，在另一实施例中该治疗包括施用平均量为0.1至32克/天的2’fl，优选平均量为1至24克/天，更优选平均量为2至16克/天，例如约5或12克/天；及任选地，施用平均量为2至24克/天的gos，该平均量优选为3至16克/天，更优选为4至12克/天，例如约7.5克/天，时间段为至少2周、优选至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月或至少6个月。在再一实施例中，该治疗包括每日施用包含0.01至5克的2’fl和任选2至24克的膳食纤维的组合物。优选地，该膳食纤维选自一或多个由gos、fos、菊粉和抗性淀粉组成的组，更优选地选自一或多个由gos、fos和菊粉组成的组。最优选地，膳食纤维为gos。
[0064]
人乳低聚糖(hmo)是人乳的关键成分。它们是结构上和生物学上不同的一组复杂的难消化的碳水化合物。迄今为止，已鉴定出超过200种不同的低聚糖，其大小从3至22个单糖单元不等。最常见的hmo是岩藻糖基化和非岩藻糖基化的中性低聚糖。这些hmo的数量和
结构在女性之间显著不同，并且取决于分泌腺和lewis血型状况(l.bode,j.nutr.[营养学杂志]136:2127-2130,2006)。2’fl是hmo。在一实施例中，如在本发明的方面中使用的组合物包含一种或多种除2’fl之外的hmo。人乳的hmo由各种单糖(即葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、n-乙酰葡糖胺)和唾液酸(n-乙酰神经氨酸)组成。岩藻糖是一种不寻常的分子，因为它具有l-构型，而体内的其他糖分子具有d-构型。hmo的结构是乳糖单元，其可以被一个或多个半乳糖和/或n-乙酰葡糖胺残基延长(核心结构)。hmo核心结构可以被一个或多个岩藻糖残基修饰(即岩藻糖基化的hmo)以及被一个或多个唾液酸单元修饰(即，唾液酸化的hmo)。hmo也可以被岩藻糖基化和唾液酸化。在一实施例中，本发明组合物中的hmo选自一或多个由下列组成的组：核心hmo、唾液酸化的hmo和岩藻糖基化的hmo。已从人乳中鉴定出近200种hmo。已发现岩藻糖基化的hmo是最主要的成分(约77％)，而唾液酸化的hmo占hmo总丰度的约16％。岩藻糖基化的hmo为中性分子，而唾液酸化的hmo为酸性分子。优选hmo为3
’‑
唾液乳糖(3’sl)；6
’‑
唾液乳糖(6’sl)；3-岩藻糖基乳糖(3-fl)；乳糖-n-四糖(lnt)、乳糖-n-新四糖(lnnt)和二唾液酸乳糖-n-四糖(dslnt)。可以使用本领域技术人员已知的方法获得hmo。例如，可以使用本领域已知的方法(如毛细管电泳、hplc(例如，配有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱；hpaec-pad)和薄层色谱)从人乳中纯化得到hmo，或者可商业购得hmo。
[0065]
在一实施例中，出于非医学原因实施本发明的非治疗方法。本发明的非治疗方法通常将依赖于相同组合、组合物和产品以及如本文所定义的相同施用途径和相同剂量方案(例如对于使用的组合物)的使用。
[0066]
在另一方面中，本发明涉及一种在人类受试者中预防哮喘的方法，该方法包括在受试者于母体内孕育期间向受试者的母亲施用包含2’fl的组合物(即，一种上述本文中所定义的组合物)的步骤。优选地，该方法为非治疗性方法。
[0067]
在又一方面中，本发明涉及包含2’fl和任选gos的组合物(即，一种上述本文中所定义的组合物)在人类受试者中预防哮喘的用途，其特征在于：在受试者于母体内孕育期间，向该受试者的母亲施用该组合物。该组合物在本发明此方面中的用途可为治疗性的和/或非治疗性的。优选地，该用途为非治疗性用途。
[0068]
在另一方面中，本发明涉及2’fl和任选的gos(即，如上述本文所定义的组合物)在制备用于在人类受试者中预防哮喘的药物中的用途，其特征在于：在受试者于母体内孕育期间，向该受试者的母亲施用该组合物。
[0069]
在本发明一特定实施例中，该使用的组合物对单独包装单份的形式呈现。如本文所用，术语“单份(single serving)”是指一定量和/或大小的产品，其足以作为单个部分供单人食用。此类产品可以是即食型或即用型的形式，或者可以是需要进一步处理(如加热或添加一定量的热水或冷水)的形式。在一实施例中，本发明组合物以单独包装的单份的形式呈现，其中每份包含如本文别处定义的单位剂量，优选每份包含0.1至8克、优选0.5至8克、更优选1至4克的2
’‑
fl，并且包含0.5至8克、优选1至4克的gos。
[0070]
本发明中使用的组合物的优选产品形式为可食用棒，例如营养棒、能量棒、饮食棒或食物补充棒、零食棒等，其实例为本领域技术人员所熟知。在一实施例中，可食用棒可以是包含谷物混合物和结合糖浆的谷物组合物。结合糖浆可包括例如葡萄糖浆、砂糖、甘油、水、乳化剂、脂肪和调味剂。本发明的膳食纤维组合物可适当地掺入结合糖浆中。本领域技术人员熟知这类产品，例如案号为wo 2017/078519的国际专利公开案中的产品。
[0071]
在本发明一实施例中，本发明中使用的组合物不包含抗性淀粉。
[0072]
通常优选在所述的数值限度内实施。另外，除非明确说明与此相反，否则：百分比、“份数”和比率值按重量计；适合于或优选用于与本发明有关的给定目的的材料的组或类的描述意味着该组或类的任何两个或更多个组成部分的混合物可以同样地是适合的或优选的；化学术语中成分的描述是指添加到说明书中指定的任何组合时的成分，并且不一定排除一旦混合后混合物的成分之间的化学相互作用；首字母缩写词或其他缩写词的第一个限定适用于相同缩写的本文所有的后续使用，并且将必要的修改应用于最初限定的缩写的正常语法变化；并且，除非明确说明与此相反，否则特性的测量通过与先前或以后引用的同一特性相同的技术确定。
[0073]
还应理解的是，本发明不限于本文描述的特定实施例和方法，因为具体的组分和/或条件当然可以变化。此外，本文所使用的术语仅出于描述本发明的特定实施例的目的而使用，并不旨在以任何方式进行限制。
[0074]
在整个本技术中，在引用了出版物的情况下，这些出版物的披露内容通过引用以其整体特此并入本技术，以更充分地描述本发明所属的技术水平。
[0075]
在下文中，参考以下非限制性实例说明本发明。
[0076]
实例
[0077]
体外发酵模型tim-2
[0078]
使用tim-2模型进行体外发酵研究。这是经过验证的动态计算机控制模型，其模仿人结肠，模拟体温、管腔ph值，通过模型内部的半透膜吸收水和微生物代谢物，通过蠕动运动混合和运输肠内容物，使用人源厌氧微生物群，它基本上对应于如minekus,m.,等人appl.microbiol.biotechnol.[应用微生物学与生物技术]1999 53,108-114.doi:10.1007/s002530051622和kortman等人,frontiers in microbiology[微生物学前沿]2016,6,1481所述的模型。
[0079]
使用minekus,m(1998.development and validation of a dynamic model of the gastrointestinal tract.[胃肠道动力学模型的开发和验证]phd thesis[博士论文],荷兰代尔夫特理工大学(delft university of technology,the netherlands))中描述的蠕动泵，通过增加系统中内容物的ph值和蠕动来模拟tim-2系统中内容物的运动特征。
[0080]
scfa分析
[0081]
scfa分析在荷兰芬洛的布赖特实验室(brightlabs b.v.,venlo,the netherlands)根据(s
á
yago-ayerdi sg等人,food research international[国际食物研究],电子发表日期2017年12月13日；sayago ayerdi等人food research international[国际食物研究]118(2019)89-95)进行。
[0082]
接种
[0083]
采用20名bmi≥18.5kg/m2(包括消瘦型(18.5kg/m2≤bmi《25kg/m2)和肥胖型(bmi≥30kg/m2)受试者)的无任何代谢性疾病健康受试者的粪便混合微生物样本接种tim-2体外发酵模型。
[0084]
维生素混合物
[0085]
使用的维生素混合物含有(每升)：1mg甲萘醌、2mg d-生物素、0.5mg维生素b12、10mg泛酸酯、5mg烟酰胺、5mg对氨基苯甲酸和4mg硫胺素。
[0086]
透析液
[0087]
tim-2系统中使用的透析液含有(每升)：2.5g k2hpo4·
3h2o、4.5g nacl、0.005g feso4·
7h2o、0.5g mgso4·
7h2o、0.45g cacl2·
2h2o、0.05g胆汁和0.4g半胱氨酸
·
hcl，加1ml的维生素混合物。
[0088]
实例1
[0089]
新鲜取样粪便微生物群并在厌氧条件下于冰上直接保存(2h内)。接下来，在厌氧箱中，将样品用透析液按1:1稀释，并以大约相等的重量合并，然后添加甘油(终浓度为12-13w/w)，并将等分试样(30ml/管)冷冻在液氮中且于-80℃储存。
[0090]
接种前，从-80℃冰箱中取出4x 30-ml等分试样，并在37℃的水浴中解冻整1小时(仍在厌氧条件下)。在厌氧箱中，合并来自4个管的微生物群，并添加相同体积的预先还原的(即无氧的)透析液，轻轻混合并分到4个注射器中，每个注射器包含约60ml含微生物群的液体。用小软管密封注射器，软管用管夹封闭。每个tim-2单元均用4个注射器中的1个(即60ml微生物群/透析液混合物)进行接种，并使用一个单个样品端口接种tim-2单元。将微生物群引入该单元后，将另外的60ml预还原的透析液添加到tim-2单元中，以使终体积为每单元(即系统)120ml。
[0091]
为了模拟结肠近端区域、横结肠和结肠远端部分的状况，在24小时的时间段内，使用1m naoh使微生物群/透析液混合物的ph值从ph 5.8升至ph 7.0。ph值升高模拟了24小时实验期间纤维通过结肠运输(其中最近16小时模拟了远端结肠位置(即横结肠 远端结肠))。
[0092]
在插入试验品后的1、2、4、6、8和24h后，取样品(1ml)用于短链脂肪酸(scfa)分析；确定scfa的累积绝对量。
[0093]
将样品以14,000rpm离心10min，通过0.45μm pfte过滤器过滤，并在流动相(1.5mm硫酸水溶液)中稀释。使用自动进样器730(万通公司(metrohm)，海利绍(herisa)，瑞士)，将十微升装入柱中。根据它们的pka洗脱酸。使用配备了transgenomic ic sep ice-ion-300柱(30cm
×
7.8mm
×
7μm)和metrosep rp2 guard的883色谱仪(ic，万通公司)通过离子排阻色谱法(iec)进行分析。使用0.4ml/min柱流速和65℃柱温度。使用抑制型电导检测法来检测酸的含量。分析由布赖特实验室(brightlabs)(芬洛，荷兰)进行。
[0094]
试验品的添加：
[0095]
适应40h后，(在周三)通过样品端口将7.5克2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)作为单次注射加入tim-2装置。
[0096]
实验周包含以下步骤：
[0097]
周一：启动tim-2系统的所有4个单元(ph 5.8)。
[0098]
周二：模拟回肠流出物环境培养基(siem)进食(maathuis等人2009journal of the american college of nutrition[美国营养学院学报]28(6):657-66doi:10.1080/07315724.2009.10719798)；
[0099]
模拟回肠流出物培养基(siem)包含5.7克/升bd bacto胰蛋白(bd公司)、2.4克/升d-葡萄糖(西格玛-奥德里奇公司(sigma-aldrich))、6.14克/升nacl(roth公司，德国)、0.68克/升kh2po4(默克公司(merck)，德国)、0.3克/升nah2po4(默克公司，德国)、1.01克/升nahco3(默克公司，德国)、5.6克/升胆盐3号(difco公司)、0.2克/升溶菌酶(赛瓦公司
(serva)，德国)、1,000uα-淀粉酶(fluka公司，德国)、110u胰蛋白酶(西格玛-奥德里奇公司)、380u胰凝乳蛋白酶(calbiochem公司，德国)和960u脂肪酶(西格玛-奥德里奇公司)。在添加前将d( )-葡萄糖和酶过滤除菌。
[0100]
周三：饥饿期3h，然后单次插入试验品；通过样品端口加入2
’‑
fl(7.5克2
’‑
fl)；引入试验品后，在1h、2h、4h、6h和8h后取样品用于scfa分析。
[0101]
周四：插入试验品后24h：取最后一个样品用于scfa分析；
[0102]
周五：清洁(实验在一周内进行)。
[0103]
结果
[0104]
在最后两个采样点之间(即，在插入试验品后8至24小时之间)乙酸累积绝对数量增加被视为指示远端结肠中scfa和乙酸增加。
[0105]
实验结果显示在下表1中。
[0106]
表1.tim-2实验的结果，使用接受2
’‑
fl的微生物群样品受试者。
[0107]
试验品乙酸产生*2
’‑
fl17mmol
[0108]
*乙酸的量是指在插入试验品后8小时至24小时内产生的量；代表远端结肠产生的乙酸和scfa的量。
[0109]
实验表明，在模型系统中插入2’fl(7.5克)导致远端结肠中乙酸生成量增加了17mmol。在tim-2模型系统中使用消瘦受试者和肥胖受试者的粪便微生物群样品时，均观察到了乙酸生成量增加。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
