1.本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种盐酸二甲双胍缓释片的含量测定方法。
背景技术：
：：2.盐酸二甲双胍，cas号为15537-72-1，其化学结构如下式i所示：[0003][0004]中国药典中收载有《盐酸二甲双胍片》、《盐酸二甲双胍肠溶片》、《盐酸二甲双胍胶囊》、《盐酸二甲双胍肠溶胶囊》，含量检测时均是用水相对二甲双胍进行提取，不适用于含有遇水易结团的缓释材料制剂的提取；且采用紫外法检测分析误差大。美国药典中《metforminhydrochlorideextended-releasetablets》收录的含量方法采用均质机进行提取，但是大多数工厂实验室并未配备均质机，不利于多批样品及中间产品含量均匀度的检测；且缓释制剂中常含有带羧基的辅料，与二甲双胍之间存在离子相互作用，采用美国药典的方法二甲双胍无法被完全提取。因此，需要开发一种准确度高、操作简单的盐酸二甲双胍含量检测方法。[0005]本发明在美国药典方法的基础上进行了改进，显著提高了盐酸二甲双胍含量检测方法的准确度。技术实现要素：[0006]本发明的目的在于提供一种盐酸二甲双胍的含量检测方法。本发明的方法能够快速有效检测盐酸二甲双胍缓释片中盐酸二甲双胍的含量，方法的准确度高，专属性好，出峰时间快，可用于盐酸二甲双胍缓释片的质量控制。[0007]一种缓释片中盐酸二甲双胍的含量测定方法，其中，供试品溶液的配制包括以下步骤：先加入乙腈，再加入精氨酸；提取方式为超声法；其中，所述盐酸二甲双胍与所述精氨酸的重量比为15:1～1.25:1。[0008]在一些实施方式中，所述测定方法还包括：含量测定采用磨粉法投样，或者采用先将盐酸二甲双胍缓释片敲碎再全量转移的方法投样。[0009]在一些实施方式中，盐酸二甲双胍供试品溶液的配制，可包括以下步骤或按以下步骤实现：[0010](1)将盐酸二甲双胍缓释片研磨至粉状，精密称定；[0011](2)加入乙腈，振摇使片粉分散；[0012](3)加入精氨酸或精氨酸溶液，振摇使片粉均匀分散；[0013](4)任选地加入稀释剂，超声。[0014]在一些实施方式中，盐酸二甲双胍供试品溶液的配制，可包括以下步骤或按以下步骤实现：[0015](1)将盐酸二甲双胍缓释片研磨至粉状，精密称定后置干燥量瓶中；[0016](2)加入乙腈，振摇使片粉分散；[0017](3)加入精氨酸溶液，振摇使片粉均匀分散；[0018](4)任选地加入稀释剂，超声。[0019]在一些实施例中，所述稀释剂可以为乙腈和水的混合溶剂。在一些实施例中，所述混合溶剂中乙腈和水的体积比可以为50:50。在一些实施例中，所述超声时长为20min～40min。[0020]在一些实施方式中，流动相分为流动相a和流动相b，流动相a为乙腈，流动相b为缓冲液所述缓冲液的ph为3.5～4.5，优选3.65～4.05，更优选3.85。在一些实施例中，所述流动相b的ph为3.85；在一些实施例中，所述流动相b的ph为3.65；在一些实施例中，所述流动相b的ph为4.05。[0021]所述流动相b为庚烷磺酸钠，氯化钠，磷酸和水配制成的缓冲液。在一些实施方式中，所述流动相b的配制，包括：将庚烷磺酸钠和氯化钠溶于水中，用磷酸调节ph至3.5～4.5。[0022]在一些实施方式中，所述流动相a和所述流动相b的体积比为9:91～13:87。在一些实施方式中，所述流动相a和所述流动相b的体积比为10:90～12:88，优选11:89。在一些实施例中，所述流动相a和所述流动相b的体积比为11:89，9:91，12:88，或者13:87。[0023]在一些实施方式中，所述盐酸二甲双胍与精氨酸的重量比为15:1～1.25:1，优选12:1～3:1，更优选10:1。在一些实施方式中，所述盐酸二甲双胍与精氨酸的重量比为12:1～5:1；在一些实施方式中，所述盐酸二甲双胍与精氨酸的重量比为12:1～8:1；在一些实施方式中，所述盐酸二甲双胍与精氨酸的重量比为11:1～6:1；在一些实施方式中，所述盐酸二甲双胍与精氨酸的重量比为10:1～3:1；在一些实施方式中，所述盐酸二甲双胍与精氨酸的重量比为10:1～6:1。在一些实施例中，所述盐酸二甲双胍与精氨酸的重量比为10:1，15:1，2.5:1，或者1.25:1。[0024]在一些实施方式中，色谱柱选自watersμbondapaktmc18柱和cosmosil5c18-paq柱中的一种。在一些实施例中，色谱柱选自watersμbondapaktmc18柱；在一些实施例中，色谱柱选自cosmosil5c18-paq柱。[0025]在一些实施方式中，所述盐酸二甲双胍缓释制剂种盐酸二甲双胍的含量测定方法，可包括以下步骤或按以下步骤实现：[0026](1)配制供试品溶液；[0027](2)设置仪器参数：检测器、色谱柱、波长、流动相的流速、柱温；[0028](3)取一定量步骤(1)的供试品溶液，注入高效液相色谱仪中，完成盐酸二甲双胍的含量测定。[0029]步骤(2)中，波长可为213nm～223nm。在一些实施例中，波长为218nm。[0030]步骤(2)中，所述流动相的流速可为0.5ml/min～1.5ml/min。在一些实施例中，流动相的流速为1ml/min；在一些实施例中，流动相的流速为0.8ml/min或者1.2ml/min。[0031]步骤(2)中，色谱柱柱箱温度为25℃～35℃。在一些实施例中，色谱柱柱箱温度为30℃；在一些实施例中，色谱柱柱箱温度为25℃或者35℃。[0032]步骤(3)中，所述供试品溶液进样量可为5μl～15μl。在一些实施例中，所述样品溶液进样量为10μl。[0033]在一些实施例中，所述盐酸二甲双胍的含量测定方法，包括以下步骤或可按以下步骤实现：[0034](1)配置盐酸二甲双胍缓释片供试品溶液；[0035]2)设置流动相的流速为0.5ml/min-1.5ml/min，色谱柱为watersμbondapaktmc18柱或者cosmosil5c18-paq柱，色谱柱柱箱温度为25℃-35℃；[0036](3)取步骤(1)的样品溶液5μl-15μl，注入高效液相色谱仪中，完成盐酸二甲双胍含量的测定。[0037]高效液相色谱仪可为美国agilent1260型高效液相色谱系统及工作站或其他适宜可行的系统。[0038]在上文或下文的内容中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。基于公开的数字，每一个数字的数值有可能会出现±1％、±2％、±5％、±7％、±8％或±10％等差异。附图说明[0039]图1为实施例1中供试品溶液、对照品溶液、空白辅料溶液、空白溶液的色谱图；[0040]图2为实施例8中使用不同色谱柱的色谱图。具体实施方式[0041]本发明实施例中，按照以下公式计算供试品溶液中盐酸二甲双胍的含量：[0042][0043]式中：[0044]wstd1：对照品溶液1中盐酸二甲双胍的称样量，mg；[0045]pstd1：为盐酸二甲双胍对照品含量，％；[0046]vstd1：为对照品溶液1稀释倍数，ml；[0047]astd1：对照品溶液1色谱图中主峰峰面积的平均值；[0048]ai：为供试品溶液色谱图中主峰峰面积；[0049]w：供试品溶液片粉的称样量，mg；[0050]mp：供试品溶液平均片重，mg；[0051]v：为供试品溶液稀释倍数，ml；[0052]l：盐酸二甲双胍缓释片标示量。[0053]本发明实施例中，按照以下公式计算供试品溶液中盐酸二甲双胍的含量均匀度：[0054][0055]式中：[0056]ax：供试品溶液主峰峰面积；[0057]astd1：对照品溶液1主峰峰面积的平均值(供试品溶液前后各一针)；[0058]wstd1：对照品溶液1中盐酸二甲双胍对照品称样量，mg；[0059]p：盐酸二甲双胍对照品的含量，％；[0060]dstd1：对照品溶液稀释体积，ml；[0061]dx：供试品溶液的稀释体积；[0062]l：盐酸二甲双胍缓释片标示量。[0063]本发明中，μm指微米，nm指纳米，μl微升，ml指毫升，min指分钟，℃指摄氏度，mg指毫克，rpm指转/分钟，rsd指相对标准偏差。[0064]本发明实施例通用方法如下：[0065]1、仪器与条件[0066]仪器：美国agilent1260型高效液相色谱系统及工作站；自动进样。[0067]色谱柱：watersμbondapaktmc18，3.9×300mm，10μm，或者cosmosil5c18-paq，4.6×250mm，5μm；[0068]检测器：紫外；[0069]检测波长：218nm；[0070]流速：1.0ml/min；[0071]柱温：30℃；[0072]进样量：10μl；[0073]流动相a：乙腈；[0074]流动相b：ph为约3.85的缓冲液；[0075]洗脱比例：流动相a：流动相b＝11:89(v:v)；[0076]运行时间：15min。[0077]2、流动相配制[0078](1)0.06m磷酸：量取3.5ml磷酸(此体积是按100％磷酸计算)，用水稀释至1l，混匀，即得；[0079](2)ph为约3.85的缓冲液(流动相b)：称取0.5g庚烷磺酸钠和0.5g氯化钠溶于1l超纯水中，用(1)得到的0.06m磷酸调节ph至3.85，抽滤，即得；[0080](3)流动相：量取乙腈(流动相a)和流动相b，按流动相a与流动相b的体积比为11:89(v:v)的比例混匀，超声脱气，即得。[0081]3、含量检测各溶液配制[0082](1)空白溶液：量取60ml乙腈，称取精氨酸约18mg，用超纯水稀释至1l，混匀，即得。[0083](2)稀释剂：乙腈-水＝50-50(v:v)，按50:50的体积比量取乙腈和水，混匀，即得。[0084](3)精氨酸溶液：取精氨酸750mg，精密称定，置500ml量瓶中，加入水溶解并定容得精氨酸溶液(精氨酸浓度为1.5mg/ml)。可以根据实验需要进行体积调整。[0085](4)杂质储备液：分别取有关物质b和c对照品约2.5mg，精密称定置200ml量瓶中，加(1)所得空白溶液溶解并定容，摇匀，即得浓度约为12.5μg/ml的有关物质b和有关物质c储备液。[0086](5)系统适用性溶液：精密称取盐酸二甲双胍对照品约37.5mg于200ml容量瓶中，并精密移取杂质储备液2ml至量瓶中，用稀释剂溶解定容，摇匀，即得。[0087](6)对照品溶液：精密称取盐酸二甲双胍对照品约36mg，置200ml量瓶中，加乙腈12ml，精氨酸溶液2.4ml,用水溶解定容，摇匀，即得浓度约为0.18mg/ml的对照品溶液。平行配制2份。精氨酸浓度为0.018mg/ml。[0088](7)供试品溶液-含量检测：取盐酸二甲双胍缓释片10片，精密称定，充分研细，取片粉约1050mg(约相当于盐酸二甲双胍750mg)，精密称定，置500ml干燥量瓶中，加乙腈50ml，振摇使片粉分散后加入(3)所得精氨酸溶液50ml(边加边振摇，使片粉分散均匀，防止粘团)，再加入(2)所得稀释剂至80％体积处，超声30min，加入(2)所得稀释剂稀释至刻度，摇匀，离心(或滤膜过滤)，取上清液。精密移取上清液3ml至25ml量瓶中，用超纯水定容，摇匀，即得浓度约为0.18mg/ml的盐酸二甲双胍供试品溶液，精氨酸浓度约为0.018mg/ml。平行配制2份。[0089](8)供试品溶液-含量均匀度检测：取盐酸二甲双胍缓释片1片，精密称定，用称量纸包裹后充分敲碎，转移至500ml干燥量瓶中，加入50ml乙腈，振摇使颗粒分散，加入(3)所得精氨酸溶液50ml(边加边振摇，使片粉分散均匀，防止粘团)，再加入(2)所得稀释剂至80％量瓶体积处，超声30min，冷却至室温，加(2)所得稀释剂定容，摇匀，离心(或滤膜过滤)，取上清液3ml至25ml量瓶中，用超纯水定容，摇匀，即得。(精氨酸浓度约为0.018mg/ml，500mg规格供试品溶液浓度约为0.12mg/ml，750mg规格供试品溶液浓度约为0.18mg/ml。)[0090]实施例1[0091]按照实施例通用方法3(1)、3(6)、3(7)分别配制空白溶液、对照品溶液、和供试品溶液，再配制空白辅料溶液，配制方法如下：取盐酸二甲双胍缓释片空白辅料约150mg(相当于盐酸二甲双胍375mg对应的辅料量)，精密称定，置250ml干燥量瓶中，加乙腈25ml，振摇使片粉分散后加精氨酸溶液(按照实施例通用方法3(3)配制)25ml(边加水边振摇，使片粉分散均匀，防止粘团)加50％乙腈水溶液至约80％量瓶体积处，超声30min，放冷，加50％乙腈水溶液稀释至刻度，摇匀，离心。精密移取上清液3ml至25ml量瓶中，用超纯水定容，摇匀，即得。[0092]分别取上述空白溶液、空白辅料溶液、对照品溶液、供试品溶液，按实施例通用方法1的仪器与条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图1。[0093]结果显示，对照品溶液和供试品溶液中，盐酸二甲双胍的特征峰在8分钟之前出峰，出峰快，分离度好，拖尾因子接近1。[0094]实施例2[0095]按照实施例通用方法3(1)、3(6)、3(7)分别配制空白溶液、对照品溶液(2份)、和供试品溶液(6份，测含量)。[0096]分别取上述空白溶液、对照品溶液、供试品溶液，按实施例通用方法1的仪器与条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图峰面积，按外标法计算含量，结果见表1。[0097]表1：[0098][0099]结果显示，盐酸二甲双胍缓释片6份供试品溶液中，盐酸二甲双胍的含量均接近100％，rsd值较小，重复性好。[0100]实施例3[0101]按照实施例通用方法3(1)、3(6)、3(8)分别配制空白溶液、对照品溶液(2份)、和供试品溶液(盐酸二甲双胍缓释片分别于压片开始、中间、结束取样，每份样品配制供试品溶液3份，测含量均匀度)。[0102]分别取上述空白溶液、对照品溶液、供试品溶液，按实施例通用方法1的仪器与条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图峰面积，按外标法计算含量，结果见表2。[0103]表2：[0104][0105]结果显示，盐酸二甲双胍缓释片分别于压片开始、中间、结束取出的样品中，盐酸二甲双胍的含量均接近100％，rsd值较小，重复性好。[0106]实施例4供试品溶液不同配制方法考察[0107]供试品溶液配制方法a:取盐酸二甲双胍缓释片10片，精密称定，充分研细，取片粉适量精密称定，置500ml干燥量瓶中，加乙腈50ml，振摇使片粉分散后加超纯水适量(溶剂为量瓶体积的3/5)，超声30min，加超纯水稀释至刻度，离心，精密移取2.5ml上清液于20ml容量瓶中，超纯水定容，摇匀，即得终浓度0.1875mg/ml的盐酸二甲双胍。[0108]供试品溶液配制方法b(低ph溶液破坏提取):取盐酸二甲双胍缓释片1片，精密称定，用称量纸包住后充分敲碎，置于500ml干燥量瓶中，加乙腈50ml，摇匀使片粉分散后，加0.1mhcl缓冲液至量瓶体积3/5处，超声30min，取出放冷至室温，加0.1mhcl缓冲液稀释至刻度，摇匀，离心(10000rpm，10min)，精密移取上清液2.5ml至20ml量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀，即得。[0109]供试品溶液配制方法c(高盐低ph溶液提取):取盐酸二甲双胍缓释片5片，精密称定，充分研细，取片粉约525mg(约相当于盐酸二甲双胍375mg)置于250ml干燥量瓶中，加乙腈25ml，摇匀使片粉分散后，加0.3m磷酸二氢钾缓冲液至量瓶体积3/5处，超声30min，取出放冷至室温，加0.3m磷酸二氢钾缓冲液稀释至刻度，摇匀，离心(10000rpm，10min)，精密移取上清液2.5ml至20ml量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀，即得。其中，0.3m磷酸二氢钾缓冲液的配制方法为：称取磷酸二氢钾40.99g于1l纯化水中，搅拌溶解后，磷酸调节ph至2.31，即得。[0110]供试品溶液配制方法d(加类似物竞争提取):取盐酸二甲双胍缓释片5片，精密称定，充分研细，取片粉约525mg(约相当于盐酸二甲双胍375mg)置于250ml干燥量瓶中，加乙腈25ml，摇匀使片粉分散后，加纯化水适量，超声30min，称取二甲胺约20mg加入其中，超声溶解10min，取出放冷，加超纯水稀释至刻度，摇匀，离心(10000rpm，10min)，精密移取上清液2.5ml至20ml量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀，即得。[0111]按照实施例通用方法3(7)分别配制供试品溶液。[0112]分别取上述5种方法配制得到的供试品溶液，按实施例通用方法1的仪器与条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图峰面积，按外标法计算含量，结果见表3。[0113]表3：[0114][0115]结果显示，方法b、方法c和方法d均无法完全提取出盐酸二甲双胍，方法a虽然先加入乙腈，但辅料容易成团，且难以消除成团，不可控，成团的程度会影响含量提取，会导致含量偏低及重现性差，且通过文献调研可知盐酸二甲双胍和羧甲基淀粉钠(缓释片中的一种辅料)会产生电荷相互作用，导致盐酸二甲双胍难以完全提取。加入10％浓度的精氨酸溶液和盐酸二甲双胍竞争羧甲基淀粉钠的结合位点，使盐酸二甲双胍完全提取，同时保证结果重现。[0116]实施例5供试品溶液配制中，不同提取方式及超声时间考察[0117](1)不同提取方式考察[0118]供试品溶液的配制方法：取二甲双胍缓释片粉适量(约相当于盐酸二甲双胍375mg)，精密称定，置250ml干燥量瓶中，加乙腈50ml，振摇使片粉分散后加精氨酸溶液(按照实施例通用方法3(3)配制)50ml(边加水边振摇，使片粉分散均匀，防止粘团)，再加入50％乙腈水溶液至80％体积处，超声30min、或振摇30min、或用均质机均质，加入50％乙腈水稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液。精密移取上清液6ml至50ml量瓶中，用超纯水定容，摇匀，即得。其中均质操作如下：5个脉冲，每次5s，转速20,000rpm，浸泡2min；重复上述操作3次。[0119]分别取上述3种提取方式配制得到的供试品溶液，按实施例通用方法1的仪器与条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图峰面积，按外标法计算含量，结果见表4。[0120]表4：[0121][0122]结果显示，振摇法和均质机法容易产生气泡，导致移液时实际移取体积偏低而使含量偏低，且均质法中均质机使用不方便，操作复杂，存在片粉粘底而提取不完全的情况。所以本发明供试品溶液配制，采用超声法提取。[0123](2)超声时间考察[0124]供试品溶液的配制方法：取二甲双胍缓释片片粉当于盐酸二甲双胍375mg)，精密称定，置250ml干燥量瓶中，加乙腈50ml，振摇使片粉分散后加精氨酸溶液(按照实施例通用方法3(3)配制)50ml(边加水边振摇，使片粉分散均匀，防止粘团)，再加入50％乙腈水溶液至80％体积处，超声30min、或超声60min，加入50％乙腈水稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液。精密移取上清液6ml至50ml量瓶中，用超纯水定容，摇匀，即得。[0125]分别取上述2种不同超声时间配制得到的供试品溶液，按实施例通用方法1的仪器与条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图峰面积，按外标法计算含量，结果见表5。[0126]表5：[0127][0128]结果显示，超声时间延长至60min，含量未提高，说明30min已经提取完全。[0129]实施例6供试品溶液配制中，盐酸二甲双胍与精氨酸的重量比、精氨酸加入方式考察[0130]供试品溶液的配制方法：称取二甲双胍缓释片片粉约525mg(约相当于盐酸二甲双胍375mg)，精密称定，置250ml干燥量瓶中，加乙腈50ml，振摇使片粉分散后加精氨酸溶液50ml(精氨酸溶液的配制：分别称取精氨酸约25、75、150、300mg、375mg于500ml容量瓶中，加水溶解并稀释定容至刻度，摇匀，即得0.75mg/ml精氨酸溶液)(边加水边振摇，使片粉分散均匀，防止粘团)，再加入50％乙腈水溶液至80％体积处，超声30min，加入50％乙腈水稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液。精密移取上清液6ml至50ml量瓶中，用超纯水定容，摇匀，即得。[0131]供试品溶液的配制方法(1)：称取片粉约取片粉约525mg(约相当于盐酸二甲双胍375mg)，精密称定，置250ml干燥量瓶中，分别称取精氨酸约12.5、18.8、25、37.5、75、150、300、750、3750mg于前述250ml容量瓶中，加乙腈50ml，振摇使片粉分散后加超纯水50ml，再加入50％乙腈水溶液至80％体积处，超声30min，放冷，加入50％乙腈水稀释至刻度，摇匀，平行配制两份。离心(或过滤)，取上清液。精密移取上清液3ml至2.5ml量瓶中，用超纯水定容，摇匀，即得。[0132]供试品溶液的配制方法(2)：[0133]精氨酸溶液：取精氨酸25、37.5、50、75、150、300、600、1500、7500mg，精密称定，置100ml量瓶中，加入水溶解并定容得精氨酸溶液(精氨酸浓度为0.25、0.375、0.5、0.75、1.5、3、6、15、75mg/ml)。[0134]供试品溶液：称取片粉约取片粉约525mg(约相当于盐酸二甲双胍375mg)，精密称定，置250ml干燥量瓶中，加乙腈50ml，振摇使片粉分散后，分别加50ml各浓度的精氨酸溶液，(边加水边振摇，使片粉分散均匀，防止粘团)，再加入50％乙腈水溶液至80％体积处，超声30min，加入50％乙腈水稀释至刻度，摇匀，平行配制两份。离心(或过滤)，取上清液。精密移取上清液3ml至25ml量瓶中，用超纯水定容，摇匀，即得。[0135]分别取上述几种按照盐酸二甲双胍和精氨酸不同重量比配制得到的供试品溶液，按实施例通用方法1的仪器与条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图峰面积，按外标法计算含量，结果见表6。[0136]表6：[0137][0138]结果显示：1、精氨酸以固体和液体形式加入，对含量提取几乎无影响，采用溶液的方式加入更易于操作；2、盐酸二甲双胍与加入精氨酸的重量比为15:1～1.25:1时，效果更好。[0139]实施例7流动相配制中，流动相a与流动相b的体积比、缓冲液中缓冲盐的浓度范围、缓冲液ph范围考察[0140]ph为约3.85的缓冲液(流动相b)配制：称取0.5g庚烷磺酸钠和0.5g氯化钠溶于1l超纯水中，用0.06m磷酸(按照实施例通用方法2(1)配制)调节ph至3.85(或者3.65、或者4.03)，抽滤，即得。另配制缓冲盐的浓度分别为90％和110％的缓冲液各1份。[0141]流动相配制：量取乙腈(流动相a)和流动相b，按流动相a与流动相b的体积比分别为9:91、11:89、12:88混匀，超声脱气，即得。[0142]按照实施例通用方法3(7)配制得供试品溶液，分别在上述几种流动相条件下进行高效液相色谱分析，记录主峰拖尾因子及主峰与杂质的分离度，结果见表7。[0143]表7：[0144][0145][0146]结果显示：1、在ph为约3.85的缓冲液条件下，流动相a与流动相b的体积比为15:85时，杂质b峰面积rsd(％)接近10，风险较高，流动相a与流动相b的体积比为7:93时，主峰分叉为两个峰，因此，流动相a与流动相b的体积比可在9:91-13:87变化；[0147]2、在流动相a与流动相b的体积比为11:89条件下，缓冲液中缓冲盐的浓度可在±10％范围内变换；[0148]3、在流动相a与流动相b的体积比为11:89条件下，缓冲液的ph可在4.03-3.65的范围内变化。[0149]实施例8高效液相色谱条件中，色谱柱、柱温、流速考察[0150]选用4种色谱柱：[0151]merckkgaastarrp-18e，4.6×150mm，5um；[0152]cosmosil5c18-paq，4.6×250mm，5μm；[0153]ymc-packods-am，4.6×250mm，5um；[0154]watersμbondapaktmc18，3.9×300mm，10μm。[0155]按照实施例通用方法3(7)配制得供试品溶液，流动相按照实施例通用方法2配制，分别使用上述4种色谱柱进行高效液相色谱分析，记录主峰拖尾因子及主峰与杂质的分离度，结果见表8和图2。[0156]表8：[0157][0158][0159]结果显示，色谱柱ymc-packods-am,4.6×250mm,5um和merckkgaastarrp-18e,4.6×150mm,5um主峰拖尾因子＞2.0，不符合可接受标准。[0160]按照实施例通用方法3(7)配制得供试品溶液，流动相按照实施例通用方法2配制，分别采用25℃柱温、30℃柱温、35℃柱温和0.8ml/min流速、1.0ml/min流速、1.2ml/min流速进行高效液相色谱分析，记录主峰拖尾因子及主峰与杂质的分离度，结果见表9。[0161]表9：[0162][0163]结果显示，流速在0.8ml/min-1.2ml/min变化，柱温在25℃-35℃变化，检测结果均符合可接受标准。[0164]本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。[0165]在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“一些实施方式”、“一些实施方案”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。[0166]尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页12当前第1页12
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：：2.盐酸二甲双胍，cas号为15537-72-1，其化学结构如下式i所示：[0003][0004]中国药典中收载有《盐酸二甲双胍片》、《盐酸二甲双胍肠溶片》、《盐酸二甲双胍胶囊》、《盐酸二甲双胍肠溶胶囊》，含量检测时均是用水相对二甲双胍进行提取，不适用于含有遇水易结团的缓释材料制剂的提取；且采用紫外法检测分析误差大。美国药典中《metforminhydrochlorideextended-releasetablets》收录的含量方法采用均质机进行提取，但是大多数工厂实验室并未配备均质机，不利于多批样品及中间产品含量均匀度的检测；且缓释制剂中常含有带羧基的辅料，与二甲双胍之间存在离子相互作用，采用美国药典的方法二甲双胍无法被完全提取。因此，需要开发一种准确度高、操作简单的盐酸二甲双胍含量检测方法。[0005]本发明在美国药典方法的基础上进行了改进，显著提高了盐酸二甲双胍含量检测方法的准确度。技术实现要素：[0006]本发明的目的在于提供一种盐酸二甲双胍的含量检测方法。本发明的方法能够快速有效检测盐酸二甲双胍缓释片中盐酸二甲双胍的含量，方法的准确度高，专属性好，出峰时间快，可用于盐酸二甲双胍缓释片的质量控制。[0007]一种缓释片中盐酸二甲双胍的含量测定方法，其中，供试品溶液的配制包括以下步骤：先加入乙腈，再加入精氨酸；提取方式为超声法；其中，所述盐酸二甲双胍与所述精氨酸的重量比为15:1～1.25:1。[0008]在一些实施方式中，所述测定方法还包括：含量测定采用磨粉法投样，或者采用先将盐酸二甲双胍缓释片敲碎再全量转移的方法投样。[0009]在一些实施方式中，盐酸二甲双胍供试品溶液的配制，可包括以下步骤或按以下步骤实现：[0010](1)将盐酸二甲双胍缓释片研磨至粉状，精密称定；[0011](2)加入乙腈，振摇使片粉分散；[0012](3)加入精氨酸或精氨酸溶液，振摇使片粉均匀分散；[0013](4)任选地加入稀释剂，超声。[0014]在一些实施方式中，盐酸二甲双胍供试品溶液的配制，可包括以下步骤或按以下步骤实现：[0015](1)将盐酸二甲双胍缓释片研磨至粉状，精密称定后置干燥量瓶中；[0016](2)加入乙腈，振摇使片粉分散；[0017](3)加入精氨酸溶液，振摇使片粉均匀分散；[0018](4)任选地加入稀释剂，超声。[0019]在一些实施例中，所述稀释剂可以为乙腈和水的混合溶剂。在一些实施例中，所述混合溶剂中乙腈和水的体积比可以为50:50。在一些实施例中，所述超声时长为20min～40min。[0020]在一些实施方式中，流动相分为流动相a和流动相b，流动相a为乙腈，流动相b为缓冲液所述缓冲液的ph为3.5～4.5，优选3.65～4.05，更优选3.85。在一些实施例中，所述流动相b的ph为3.85；在一些实施例中，所述流动相b的ph为3.65；在一些实施例中，所述流动相b的ph为4.05。[0021]所述流动相b为庚烷磺酸钠，氯化钠，磷酸和水配制成的缓冲液。在一些实施方式中，所述流动相b的配制，包括：将庚烷磺酸钠和氯化钠溶于水中，用磷酸调节ph至3.5～4.5。[0022]在一些实施方式中，所述流动相a和所述流动相b的体积比为9:91～13:87。在一些实施方式中，所述流动相a和所述流动相b的体积比为10:90～12:88，优选11:89。在一些实施例中，所述流动相a和所述流动相b的体积比为11:89，9:91，12:88，或者13:87。[0023]在一些实施方式中，所述盐酸二甲双胍与精氨酸的重量比为15:1～1.25:1，优选12:1～3:1，更优选10:1。在一些实施方式中，所述盐酸二甲双胍与精氨酸的重量比为12:1～5:1；在一些实施方式中，所述盐酸二甲双胍与精氨酸的重量比为12:1～8:1；在一些实施方式中，所述盐酸二甲双胍与精氨酸的重量比为11:1～6:1；在一些实施方式中，所述盐酸二甲双胍与精氨酸的重量比为10:1～3:1；在一些实施方式中，所述盐酸二甲双胍与精氨酸的重量比为10:1～6:1。在一些实施例中，所述盐酸二甲双胍与精氨酸的重量比为10:1，15:1，2.5:1，或者1.25:1。[0024]在一些实施方式中，色谱柱选自watersμbondapaktmc18柱和cosmosil5c18-paq柱中的一种。在一些实施例中，色谱柱选自watersμbondapaktmc18柱；在一些实施例中，色谱柱选自cosmosil5c18-paq柱。[0025]在一些实施方式中，所述盐酸二甲双胍缓释制剂种盐酸二甲双胍的含量测定方法，可包括以下步骤或按以下步骤实现：[0026](1)配制供试品溶液；[0027](2)设置仪器参数：检测器、色谱柱、波长、流动相的流速、柱温；[0028](3)取一定量步骤(1)的供试品溶液，注入高效液相色谱仪中，完成盐酸二甲双胍的含量测定。[0029]步骤(2)中，波长可为213nm～223nm。在一些实施例中，波长为218nm。[0030]步骤(2)中，所述流动相的流速可为0.5ml/min～1.5ml/min。在一些实施例中，流动相的流速为1ml/min；在一些实施例中，流动相的流速为0.8ml/min或者1.2ml/min。[0031]步骤(2)中，色谱柱柱箱温度为25℃～35℃。在一些实施例中，色谱柱柱箱温度为30℃；在一些实施例中，色谱柱柱箱温度为25℃或者35℃。[0032]步骤(3)中，所述供试品溶液进样量可为5μl～15μl。在一些实施例中，所述样品溶液进样量为10μl。[0033]在一些实施例中，所述盐酸二甲双胍的含量测定方法，包括以下步骤或可按以下步骤实现：[0034](1)配置盐酸二甲双胍缓释片供试品溶液；[0035]2)设置流动相的流速为0.5ml/min-1.5ml/min，色谱柱为watersμbondapaktmc18柱或者cosmosil5c18-paq柱，色谱柱柱箱温度为25℃-35℃；[0036](3)取步骤(1)的样品溶液5μl-15μl，注入高效液相色谱仪中，完成盐酸二甲双胍含量的测定。[0037]高效液相色谱仪可为美国agilent1260型高效液相色谱系统及工作站或其他适宜可行的系统。[0038]在上文或下文的内容中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。基于公开的数字，每一个数字的数值有可能会出现±1％、±2％、±5％、±7％、±8％或±10％等差异。附图说明[0039]图1为实施例1中供试品溶液、对照品溶液、空白辅料溶液、空白溶液的色谱图；[0040]图2为实施例8中使用不同色谱柱的色谱图。具体实施方式[0041]本发明实施例中，按照以下公式计算供试品溶液中盐酸二甲双胍的含量：[0042][0043]式中：[0044]wstd1：对照品溶液1中盐酸二甲双胍的称样量，mg；[0045]pstd1：为盐酸二甲双胍对照品含量，％；[0046]vstd1：为对照品溶液1稀释倍数，ml；[0047]astd1：对照品溶液1色谱图中主峰峰面积的平均值；[0048]ai：为供试品溶液色谱图中主峰峰面积；[0049]w：供试品溶液片粉的称样量，mg；[0050]mp：供试品溶液平均片重，mg；[0051]v：为供试品溶液稀释倍数，ml；[0052]l：盐酸二甲双胍缓释片标示量。[0053]本发明实施例中，按照以下公式计算供试品溶液中盐酸二甲双胍的含量均匀度：[0054][0055]式中：[0056]ax：供试品溶液主峰峰面积；[0057]astd1：对照品溶液1主峰峰面积的平均值(供试品溶液前后各一针)；[0058]wstd1：对照品溶液1中盐酸二甲双胍对照品称样量，mg；[0059]p：盐酸二甲双胍对照品的含量，％；[0060]dstd1：对照品溶液稀释体积，ml；[0061]dx：供试品溶液的稀释体积；[0062]l：盐酸二甲双胍缓释片标示量。[0063]本发明中，μm指微米，nm指纳米，μl微升，ml指毫升，min指分钟，℃指摄氏度，mg指毫克，rpm指转/分钟，rsd指相对标准偏差。[0064]本发明实施例通用方法如下：[0065]1、仪器与条件[0066]仪器：美国agilent1260型高效液相色谱系统及工作站；自动进样。[0067]色谱柱：watersμbondapaktmc18，3.9×300mm，10μm，或者cosmosil5c18-paq，4.6×250mm，5μm；[0068]检测器：紫外；[0069]检测波长：218nm；[0070]流速：1.0ml/min；[0071]柱温：30℃；[0072]进样量：10μl；[0073]流动相a：乙腈；[0074]流动相b：ph为约3.85的缓冲液；[0075]洗脱比例：流动相a：流动相b＝11:89(v:v)；[0076]运行时间：15min。[0077]2、流动相配制[0078](1)0.06m磷酸：量取3.5ml磷酸(此体积是按100％磷酸计算)，用水稀释至1l，混匀，即得；[0079](2)ph为约3.85的缓冲液(流动相b)：称取0.5g庚烷磺酸钠和0.5g氯化钠溶于1l超纯水中，用(1)得到的0.06m磷酸调节ph至3.85，抽滤，即得；[0080](3)流动相：量取乙腈(流动相a)和流动相b，按流动相a与流动相b的体积比为11:89(v:v)的比例混匀，超声脱气，即得。[0081]3、含量检测各溶液配制[0082](1)空白溶液：量取60ml乙腈，称取精氨酸约18mg，用超纯水稀释至1l，混匀，即得。[0083](2)稀释剂：乙腈-水＝50-50(v:v)，按50:50的体积比量取乙腈和水，混匀，即得。[0084](3)精氨酸溶液：取精氨酸750mg，精密称定，置500ml量瓶中，加入水溶解并定容得精氨酸溶液(精氨酸浓度为1.5mg/ml)。可以根据实验需要进行体积调整。[0085](4)杂质储备液：分别取有关物质b和c对照品约2.5mg，精密称定置200ml量瓶中，加(1)所得空白溶液溶解并定容，摇匀，即得浓度约为12.5μg/ml的有关物质b和有关物质c储备液。[0086](5)系统适用性溶液：精密称取盐酸二甲双胍对照品约37.5mg于200ml容量瓶中，并精密移取杂质储备液2ml至量瓶中，用稀释剂溶解定容，摇匀，即得。[0087](6)对照品溶液：精密称取盐酸二甲双胍对照品约36mg，置200ml量瓶中，加乙腈12ml，精氨酸溶液2.4ml,用水溶解定容，摇匀，即得浓度约为0.18mg/ml的对照品溶液。平行配制2份。精氨酸浓度为0.018mg/ml。[0088](7)供试品溶液-含量检测：取盐酸二甲双胍缓释片10片，精密称定，充分研细，取片粉约1050mg(约相当于盐酸二甲双胍750mg)，精密称定，置500ml干燥量瓶中，加乙腈50ml，振摇使片粉分散后加入(3)所得精氨酸溶液50ml(边加边振摇，使片粉分散均匀，防止粘团)，再加入(2)所得稀释剂至80％体积处，超声30min，加入(2)所得稀释剂稀释至刻度，摇匀，离心(或滤膜过滤)，取上清液。精密移取上清液3ml至25ml量瓶中，用超纯水定容，摇匀，即得浓度约为0.18mg/ml的盐酸二甲双胍供试品溶液，精氨酸浓度约为0.018mg/ml。平行配制2份。[0089](8)供试品溶液-含量均匀度检测：取盐酸二甲双胍缓释片1片，精密称定，用称量纸包裹后充分敲碎，转移至500ml干燥量瓶中，加入50ml乙腈，振摇使颗粒分散，加入(3)所得精氨酸溶液50ml(边加边振摇，使片粉分散均匀，防止粘团)，再加入(2)所得稀释剂至80％量瓶体积处，超声30min，冷却至室温，加(2)所得稀释剂定容，摇匀，离心(或滤膜过滤)，取上清液3ml至25ml量瓶中，用超纯水定容，摇匀，即得。(精氨酸浓度约为0.018mg/ml，500mg规格供试品溶液浓度约为0.12mg/ml，750mg规格供试品溶液浓度约为0.18mg/ml。)[0090]实施例1[0091]按照实施例通用方法3(1)、3(6)、3(7)分别配制空白溶液、对照品溶液、和供试品溶液，再配制空白辅料溶液，配制方法如下：取盐酸二甲双胍缓释片空白辅料约150mg(相当于盐酸二甲双胍375mg对应的辅料量)，精密称定，置250ml干燥量瓶中，加乙腈25ml，振摇使片粉分散后加精氨酸溶液(按照实施例通用方法3(3)配制)25ml(边加水边振摇，使片粉分散均匀，防止粘团)加50％乙腈水溶液至约80％量瓶体积处，超声30min，放冷，加50％乙腈水溶液稀释至刻度，摇匀，离心。精密移取上清液3ml至25ml量瓶中，用超纯水定容，摇匀，即得。[0092]分别取上述空白溶液、空白辅料溶液、对照品溶液、供试品溶液，按实施例通用方法1的仪器与条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图1。[0093]结果显示，对照品溶液和供试品溶液中，盐酸二甲双胍的特征峰在8分钟之前出峰，出峰快，分离度好，拖尾因子接近1。[0094]实施例2[0095]按照实施例通用方法3(1)、3(6)、3(7)分别配制空白溶液、对照品溶液(2份)、和供试品溶液(6份，测含量)。[0096]分别取上述空白溶液、对照品溶液、供试品溶液，按实施例通用方法1的仪器与条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图峰面积，按外标法计算含量，结果见表1。[0097]表1：[0098][0099]结果显示，盐酸二甲双胍缓释片6份供试品溶液中，盐酸二甲双胍的含量均接近100％，rsd值较小，重复性好。[0100]实施例3[0101]按照实施例通用方法3(1)、3(6)、3(8)分别配制空白溶液、对照品溶液(2份)、和供试品溶液(盐酸二甲双胍缓释片分别于压片开始、中间、结束取样，每份样品配制供试品溶液3份，测含量均匀度)。[0102]分别取上述空白溶液、对照品溶液、供试品溶液，按实施例通用方法1的仪器与条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图峰面积，按外标法计算含量，结果见表2。[0103]表2：[0104][0105]结果显示，盐酸二甲双胍缓释片分别于压片开始、中间、结束取出的样品中，盐酸二甲双胍的含量均接近100％，rsd值较小，重复性好。[0106]实施例4供试品溶液不同配制方法考察[0107]供试品溶液配制方法a:取盐酸二甲双胍缓释片10片，精密称定，充分研细，取片粉适量精密称定，置500ml干燥量瓶中，加乙腈50ml，振摇使片粉分散后加超纯水适量(溶剂为量瓶体积的3/5)，超声30min，加超纯水稀释至刻度，离心，精密移取2.5ml上清液于20ml容量瓶中，超纯水定容，摇匀，即得终浓度0.1875mg/ml的盐酸二甲双胍。[0108]供试品溶液配制方法b(低ph溶液破坏提取):取盐酸二甲双胍缓释片1片，精密称定，用称量纸包住后充分敲碎，置于500ml干燥量瓶中，加乙腈50ml，摇匀使片粉分散后，加0.1mhcl缓冲液至量瓶体积3/5处，超声30min，取出放冷至室温，加0.1mhcl缓冲液稀释至刻度，摇匀，离心(10000rpm，10min)，精密移取上清液2.5ml至20ml量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀，即得。[0109]供试品溶液配制方法c(高盐低ph溶液提取):取盐酸二甲双胍缓释片5片，精密称定，充分研细，取片粉约525mg(约相当于盐酸二甲双胍375mg)置于250ml干燥量瓶中，加乙腈25ml，摇匀使片粉分散后，加0.3m磷酸二氢钾缓冲液至量瓶体积3/5处，超声30min，取出放冷至室温，加0.3m磷酸二氢钾缓冲液稀释至刻度，摇匀，离心(10000rpm，10min)，精密移取上清液2.5ml至20ml量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀，即得。其中，0.3m磷酸二氢钾缓冲液的配制方法为：称取磷酸二氢钾40.99g于1l纯化水中，搅拌溶解后，磷酸调节ph至2.31，即得。[0110]供试品溶液配制方法d(加类似物竞争提取):取盐酸二甲双胍缓释片5片，精密称定，充分研细，取片粉约525mg(约相当于盐酸二甲双胍375mg)置于250ml干燥量瓶中，加乙腈25ml，摇匀使片粉分散后，加纯化水适量，超声30min，称取二甲胺约20mg加入其中，超声溶解10min，取出放冷，加超纯水稀释至刻度，摇匀，离心(10000rpm，10min)，精密移取上清液2.5ml至20ml量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀，即得。[0111]按照实施例通用方法3(7)分别配制供试品溶液。[0112]分别取上述5种方法配制得到的供试品溶液，按实施例通用方法1的仪器与条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图峰面积，按外标法计算含量，结果见表3。[0113]表3：[0114][0115]结果显示，方法b、方法c和方法d均无法完全提取出盐酸二甲双胍，方法a虽然先加入乙腈，但辅料容易成团，且难以消除成团，不可控，成团的程度会影响含量提取，会导致含量偏低及重现性差，且通过文献调研可知盐酸二甲双胍和羧甲基淀粉钠(缓释片中的一种辅料)会产生电荷相互作用，导致盐酸二甲双胍难以完全提取。加入10％浓度的精氨酸溶液和盐酸二甲双胍竞争羧甲基淀粉钠的结合位点，使盐酸二甲双胍完全提取，同时保证结果重现。[0116]实施例5供试品溶液配制中，不同提取方式及超声时间考察[0117](1)不同提取方式考察[0118]供试品溶液的配制方法：取二甲双胍缓释片粉适量(约相当于盐酸二甲双胍375mg)，精密称定，置250ml干燥量瓶中，加乙腈50ml，振摇使片粉分散后加精氨酸溶液(按照实施例通用方法3(3)配制)50ml(边加水边振摇，使片粉分散均匀，防止粘团)，再加入50％乙腈水溶液至80％体积处，超声30min、或振摇30min、或用均质机均质，加入50％乙腈水稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液。精密移取上清液6ml至50ml量瓶中，用超纯水定容，摇匀，即得。其中均质操作如下：5个脉冲，每次5s，转速20,000rpm，浸泡2min；重复上述操作3次。[0119]分别取上述3种提取方式配制得到的供试品溶液，按实施例通用方法1的仪器与条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图峰面积，按外标法计算含量，结果见表4。[0120]表4：[0121][0122]结果显示，振摇法和均质机法容易产生气泡，导致移液时实际移取体积偏低而使含量偏低，且均质法中均质机使用不方便，操作复杂，存在片粉粘底而提取不完全的情况。所以本发明供试品溶液配制，采用超声法提取。[0123](2)超声时间考察[0124]供试品溶液的配制方法：取二甲双胍缓释片片粉当于盐酸二甲双胍375mg)，精密称定，置250ml干燥量瓶中，加乙腈50ml，振摇使片粉分散后加精氨酸溶液(按照实施例通用方法3(3)配制)50ml(边加水边振摇，使片粉分散均匀，防止粘团)，再加入50％乙腈水溶液至80％体积处，超声30min、或超声60min，加入50％乙腈水稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液。精密移取上清液6ml至50ml量瓶中，用超纯水定容，摇匀，即得。[0125]分别取上述2种不同超声时间配制得到的供试品溶液，按实施例通用方法1的仪器与条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图峰面积，按外标法计算含量，结果见表5。[0126]表5：[0127][0128]结果显示，超声时间延长至60min，含量未提高，说明30min已经提取完全。[0129]实施例6供试品溶液配制中，盐酸二甲双胍与精氨酸的重量比、精氨酸加入方式考察[0130]供试品溶液的配制方法：称取二甲双胍缓释片片粉约525mg(约相当于盐酸二甲双胍375mg)，精密称定，置250ml干燥量瓶中，加乙腈50ml，振摇使片粉分散后加精氨酸溶液50ml(精氨酸溶液的配制：分别称取精氨酸约25、75、150、300mg、375mg于500ml容量瓶中，加水溶解并稀释定容至刻度，摇匀，即得0.75mg/ml精氨酸溶液)(边加水边振摇，使片粉分散均匀，防止粘团)，再加入50％乙腈水溶液至80％体积处，超声30min，加入50％乙腈水稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液。精密移取上清液6ml至50ml量瓶中，用超纯水定容，摇匀，即得。[0131]供试品溶液的配制方法(1)：称取片粉约取片粉约525mg(约相当于盐酸二甲双胍375mg)，精密称定，置250ml干燥量瓶中，分别称取精氨酸约12.5、18.8、25、37.5、75、150、300、750、3750mg于前述250ml容量瓶中，加乙腈50ml，振摇使片粉分散后加超纯水50ml，再加入50％乙腈水溶液至80％体积处，超声30min，放冷，加入50％乙腈水稀释至刻度，摇匀，平行配制两份。离心(或过滤)，取上清液。精密移取上清液3ml至2.5ml量瓶中，用超纯水定容，摇匀，即得。[0132]供试品溶液的配制方法(2)：[0133]精氨酸溶液：取精氨酸25、37.5、50、75、150、300、600、1500、7500mg，精密称定，置100ml量瓶中，加入水溶解并定容得精氨酸溶液(精氨酸浓度为0.25、0.375、0.5、0.75、1.5、3、6、15、75mg/ml)。[0134]供试品溶液：称取片粉约取片粉约525mg(约相当于盐酸二甲双胍375mg)，精密称定，置250ml干燥量瓶中，加乙腈50ml，振摇使片粉分散后，分别加50ml各浓度的精氨酸溶液，(边加水边振摇，使片粉分散均匀，防止粘团)，再加入50％乙腈水溶液至80％体积处，超声30min，加入50％乙腈水稀释至刻度，摇匀，平行配制两份。离心(或过滤)，取上清液。精密移取上清液3ml至25ml量瓶中，用超纯水定容，摇匀，即得。[0135]分别取上述几种按照盐酸二甲双胍和精氨酸不同重量比配制得到的供试品溶液，按实施例通用方法1的仪器与条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图峰面积，按外标法计算含量，结果见表6。[0136]表6：[0137][0138]结果显示：1、精氨酸以固体和液体形式加入，对含量提取几乎无影响，采用溶液的方式加入更易于操作；2、盐酸二甲双胍与加入精氨酸的重量比为15:1～1.25:1时，效果更好。[0139]实施例7流动相配制中，流动相a与流动相b的体积比、缓冲液中缓冲盐的浓度范围、缓冲液ph范围考察[0140]ph为约3.85的缓冲液(流动相b)配制：称取0.5g庚烷磺酸钠和0.5g氯化钠溶于1l超纯水中，用0.06m磷酸(按照实施例通用方法2(1)配制)调节ph至3.85(或者3.65、或者4.03)，抽滤，即得。另配制缓冲盐的浓度分别为90％和110％的缓冲液各1份。[0141]流动相配制：量取乙腈(流动相a)和流动相b，按流动相a与流动相b的体积比分别为9:91、11:89、12:88混匀，超声脱气，即得。[0142]按照实施例通用方法3(7)配制得供试品溶液，分别在上述几种流动相条件下进行高效液相色谱分析，记录主峰拖尾因子及主峰与杂质的分离度，结果见表7。[0143]表7：[0144][0145][0146]结果显示：1、在ph为约3.85的缓冲液条件下，流动相a与流动相b的体积比为15:85时，杂质b峰面积rsd(％)接近10，风险较高，流动相a与流动相b的体积比为7:93时，主峰分叉为两个峰，因此，流动相a与流动相b的体积比可在9:91-13:87变化；[0147]2、在流动相a与流动相b的体积比为11:89条件下，缓冲液中缓冲盐的浓度可在±10％范围内变换；[0148]3、在流动相a与流动相b的体积比为11:89条件下，缓冲液的ph可在4.03-3.65的范围内变化。[0149]实施例8高效液相色谱条件中，色谱柱、柱温、流速考察[0150]选用4种色谱柱：[0151]merckkgaastarrp-18e，4.6×150mm，5um；[0152]cosmosil5c18-paq，4.6×250mm，5μm；[0153]ymc-packods-am，4.6×250mm，5um；[0154]watersμbondapaktmc18，3.9×300mm，10μm。[0155]按照实施例通用方法3(7)配制得供试品溶液，流动相按照实施例通用方法2配制，分别使用上述4种色谱柱进行高效液相色谱分析，记录主峰拖尾因子及主峰与杂质的分离度，结果见表8和图2。[0156]表8：[0157][0158][0159]结果显示，色谱柱ymc-packods-am,4.6×250mm,5um和merckkgaastarrp-18e,4.6×150mm,5um主峰拖尾因子＞2.0，不符合可接受标准。[0160]按照实施例通用方法3(7)配制得供试品溶液，流动相按照实施例通用方法2配制，分别采用25℃柱温、30℃柱温、35℃柱温和0.8ml/min流速、1.0ml/min流速、1.2ml/min流速进行高效液相色谱分析，记录主峰拖尾因子及主峰与杂质的分离度，结果见表9。[0161]表9：[0162][0163]结果显示，流速在0.8ml/min-1.2ml/min变化，柱温在25℃-35℃变化，检测结果均符合可接受标准。[0164]本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。[0165]在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“一些实施方式”、“一些实施方案”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。[0166]尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页12当前第1页12
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