基于新霉素的化合物及其药物用途

1.本发明涉及医学领域，特别是肿瘤学领域。尤其，本发明提供了可用于治疗各种癌症如胶质母细胞瘤、结肠直肠癌或乳腺癌的新型化合物。本公开还涉及含有所公开化合物的药物组合物。


背景技术：

2.浸润性胶质瘤是最常见和最严重的原发性脑肿瘤。胶质瘤的发病率在过去20年中有所增加并且目前已达到5/100 000。这些肿瘤的分类仍然很困难。who分类提供了与肿瘤侵袭性相关的肿瘤分级(从i到iv)。最严重的胶质瘤，也是最常见的胶质瘤，是胶质母细胞瘤(gbm)(who iv级)，其总生存期中位数不超过15个月。这些肿瘤在脑实质中表现出大量细胞浸润并且高度血管化。当肿瘤可接近时，标准的一线治疗目前基于最大程度的手术切除，接着进行伴随的放化疗(60格雷分30次，替莫唑胺(temozolomide)75mg/m2/d，持续6周)。尽管在该试验中观察到生存期有所提高，但大多数患者在诊断后存活不到2年，而在5年内不到5％存活，他们的生活质量经历显著恶化并出现多种衰弱症状。
3.因此，需要更有效地治疗胶质瘤或胶质母细胞瘤，并且需要在临床试验中引入新的药剂。
4.gbm遵循癌症干细胞(csc)模型。这一概念提出，肿瘤块内的少数细胞具有长期的自我更新和分化特性，其不仅负责肿瘤的起始和生长，而且还负责肿瘤内的异质性。csc有助于构成肿瘤的所有细胞亚型，包括内皮细胞。它们的功能特性与分子标签相关，结合了神经和/或胚胎干细胞标志物和间充质细胞标志物。越来越多的证据支持这些自我更新的肿瘤细胞决定了肿瘤的行为，包括增殖、进展、侵袭，以及最重要的是，对疗法的抗性的很大一部分。因此，很明显，目前的治疗未能消除胶质瘤起始细胞(gic)是肿瘤复发的一个因素。此外，gic不仅限于成人gbm，而且还可以从预后不佳的小儿胶质瘤(例如深部浸润性脑桥胶质瘤)中分离出来。因此，靶向gic及其干细胞样特性构成了显著改善抗癌治疗的主要治疗挑战之一。靶向gic的相关解决方案是迫使它们退出干性(stemness)程序并采用更具差异化的表型。在这种非干细胞样状态下，细胞会失去其致瘤性并变得易受治疗。在这种情况下，已证明mir-302-367簇能够有效地触发一连串抑制事件，从而破坏gic的干细胞样特性和致瘤特性。在其他寻找干细胞可塑性调节因子的微rna谱分析研究中，mir-18a*被鉴定为潜在候选者，其表达与干性状态相关。发现在gic中迫使mir-18a*表达可增加体外克隆增殖和体内致瘤性。
5.本发明人提议开发抑制癌症干细胞的干性特征如干性标志物和自我更新的化合物，以减少它们的生长，同时增加它们对例如化学疗法或放射疗法的抗癌治疗的敏感性。在致癌性和肿瘤抑制性mirna的背景下，本发明人开发了基于新霉素的化合物，其能够复制mir-302-367簇对干性特性的抑制作用(即，丧失自我更新、增殖和干性标志物)。
6.这里开发和描述的化合物是基于两个不同的rna结合结构域的缀合设计的：(i)氨基糖苷新霉素和(ii)抗癌剂博来霉素(bleomycin)的侧链。关于第一个结构域，新霉素是一
种众所周知且通用的rna配体，主要在形成非特异性相互作用(静电相互作用)时能够与各种结构化rna结合。第二个结构域由广泛用于癌症化学疗法并称为博来霉素的一组天然化合物的侧链代表。这些化合物通过多种作用机制起作用，其主要作用机制是抑制拓扑异构酶ii对dna的作用。博来霉素的侧链是可变结构域，其被认为负责这些化合物与dna靶标的特异性相互作用。
7.令人惊讶地发现，所述化合物可以再现mir302-367簇的生物学效应，这使得所述化合物适用于治疗癌症。所述化合物是gic干细胞样和致瘤特性的有效抑制剂，因此是替莫唑胺抗性的有效抑制剂。


技术实现要素：

8.因此，本发明涉及具有下式(i)的化合物：
[0009][0010]
其中x选自由以下组成的组：
[0011][0012]
其中r如下所示：
[0013][0014]
其中n是1至6的整数，优选2、3和4；
[0015]
r1是-nhr2、-nr3r4或胍基基团；
[0016]
r2是氢原子、胺保护基团或氨基烷基基团；
[0017]
r3和r4相同或不同，独立地是氢原子、胺保护基团或氨基烷基基团；
[0018]
其中任何胺基团任选地被胺保护基团保护；
[0019]
或其盐、立体异构体(非对映异构体、对映异构体)、外消旋混合物、几何异构体或混合物。
[0020]
本公开还涉及含有所公开化合物的药物组合物以及它们作为药物的用途，特别是用于治疗癌症如胶质瘤、胶质母细胞瘤、结肠直肠癌或乳腺癌。
附图说明
[0021]
图1：未处理(ctl dmso)或用指定浓度的指定化合物(“cpd”表示化合物)处理的gb5形态的相差图像。对照细胞生长为由众多gsc组成的非粘附球体。当分化时，细胞变得贴壁并铺展在培养皿上。
[0022]
图2：化合物9a-b和18a-b对gb5细胞中的干性标志物表达、克隆扩增和有丝分裂的影响。(a)通过免疫荧光评估用增加量的化合物9a-b和18a处理的gb5中的巢蛋白(nestin)表达。对每次处理的巢蛋白阳性细胞数目进行计数并表示为对照(100％)的百分比。结果是至少两个独立实验的平均值。(b)免疫荧光显示与其对照对应物相比，用20um化合物9a处理的gb5中oct4、nanog、sox2多能性标志物的下调。(c)如材料和方法部分中所述，使用gb5细胞进行克隆扩增分析。两周和三周后，对球体数目进行计数并报告为孔中初始细胞数目的百分比。结果是至少两个独立实验的平均值。(d)通过检测ser-10上磷酸化的组蛋白h3(h3-ser10)阳性细胞数目来确定培养物中的有丝分裂数目。在用增加量的化合物9a-b和18a处理的gb5中通过免疫荧光评估h3-ser10表达。对每次处理的阳性细胞数目进行计数并表示为对照(100％)的百分比。结果是至少两个独立实验的平均值。
[0023]
图3：由发光性患者来源的gsc对裸鼠进行原位异种移植。(a-b)注射后两周，向小鼠腹膜内注射10mg/kg(n＝4)、7.5mg/kg(n＝4)或5mg/kg(n＝4)的化合物9a或单独的媒介物作为对照(ctl n＝10)。a)对照组(n＝10)和每个化合物9a处理组中肿瘤生长平均值的图示。b)根据kaplan meier方法(r命令，https://biostatgv.sentiweb.fr/？module＝tests/surv)，使用对数秩检验比较未处理组和处理组的整个小鼠群体的存活率。c)当肿瘤已经形成时用化合物9a治疗小鼠。用dmso(对照：
‑▲‑
)或化合物9a(
‑■‑
)处理的小鼠中的肿瘤生长表现。每周通过实时成像控制肿瘤生长。
[0024]
图4：测定化合物对gsc和正常人体细胞的毒性。(a)gb5与增加浓度的化合物9a-b和18a一起温育。(b)人正常神经干细胞(nnsc)、人正常肾细胞(nhek)、人正常肝细胞(heprg)和(c)人内皮细胞(huvec)用增加浓度的化合物9a处理。7天后，如方法部分中所述，对细胞进行xtt测定。结果是至少两个独立实验的平均值。通过台盼蓝染色确认细胞死亡(未显示)。
[0025]
图5：通过比较tmz处理的gb5和与化合物9a组合的tmz处理的gb5之间的死细胞百分比来评估对tmz的敏感性。gb5细胞已用单独或与增加浓度的化合物9a-b和18b组合的400μm tmz处理。结果是至少两个独立实验的平均值。
[0026]
发明详述
[0027]
因此，并且在本发明的第一方面，本文公开了通式(i)的化合物：
[0028][0029]
其中x选自由以下组成的组：
[0030][0031]
并且其中r如下所示：
[0032][0033]
其中n是1至6的整数，优选2、3和4；
[0034]
并且r1是-nhr2、-nr3r4或胍基基团；
[0035]
r2是氢原子、胺保护基团或氨基烷基基团；
[0036]
r3和r4相同或不同，独立地是氢原子、胺保护基团或氨基烷基基团；
[0037]
其中任何胺基团任选地由任何胺保护基团保护；
[0038]
或其盐、立体异构体(非对映异构体和/或对映异构体)、外消旋混合物、几何异构体或混合物。
[0039]
根据本发明，任何式(i)化合物可以带正电荷，例如在中性(生理)和酸性条件下。例如，任何氮原子都可以是铵离子(n

)，包括r1的任何氮原子。
[0040]
根据本发明，术语“(c
1-c
10
)烷基”表示具有1至10个、优选1至6个碳原子的直链或支链饱和烃化基团。直链烷基基团的实例包括但不限于具有1至10个碳原子的那些，例如甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基基团、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基基团。支链烷基基团的实例包括但不限于异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基和2,2-二甲基丙基基团。烷基基团可以未被取代或被氨基基团(-nh2)或受保护的氨基基团取代。
[0041]
根据本发明，术语“氨基烷基”表示如上文所定义的(c
1-c
10
)烷基基团，其被胺基团封端，所述胺基团任选地被胺保护基团保护。更优选地，所述氨基烷基基团由式：-(ch2)mnh2表示，其中m是1至10，优选1至6，更优选4的整数。
[0042]
胺保护基团是本领域中众所周知的。例如，胺保护基团与其所连接的氨基基团形成以下受保护的氨基基团之一：9-芴基氨基甲酸甲酯(fmoc)、氨基甲酸叔丁酯(boc)、氨基甲酸苄酯(cbz)、乙酰胺、三氟乙酰胺、邻苯二甲酰亚胺、苯甲酰胺、三苯甲胺(tr)、亚苄基胺或对甲苯磺胺(ts)。优选地，被保护的氨基基团是氨基甲酸叔丁酯或乙酰胺。受保护的氨基基团的脱保护是本领域中众所周知的。例如，boc基团的脱保护可以在ch2cl2中在三氟乙酸
(tfa)的存在下进行。
[0043]
根据一个特定实施方式，本发明的化合物具有式(i)，其中x是其中r如上文所定义，更优选地其中n是3或4，并且r1是胍基基团，或者r1是-nr3r4，其中r3是氢原子或胺保护基团，并且r4是氨基烷基基团；
[0044]
其中胺基团中的任一者任选地被任何胺保护基团保护；
[0045]
或其盐、立体异构体(非对映异构体和/或对映异构体)、外消旋混合物、几何异构体或混合物。
[0046]
根据另一个特定实施方式，本发明的化合物具有式(i)，其中x是其中r如上文所定义，更优选地其中n是3或4，并且r1是-nh2，或r1是-nr3r4，其中r3是氢原子或胺保护基团，并且r4是氨基烷基基团；
[0047]
其中胺基团中的任一者任选地被任何胺保护基团保护；
[0048]
或其盐、立体异构体(非对映异构体和/或对映异构体)、外消旋混合物、几何异构体或混合物。
[0049]
根据一个特定实施方式，本发明的化合物具有式(i)，其中r1是-nhr2、-nr3r4或胍基基团；
[0050]
其中r2是氢原子、胺保护基团或-(ch2)mnh2，其中m是1至6的整数；r3和r4相同或不同，独立地是氢原子、胺保护基团或-(ch2)mnh2，其中m是1至6的整数，
[0051]
其中任何胺基团任选地由胺保护基团保护。
[0052]
根据一个特定实施方式，m是2、3、4、5或6，并且更优选地m是4。
[0053]
本文讨论的化合物还涵盖它们的纯的或混合的立体异构体(非对映异构体、对映异构体)、外消旋混合物、几何异构体、互变异构体、盐、水合物、溶剂化物、固体形式以及它们的混合物。根据本发明的一些化合物及其盐可以以若干固体形式稳定。本发明包括根据本发明的化合物的所有固体形式，其包括无定形、多晶形、单晶和多晶形式。
[0054]
根据本发明的化合物可以以非溶剂化或溶剂化形式存在，例如与药学上可接受的溶剂如水(水合物)或乙醇的溶剂化形式存在。
[0055]
更具体地，本发明涉及式(i)的化合物，其中满足以下定义中的至少一者或全部：
[0056]-n是3或4；
[0057]-r1选自由以下组成的组：-nh2、胍基基团或-nh(ch2)mnh2(其中m如上文所定义，优选地m是3或4或5)。
[0058]
更具体地，本发明的化合物是式(i)的化合物，其中r是下式之一：
[0059][0060]
根据一个特定实施方式，所述化合物具有式(i)，其中x是
[0061]
并且r是rb或rc；
[0062]
其中任何一个胺基团任选地被任何胺保护基团，优选boc基团保护；
[0063]
或其盐、立体异构体(非对映异构体和/或对映异构体)、外消旋混合物、几何异构体或混合物。
[0064]
根据另一个特定实施方式，所述化合物具有式(i)，其中x是
[0065]
并且r是ra或rb；
[0066]
其中任何一个胺基团任选地被任何胺保护基团，优选boc基团保护；
[0067]
或其盐、立体异构体(非对映异构体和/或对映异构体)、外消旋混合物、几何异构体或混合物。
[0068]
根据一个具体实施方式，所述式(i)化合物选自由以下组成的组：
[0069][0070]
(化合物9a)，
[0071][0072]
(化合物9b)，
[0073][0074]
(化合物18a)，
[0075][0076]
(化合物18b)，
[0077][0078]
(化合物8a)(其对应于具有氨基保护基团的化合物9a)，和
[0079]
(化合物8b)(其对应于具有氨基保护基团的化合物9b)。
[0080]
根据一个更具体的实施方式，所述式(i)化合物选自由以下组成的组：
[0081][0082]
(化合物9a)，
[0083][0084]
(化合物9b)，
[0085]
更优选地，所述式(i)化合物是化合物9a。
[0086]
根据本发明的化合物可以通过本领域技术人员已知的各种方法制备。本发明还涉及用于制备本发明化合物的方法。
[0087]
本发明的化合物是基于两个不同的rna结合结构域的缀合：(i)氨基糖苷新霉素和(ii)抗癌剂博来霉素的侧链。根据一个实施方式，本发明涉及用于制备如上文所定义的化合物的方法，其中进行1,3-偶极环加成反应，从而在以下两个rna结合结构域之间产生三唑接头臂：(i)氨基糖苷新霉素和(ii)博来霉素的侧链。这意味着要制备环加成反应的两个搭配物，即新霉素的叠氮基衍生物和博来霉素a5、b2和a2侧链的炔烃衍生物。新霉素的叠氮基衍生物neo-n3的制备已经在文献中进行了报道(vo d.d.,staedel c.,zehnacker l.,benhida r.,darfeuille f.,duca m.使用多模式合成小分子靶向生产致癌性microrna(targeting the production of oncogenic micrornas with multimodal synthetic small molecules)acs chem.biol.2014 9,711-721)。实施例中描述了博来霉素a5、b2和a2侧链的炔烃衍生物的制备方法。博来霉素的三个侧链带有相同的联噻唑骨架，其合成也在以下实施例中说明。
[0088]
已发现本发明的化合物限制癌症干细胞的自我更新并减少此类细胞的生长以及使肿瘤细胞对抗癌治疗敏感。本发明的化合物似乎能够消除或减少胶质瘤起始细胞(gic)或迫使它们获得非自我更新状态或迫使它们失去其致瘤性或变得易受例如化学疗法和/或放射疗法的治疗。此外，有效浓度的本发明化合物对正常细胞如正常人肝、肾或神经细胞无毒。
[0089]
因此，式(i)化合物可以用于治疗目的，特别是用作药物。
[0090]
本发明的化合物更特别地用于治疗癌症。
[0091]
术语“癌症”、“癌性的”或“恶性的”是指或描述哺乳动物的生理状况，其通常以不受调节的细胞生长为特征。癌症的实例包括例如白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、癌瘤和肉瘤。此类癌症的更特定实例包括慢性粒细胞白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、费城染色体阳性急性淋巴母细胞性白血病(ph all)、鳞状细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、胰腺癌、胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、食道癌、结肠癌、和头颈癌、胃癌、生殖细胞肿瘤、小儿肉瘤、鼻窦自然杀伤、多发性骨髓瘤、急性髓细胞性白血病(aml)、肥大细胞增多症和任何与肥大细胞增多症相关的症状。在一个特定实施方式中，癌症是实体瘤癌症。在另一个特定实施方式中，癌症是非实体瘤癌症。在另一个特定实施方式中，癌症是具有癌症干细胞的上皮肿瘤癌症。
[0092]
本发明的化合物特别用于治疗胶质瘤、胶质母细胞瘤或具有癌症干细胞的上皮肿
瘤癌症，包括结肠直肠癌或乳腺癌，更优选地用于治疗胶质瘤或胶质母细胞瘤，并且甚至更优选胶质母细胞瘤。
[0093]
因此，本文公开了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向需要这种治疗的受试者施用有效量的至少一种如本发明所定义的化合物或包含其的药物。
[0094]
受试者可以是人类或任何动物，优选人类或哺乳动物，包括牛、绵羊、马、狗、猫、山羊等。优选地受试者是人类患者，无论他/她的年龄或性别如何。包括新生儿、婴儿、儿童、成人。
[0095]
如本文所公开的，术语“治疗”是指疾病或病症的改善、预防，或者可以从中辨别出的至少一种症状。这还意味着改善、预防与所治疗的疾病或病症相关的至少一种可测量的物理参数，这不一定是在受试者中可辨别的。“治疗”进一步是指抑制或减缓疾病或病症的进展，在物理上使可辨别症状稳定化，在生理上使例如物理参数稳定化，或两者兼有。“治疗”还指延迟疾病或病症的发作。在一些特定实施方式中，目标化合物被施用作为预防措施。在上下文中，“预防”是指降低患指定疾病或病症的风险。
[0096]
在治疗的情形下，本发明的化合物可以通过任何合适的途径施用于受试者，包括口服、局部、舌下、肠胃外(优选静脉内)、透皮、直肠等。关于目前的药物递送方法的简要综述，参见langer,science 249:1527-1533(1990)，其通过引用并入本文。
[0097]
本发明还涉及药物组合物，其包含本发明的化合物，特别是如上所述的式(i)化合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。该特定方面还涉及上面公开的本发明化合物的优选实施方式。在一个特定实施方式中，所述药物组合物包含根据上述实施方式中任一者的化合物。
[0098]“药学上的”或“药学上可接受的”是指当适当时施用于哺乳动物，尤其是人时，不产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。
[0099]
本发明的药物组合物根据本领域技术人员已知的标准药物实践进行配制(参见例如remington:the science and practice of pharmacy(第20版),a.r.gennaro编,lippincott williams&wilkins,2000，和encyclopedia of pharmaceutical technology,j.swarbrick和j.c.boylan编,1988-1999,marcel dekker,new york)。组合物的赋形剂可以是任何药学上可接受的赋形剂，包括能够靶向特定细胞、细胞区室或组织的特定载体。如前所述，可能的药物组合物包括适合于口服、直肠、局部、透皮、经颊、舌下或肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内和皮内)施用的那些。对于这些制剂，可以根据本领域技术人员熟知的技术使用常规赋形剂。用于肠胃外施用的组合物通常是生理相容的无菌溶液或悬浮液，其可任选地在使用前立即从固体或冻干形式制备。对于口服施用，所述组合物可以配制成常规口服剂型，例如片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂和液体制剂，例如糖浆、酏剂和浓缩滴剂。可以使用无毒的固体载体或稀释剂，其包括例如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、镁、碳酸盐等。对于压制片剂，作为赋予粉状材料内聚性的试剂的粘合剂也是必需的。例如，淀粉、明胶、糖如乳糖或右旋糖以及天然或合成树胶可以用作粘合剂。片剂中还需要崩解剂以促进片剂的分解。崩解剂包括淀粉、粘土、纤维素、藻胶、树胶和交联聚合物。此外，片剂中还包含润滑剂和助流剂以防止片剂材料在制造过程中粘附到表面并改善粉末材料在制造过程中的流动特性。胶体二氧化硅最常用作助流剂，并
且化合物如滑石或硬脂酸最常用作润滑剂。对于透皮施用，可以将组合物配制成软膏、乳膏或凝胶形式，并且可以使用适当的渗透剂或洗涤剂来促进渗透，例如二甲亚砜、二甲基乙酰胺和二甲基甲酰胺。对于透粘膜施用，可以使用鼻喷雾剂、直肠或阴道栓剂。可以通过本领域中已知的方法将活性化合物掺入任何已知的栓剂基质中。此类基质的实例包括可可脂、聚乙二醇(碳蜡)、聚乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯，以及这些与其他用于改变熔点或溶解速率的相容材料的混合物。在一个优选的实施方式中，本发明的药物组合物适用于肠胃外施用。
[0100]
优选地，药物组合物含有对于能够注射的制剂而言为药学上可接受的媒介物。这些可以特别是等渗的、无菌的盐水溶液(磷酸一钠或磷酸二钠，钠、钾、钙或镁的氯化物等，或此类盐的混合物)，或干燥的、尤其是冷冻干燥的组合物，根据情况，其在添加无菌水或生理盐水时允许配制可注射溶液。
[0101]
适合注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液；包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液的制剂；以及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且必须是流体，以达到易于注射的程度。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。
[0102]
包含作为游离碱或药学上可接受的盐的本发明化合物的溶液可以在与表面活性剂如羟丙基纤维素适当混合的水中制备。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备分散液。在一般储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。根据本发明的化合物可以配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基基团形成)，并且其与例如盐酸或磷酸的无机酸或例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸形成。与游离羧基基团形成的盐也可以衍生自无机碱如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等有机碱。载体还可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适混合物，和植物油。可以例如通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散体的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射组合物的吸收。
[0103]
通过将所需量的活性多肽与上面列举的若干其他成分(根据需要)并入适当的溶剂中，接着过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，分散液是通过将各种已灭菌的活性成分并入无菌媒介物中来制备的，所述媒介物含有基本分散介质和来自上述列举那些的所需其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何额外所需成分的粉末。
[0104]
在配制时，溶液将以与剂量配制相容的方式并以治疗有效的量施用。所述制剂容易以多种剂型施用，例如上述的注射溶液类型，但也可以使用药物释放胶囊等。
[0105]
例如，对于在水溶液中的肠胃外施用，如果需要，溶液应该适当缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液尤其适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。在这方面，根据本公开，本领域技术人员将知道可以使用的无菌水性介质。
[0106]
在一个特定的实施方式中，根据本发明的药物组合物包含0.001mg至1g的本发明化合物。优选地，根据本发明的药物组合物包含0.01mg至800mg的本发明化合物。
[0107]
根据本发明的药物组合物可以包含一种或多种本发明化合物以及药学上可接受的赋形剂和/或载体。这些赋形剂和/或载体根据如上所述的施用形式来选择。
[0108]
根据本发明的化合物可以与药学上可接受的赋形剂和任选的缓释基质如生物可降解聚合物组合以形成治疗组合物。
[0109]
根据本发明的药物组合物可以配制成在施用后基本上立即释放活性药物或在施用后的任何预定时间或一段时间释放活性药物。
[0110]
通常，根据本发明的化合物通常以治疗有效量施用。
[0111]“治疗有效量”是指适用于任何医学治疗的以合理益处/风险比来治疗和/或预防疾病的根据本发明的化合物的足够量。
[0112]
应当理解，本发明的化合物和组合物的总每日用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的疾病和疾病的严重程度；所用特定化合物的活性；所用的具体组合物、患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所用具体化合物的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与所用具体化合物联合或同时使用的药物；以及医学领域中众所周知的类似因素。例如，在本领域技能范围内众所周知，化合物的起始剂量水平以低于达到所需治疗效果所需的水平开始化合物的剂量，并逐渐增加剂量直至达到所需效果。然而，产品的每日剂量可以在每名成人每天0.01至1,000mg的宽泛范围内变化。优选地，所述组合物含有0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、250和500mg的活性成分，用于针对待治疗患者的剂量进行症状调整。药物通常含有约0.01mg至约500mg的活性成分，优选1mg至约100mg的活性成分。通常以每天0.0002mg/kg至约20mg/kg体重，尤其是每天约0.001mg/kg至7mg/kg体重的剂量水平提供药物的有效量。
[0113]
本发明的另一个目的涉及包含根据本发明的化合物的药物组合物，其用于治疗癌症，更具体地用于治疗如上文详述的癌症，或更具体地用于治疗胶质瘤或胶质母细胞瘤。
[0114]
本发明的另一个目的涉及本发明的和如本文所详述的化合物的用途，其用于制备用于治疗癌症的药物组合物，更具体地用于治疗如上文所详述的癌症，或更具体地用于治疗胶质瘤或胶质母细胞瘤。
[0115]
在一些实施方式中，本发明的化合物或组合物与化学治疗剂或放射疗法组合使用。
[0116]
化学治疗剂包括但不限于dna烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、内质网应激诱导剂、铂化合物、抗代谢物、长春花生物碱、紫杉烷、埃坡霉素(epothilone)、酶抑制剂、受体拮抗剂、酪氨酸激酶抑制剂、硼放射敏化剂(即万珂(velcade))和化学治疗组合疗法。
[0117]
dna烷化剂在本领域中是众所周知的并且用于治疗多种肿瘤。dna烷化剂的非限制性实例是氮芥类，例如二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺(异环磷酰胺(ifosfamide)、曲磷酰胺(trofosfamide))、苯丁酸氮芥(chlorambucil)(美法仑(melphalan)、泼尼莫司汀(prednimustine))、苯达莫司汀(bendamustine)、乌拉莫司汀(uramustine)和雌莫司汀(estramustine)；亚硝基脲类，例如卡莫司汀(carmustine)(bcnu)、洛莫司汀(lomustine)(semustine)、福替莫司汀(fotemustine)、尼莫司汀
(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)和链脲佐菌素(streptozocin)；烷基磺酸酯类，例如白消安(busulfan)(甘露舒凡(mannosulfan)、曲奥舒凡(treosulfan))；氮丙啶类，例如卡波醌(carboquone)、硫代tepa、三嗪酮(triaziquone)、三乙烯三聚氰胺；肼类(丙卡巴肼(procarbazine))；三氮烯类，例如达卡巴嗪(dacarbazine)和替莫唑胺；奥曲他明(altretamine)和二溴甘露醇(mitobronitol)。
[0118]
拓扑异构酶i抑制剂的非限制性实例包括喜树碱衍生物，包括cpt-11(伊立替康(irinotecan))、sn-38、apc、npc、喜树碱(campothecin)、拓扑替康(topotecan)、甲磺酸依喜替康(exatecan-mesylate)、9-硝基喜树碱、9-氨基喜树碱、鲁托替康(lurtotecan)、鲁比替康(rubitecan)、希拉替康(silatecan)、吉马替康(gimatecan)、二氟替康(diflomotecan)、依他替康(extatecan)、bn-80927、dx-8951f和mag-cpt，如pommier y.(2006)nat.rev.cancer 6(10):789-802和美国专利公开第200510250854号中所述；原小檗碱生物碱及其衍生物，包括小檗红碱(berberrubine)和珊瑚碱(coralyne)，如li等人,(2000)biochemistry 39(24):7107-7116和gatto等人,(1996)cancer res.15(12):2795-2800中所述；菲咯啉衍生物，包括苯并[i]菲啶、尼替丁(nitidine)和法加罗宁(fagaronine)，如makhey等人,(2003)bioorg.med.chem.11(8):1809-1820中所述；特苯并咪唑及其衍生物，如xu(1998)biochemistry 37(10):3558-3566中所述；和蒽环类衍生物，包括多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)和米托蒽醌(mitoxantrone)，如foglesong等人,(1992)cancer chemother.pharmacol.30(2):123-125，crow等人,(1994)j.med.chem.37(19):31913194，和crespi等人,(1986)biochem.biophys.res.commun.136(2):521-8中所述。拓扑异构酶ii抑制剂包括但不限于依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)。双拓扑异构酶i和ii抑制剂包括但不限于圣托平(saintopin)和其他环烷二酮类(naphthecenediones)、daca和其他吖啶-4-羧酰胺类、茚托利辛(intoplicine)和其他苯并吡啶并吲哚类、tas-i03和其他7h-茚并[2,1-c]喹啉-7-酮、吡唑并吖啶、xr11576和其他苯并吩嗪、xr 5944和其他二聚化合物、7-氧代-7h-二苯并[f,ij]异喹啉和7-氧代-7h-苯并[e]萘嵌间二氮杂苯和蒽基-氨基酸缀合物，如denny和baguley(2003)curr.top.med.chem.3(3):339-353中所述。一些药剂抑制拓扑异构酶ii并具有dna嵌入活性，例如但不限于蒽环类药物(阿柔比星(aclarubicin)、柔红霉素、多柔比星、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、氨柔比星(amrubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、缬柔比星(valrubicin)、佐柔比星(zorubicin))和蒽二酮(米托蒽醌(mitoxantrone)和匹蒽醌(pixantrone))。内质网应激诱导剂的实例包括但不限于二甲基塞来昔布(dimethyl-celecoxib)(dmc)、奈非马韦(nelfmavir)、塞来昔布(celecoxib)和硼放射敏化剂(即万珂(硼替佐米(bortezomib)))。
[0119]
铂基化合物，它是dna烷化剂的一个子类。此类药剂的非限制性实例包括卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、奈达铂(nedaplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、四硝酸三铂、沙铂(satraplatin)、阿罗铂(aroplatin)、洛铂(lobaplatin)和jm-216。
[0120]
抗代谢剂的非限制性实例包括基于叶酸的，即二氢叶酸还原酶抑制剂，例如氨基蝶呤(aminopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和培美曲塞(pemetrexed)；胸苷酸合成酶抑制剂，例如雷替曲塞(raltitrexed)、培美曲塞(pemetrexed)；基于嘌呤的，即腺苷脱氨酶抑制剂，例如喷司他丁(pentostatin)，硫嘌呤，例如硫鸟嘌呤(thioguanine)和巯基嘌呤
(mercaptopurine)，卤化/核糖核苷酸还原酶抑制剂，例如克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)、氟达拉滨(fludarabine)，或鸟嘌呤/鸟苷：硫嘌呤，例如硫鸟嘌呤；或基于嘧啶的，即胞嘧啶/胞苷：去甲基化剂，例如阿扎胞苷(azacitidine)和地西他滨(decitabine)，dna聚合酶抑制剂，例如阿糖胞苷(cytarabine)，核糖核苷酸还原酶抑制剂，例如吉西他滨(gemcitabine)，或胸腺嘧啶/胸苷：胸苷酸合成酶抑制剂，例如氟尿嘧啶(fluorouracil)(5-fu)。5-fu的等效物包括其前药、类似物和衍生物，例如5'-脱氧-5-氟尿苷(去氧氟尿苷(doxifluroidine))、1-四氢呋喃基-5-氟尿嘧啶(替加氟(ftorafur))、卡培他滨(capecitabine)(希罗达(xeloda))、s-i(mbms-247616，由替加氟和两种调节剂5-氯-2,4二羟基吡啶和氧嗪酸钾组成)、雷利曲塞(ralititrexed)(tomudex)、诺拉曲塞(nolatrexed)(thymitaq，ag337)、ly231514和zd9331，如例如papamicheal(1999)the oncologist 4:478-487中所述。
[0121]
长春花生物碱的实例包括但不限于长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春氟宁(vinflunine)、长春地辛(vindesine)和长春瑞滨(vinorelbine)。
[0122]
紫杉烷的实例包括但不限于多西他赛(docetaxel)、拉罗他赛(larotaxel)、欧塔他赛(ortataxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)和特西他赛(tesetaxel)。埃坡霉素的一个实例是伊沙匹隆(iabepilone)。酶抑制剂的实例包括但不限于法尼基转移酶抑制剂(替吡法尼(tipifamib))；cdk抑制剂(阿伏西地(alvocidib)、塞利西利(seliciclib))；蛋白酶体抑制剂(硼替佐米)；磷酸二酯酶抑制剂(阿那格雷(anagrelide)；咯利普兰(rolipram))；imp脱氢酶抑制剂(噻唑呋喃(tiazofurine))；和脂氧合酶抑制剂(马索罗酚(masoprocol))。受体拮抗剂的实例包括但不限于era(阿曲生坦(atrasentan))；维甲酸x受体(贝沙罗汀(bexarotene))；和性类固醇(睾酮)。
[0123]
酪氨酸激酶抑制剂的实例包括但不限于erbb抑制剂：her1/egfr(厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)、凡德他尼(vandetanib)、舒尼替尼(sunitinib)、来那替尼(neratinib))；her2/neu(拉帕替尼(lapatinib)、来那替尼(neratinib))；rtk类tti：c-kit(阿西替尼(axitinib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib))、flt3(来他替尼(lestaurtinib))、pdgfr(阿西替尼(axitinib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib))；和vegfr(凡德他尼(vandetanib)、塞马卡尼(semaxanib)、西地尼布(cediranib)、阿西替尼(axitinib)、索拉非尼(sorafenib))；bcr-abl(伊马替尼(imatinib)、尼罗替尼(nilotinib)、达沙替尼(dasatinib))；src(博舒替尼(bosutinib))和janus激酶2(来曲替尼(lestaurtinib))。
[0124]
在一个特定实施方式中，本发明涉及用于治疗胶质母细胞瘤的本发明的化合物或组合物。在一个更特定实施方式中，本发明的化合物或组合物用于通过消除或减少胶质瘤起始细胞(gic)或迫使它们获得非自我更新状态或失去其致瘤性或变得易受治疗来治疗胶质母细胞瘤。
[0125]
在一个特定实施方式中，本发明涉及本发明的化合物或组合物，其与如上文所定义的化学治疗剂、更具体地与替莫唑胺组合用于治疗癌症，更具体地胶质母细胞瘤。
[0126]
本发明的药物组合物更具体地用于本发明的化合物和至少一种如上文所定义的化学治疗剂的同时、分开或顺序施用。
[0127]
本发明将通过以下实施例进一步说明。然而，这些实施例不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
具体实施方式
[0128]
实施例
[0129]
实施例1：
[0130]
活性化合物9a和9b的合成。
[0131]
下面描述博来霉素a5、b2和a2侧链的炔烃衍生物的制备。三个侧链带有相同的联噻唑骨架，其合成如方案1所示。
[0132][0133]
方案1.联噻唑化合物3的合成。试剂：a)edc，hobt，et3n，ch2cl2/dmf，室温，过夜；b)lioh，h2o/thf，室温(r.t.)，过夜。
[0134]
环加成反应所必需的炔烃基团的引入是通过以下获得：使遵循先前公布的程序(quada jc jr,boturyn d,hecht sm.bioorg med chem.2001年9月；9(9):2303-14)制备的化合物1与4-丙酸在ch2cl2中在edc、hobt和et3n的存在下反应，从而以50％的产率得到所需的炔烃2。将酯基团用lioh的最终水解产生炔烃3，以备用于博莱霉素侧链的可变部分的偶联。
[0135]
然后，如方案2所示制备博来霉素a5侧链的炔烃衍生物。
[0136][0137]
方案2.博来霉素a5侧链的炔烃衍生物5的合成。试剂a)3，edc，hobt，et3n，ch2cl2/dmf，室温，过夜。
[0138]
使遵循先前报道的程序(kross j,henner wd,haseltine wa,rodriguez l,levin md,hecht sm.biochemistry.1982年7月20日；21(15):3711-21.)制备的化合物4的氨基基团与3的羧基基团在ch2cl2中在edc、hobt和et3n的存在下偶联，以77％的产率得到所需的a5侧链5。
[0139]
其次，与化合物5的制备类似地，如方案3所示合成博来霉素b2侧链的炔烃衍生物。
[0140][0141]
方案3.博来霉素b2侧链的炔烃衍生物7的合成。试剂：a)3，edc，hobt，et3n，ch2cl2/dmf，室温(r.t.)，过夜；b)tfa，ch2cl2，室温，1小时；c)1,3-二-boc-2-(三氟甲基磺酰基)胍，
ch2cl2/meoh，室温，过夜。
[0142]
简而言之，在ch2cl2中在edc、hobt和et3n的存在下使n-boc-1,4-丁胺与羧酸3偶联，以50％产率得到中间体6。在ch2cl2中在三氟乙酸的存在下对氨基基团进行脱保护，接着在1,3-二-boc-2-(三氟甲基磺酰基)胍的存在下进行胍基化反应，经两个步骤以76％产率得到所需的b2侧链类似物7。
[0143]
然后在ch3cn中在催化量的cui存在下，使用1,3-偶极环加成反应将炔烃5和7与neon3缀合，以75-92％的产率产生boc保护的缀合物8a-b(方案4)。
[0144][0145]
方案4.缀合物9a-b的合成。试剂。a)5(用于合成化合物8a)和7(用于合成化合物8b)，cui，dipea，ch3cn，室温过夜；b)tfa，ch2cl2，室温，过夜。
[0146]
在ch2cl2中在三氟乙酸的存在下对化合物8a和8b的boc基团进行脱保护后，分别以100％和85％的产率得到最终化合物9a和9b。
[0147]
实施例2：
[0148]
活性化合物18a和18b的合成。
[0149]
如方案5所示，含有脂族接头而不是三唑接头的类似物的制备从侧链13的制备开始。首先，在ch2cl2中在hbtu和et3n的存在下将化合物4与化合物10偶联，以51％的产率得到所需化合物11。后者在dmf中在哌啶的存在下脱保护，以87％的产率得到化合物12。最后，在ch2cl2中将12与琥珀酸酐偶联，以84％的产率得到化合物13。
[0150][0151]
方案5.侧链中间体13的合成。试剂：a)hbtu，et3n，ch2cl2，室温，过夜；b)哌啶，dmf，室温2小时；c)琥珀酸酐，ch2cl2，室温，过夜。
[0152]
第二侧链中间体16的合成如方案6所示。如先前关于13的制备所进行的，化合物10在ch2cl2中在hosu、edc和et3n的存在下与市售的n-boc-1,3-丙二胺偶联，以56％的产率得到化合物14。在dmf中在哌啶的存在下脱保护，以89％的产率得到化合物15。15与琥珀酸酐
在ch2cl2中的最终偶联，以91％的产率得到所需化合物16。
[0153][0154]
方案6.侧链中间体16的合成。试剂：a)hosu，edc，ch2cl2，室温，过夜；b)哌啶，dmf，室温2小时；c)琥珀酸酐，ch2cl2，室温，过夜。
[0155]
所需类似物18a和18b的合成如方案7所示。首先遵循报道的程序制备在5”位含有氨基基团的修饰化合物新霉素，然后在ch2cl2中在hosu和edc的存在下与侧链中间体13和16偶联，分别以50％和39％的产率得到化合物17a和17b。在ch2cl2中在tfa的存在下对boc保护基团进行脱保护后，分别以86％和100％的产率得到所需化合物18a和18b。
[0156][0157]
方案7.活性化合物18a和18b的合成。试剂：a)13(用于制备17a)和16(用于制备17b)，hosu，edc，ch2cl2，室温，过夜；b)tfa，ch2cl2，室温，过夜。
[0158]
实验部分
[0159]
一般方法
[0160]
试剂和溶剂购自aldrich或alfa并且无需进一步纯化即使用。所有涉及空气或水分敏感性试剂或中间体的反应均在氩气气氛下进行。在硅胶(merck，sds40-63μm，vwr)上进行快速柱色谱法。在具有荧光指示剂的tlc al箔上的fluka分析型预涂硅胶上进行分析型薄层色谱(tlc)，并通过照射(254nm)或通过茚三酮染色剂或茴香醛染色剂染色来观察化合物。在bruker ac 200mhz或bruker ac 500mhz光谱仪上记录1h和
13
c nmr光谱。参考溶剂的残余1h共振(cdcl3，δ7.26；cd3odδ3.31；dmso-d6δ2.50)，以百万分率(ppm，δ)报告化学位移。分裂模式指定如下：s(单峰)、d(双重峰)、t(三重峰)和m(多重峰)、br(宽峰)。耦合常数(j值)以赫兹(hz)为单位列出。低分辨率质谱(ms)是在配有以正负模式操作的电喷雾源的thermofinnigan(san jose,ca)离子阱质谱仪上获得的。所述质谱仪与agilent(palo alto,ca)1100hplc系统联用，所述hplc系统包括脱气机、四元泵、自动进样器、柱烘箱和二极管阵列检测器。使用与waters 996光电二极管阵列检测器和thermo scientific rp-c
18
柱(250
×
4.6mm，5μ，对于分析型hplc；和250
×
10mm，5μ，对于半制备型hplc)耦合的
water alliance 2695泵进行hplc。所有hplc分析均在室温下进行。使用经30分钟梯度为5％至60％的在含0.1％tfa的水(洗脱剂a)中含有0.1％tfa的ch3cn(洗脱剂b)，对于分析型hplc，流速为1ml/min，而对于半制备型hplc，流速为3.5ml min。
[0161]
1,3-偶极环加成的一般程序(一般程序a)。在室温下向neon3(vo d.d.,staedel c.,zehnacker l.,benhida r.,darfeuille f.,duca m.使用多模式合成小分子靶向生产致癌性microrna(targeting the production of oncogenic micrornas with multimodal synthetic small molecules)acs chem.biol.2014 9,711-721)(100mg,0.0806mmol)和炔烃5和7(0.0887mmol,1.1eq.)于ch3cn(4ml)中的溶液中加入碘化铜(3.20mg,0.0322mmol,0.4eq.)和n,n-二异丙基乙胺(42.0μl,0.484mmol,6eq.)并将反应混合物搅拌过夜。然后减压除去溶剂，并且粗残余物通过使用混合物ch2cl2/meoh 95:5作为洗脱剂的快速硅胶柱色谱法纯化，得到呈无色固体的所需化合物8a-b。
[0162]
boc基团脱保护的一般程序(一般程序b)。通过在ch2cl2(2ml)中用tfa(0.6mmol,10eq.)处理化合物8a-b和17a-b(0.06mmol)，在将反应混合物搅拌过夜后，获得叔丁氧羰基(boc)脱除。然后减压除去溶剂和tfa残余物。在混合物et2o/meoh 49:1中最终沉淀，得到呈无色固体的纯化合物9a-b和18a-b(tfa盐)。
[0163]
2'-(2-(戊-4-炔酰胺基)乙基)-[2,4'-联噻唑]-4-甲酸乙酯(2)。在室温下向市售4-戊炔酸(346mg,3.53mmol,1eq.)于ch2cl2/dmf 1:1混合物(20ml)中的溶液中加入edc(743mg,3.88mmol,1.1eq.)、hobt(586mg,3.88mmol,1.1eq.)和et3n(1.48ml,10.6mmol,3eq.)。将反应混合物在室温下搅拌15分钟后，加入化合物1(1g,3.53mmol)并将所得反应混合物在室温下搅拌过夜。减压蒸发溶剂后，加入ch2cl2，并且有机层用饱和nh4cl(50ml)、h2o(50ml)和盐水(50ml)洗涤。减压浓缩有机相，并且所得产物通过使用混合物ch2cl2/meoh 98.5:1.5作为洗脱剂的快速柱色谱法纯化。这得到呈无色固体的纯的所需化合物2：产率650mg(50％)；rf＝0.10(环己烷/乙酸乙酯1:1)；1h nmr(200mhz，cdcl3)δ(ppm):8.16(s,1h),8.02(s,1h),6.52(br,1h),4.43(q,j＝7.1hz,2h),3.76(q,j＝6.1hz,2h),3.23(t,j＝6.1hz,2h),2.58-2.33(m,4h),1.92(t,j＝2.5hz,1h),1.41(t,j＝7.1hz,3h)；ms(esi),m/z 364.6(m h)

(理论m/z 364.1)。
[0164]
2'-(2-(戊-4-炔酰胺基)乙基)-[2,4'-联噻唑]-4-甲酸(3)。向化合物2(650mg,1.79mmol)于h2o/thf 1:1混合物(60ml)中的溶液中加入2n lioh溶液(1.79ml,3.58mmol,2eq.)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，冷却至0℃并使用1m hcl溶液(6ml)中和。减压蒸发thf期间，出现沉淀物。将该残余物过滤并蒸发至干，得到呈无色固体的所需化合物3：产率578mg(96％)；rf＝0.1(ch2cl2/meoh 9:1)；1h nmr(200mhz,cd3od)δ(ppm):8.35(s,1h),8.20(s,1h),3.64(t,j＝6.8hz,2h),3.26(t,j＝6.8hz,2h),2.51-2.33(m,4h),2.24(t,j＝2.4hz,1h)；
13
c nmr(50mhz,cd3od)δ(ppm):174.3,170.7,164.9,164.1,149.3,149.2,83.5,70.4,40.1,36.1,33.7,15.7。ms(esi),m/z 336.6(m h)

(理论m/z 336.0)。
[0165]
(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁基)(3-(2'-(2-(戊-4-炔酰胺基)乙基)-[2,4'-联噻唑]-4-甲酰胺基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(5)。将化合物3(100mg,0.298mmol)溶解在ch2cl2/dmf 1:1混合物(6ml)中并加入edc(69mg,0.358mmol,1.2eq.)、hobt(54.4mg,0.358mmol,1.2eq.)和et3n(83.4μl,0.596mmol,2eq.)。在室温下搅拌反应混合物15分钟后，加入化合物4(155mg,0.447mmol,1.5eq.)。在室温下搅拌过夜后，减压蒸发溶剂并加入ch2cl2(60ml)。
有机相用饱和nh4cl(10ml)、h2o(30ml)和盐水(30ml)洗涤，然后减压浓缩。最后通过使用混合物ch2cl2/meoh 97:3作为洗脱剂的快速柱色谱法纯化所得产物，得到呈淡黄色固体的化合物5：产率153mg(77％)；rf＝0.17(ch2cl2/meoh97:3)；1h nmr(200mhz,cdcl3)δ(ppm):8.12(br,1h),8.08(s,1h),7.95(s,1h),6.50(br,1h),4.63(br,1h),3.77(t,j＝6.1hz,2h),3.57-3.00(m,10h),2.61-2.31(m,4h),2.00-1.70(m,3h),1.65-1.24(m,22h)；
13
c nmr(50mhz,cdcl3)δ(ppm):171.0,169.0,161.1,156.0,150.9,148.5,123.1,116.5,82.8,79.6,69.3,46.7,43.9,40.1,38.4,35.3,32.7,28.5,28.4,27.4,14.8；ms(esi),m/z 686.2(m na)

(理论m/z 685.3)。
[0166]
(4-(2'-(2-(戊-4-炔酰胺基)乙基)-[2,4'-联噻唑]-4-甲酰胺基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(6)。将化合物3(200mg,0.597mmol)溶解在混合物ch2cl2/dmf 1:1(12ml)中并加入edc(127μl,0.716mmol,1.2eq.)、hobt(109mg,0.716mmol,1.2eq.)和et3n(167μl,1.19mmol,2eq.)。在室温下搅拌15分钟后，加入(4-氨基丁基)氨基甲酸叔丁酯(169mg,0.896mmol,1.5eq.)并将反应混合物在室温下搅拌过夜。减压蒸发溶剂后，加入ch2cl2(100ml)并用饱和nh4cl(10ml)、h2o(30ml)和盐水(30ml)洗涤。将有机层浓缩至干并将所得残余物通过使用混合物ch2cl2/meoh 97:3作为洗脱剂的快速柱色谱法纯化，得到呈淡黄色固体的所需化合物7：产率151mg(50％)；rf＝0.17(ch2cl2/meoh 97:3)；1h nmr(200mhz,cdcl3)δ(ppm):8.09(s,1h),7.88(s,1h),7.45(t,j＝5.6hz,1h),6.48(br,1h),4.63(br,1h),3.77(q,j＝6.1hz,2h),3.48(q,j＝6.4hz,2h),3.25(t,j＝6.1hz,2h),3.16(q,j＝6.1hz,2h),2.59-2.34(m,4h),1.93(t,j＝2.5hz,1h),1.75-1.50(m,4h),1.43(s,9h)；ms(esi),m/z 528.8(m na)

(理论m/z 528.2)。
[0167]
(4-(2'-(2-(戊-4-炔酰胺基)乙基)-[2,4'-联噻唑]-4-n,n'-二boc-胍基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(7)。将化合物6(151mg,0.298mmol)溶解在ch2cl2(4ml)中并加入tfa(0.46ml,5.97mmol,20eq.)。在室温下搅拌反应混合物1小时后，减压蒸发溶剂，并且粗产物不经进一步纯化即用于下一步骤。将该粗产物溶解在ch2cl2/meoh 9:1混合物(2.2ml)中并加入1,3-二-boc-2-(三氟甲基磺酰基)胍(176mg,0.799mmol,1.5eq.)和et3n(125μl,0.894mmol,3eq.)。将反应混合物搅拌过夜后，减压蒸发溶剂并将所得残余物通过使用混合物ch2cl2/meoh 97:3作为洗脱剂的快速柱色谱法纯化，得到呈淡黄色固体的所需化合物7：产率148mg(76％，经2个步骤)；rf＝0.29(ch2cl2/meoh 95:5)；1h nmr(200mhz,cdcl3)δ(ppm):8.36(br,1h),8.11(s,1h),7.89(s,1h),7.51(t,j＝6.1hz,1h),6.54(br,1h),4.63(br,1h),3.77(q,j＝6.1hz,2h),3.59-3.36(m,4h),3.25(t,j＝6.2hz,2h),2.59-2.35(m,4h),1.93(t,j＝2.5hz,1h),1.77-1.62(m,4h),1.48(s,18h)；
13
c nmr(50mhz,cdcl3)δ(ppm):171.3,169.0,163.4,162.2,161.2,156.2,153.3,150.6,148.3,123.7,116.5,83.2,82.7,79.5,69.5,40.4,38.9,38.4,35.3,32.6,28.2,28.0,26.9,26.4,14.8；ms(esi),m/z 649.0(m h)

(理论m/z 648.3)。
[0168]
(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁基)(3-(2'-(2-(3-(1-甲基-1h-1,2,3-三唑-4-基)丙酰胺基)乙基)-[2,4'-联噻唑]-4-甲酰胺基)丙基)氨基甲酸叔丁酯-boc-neo(8a)。通用程序a用于neon3与炔烃5之间的反应，得到呈无色固体的化合物8a：产率116mg(76％)；rf＝0.2(ch2cl2/meoh 95/5)；1h nmr(500mhz,cd3od)δ(ppm):8.20(s,1h),7.98(s,1h),5.41(s,1h),5.11(s,1h),4.94(s,1h),4.68-4.51(m,1h),4.42-4.11(m,3h),3.82-3.73(m,2h),
3.70-3.32(m,18h),3.28-3.11(m,4h),3.10-2.97(m,4h),2.75-2.52(m,2h),2.05-1.78(m,3h),1.62-1.29(m,77h)；
13
c nmr(125mhz,cd3od)δ(ppm):159.2,158.9,158.6,158.5,158.2,111.5,100.5,98.9,86.1,81.0,80.8,80.7,80.4,80.3,79.9,75.5,74.7,74.5,73.3,72.9,72.8,71.7,69.1,56.7,54.8,53.6,51.1,49.2,42.5,42.1,41.1,40.4,35.9,33.9,29.0,28.9,28.8,28.4；ms(esi),m/z 1903.9(m h)

(理论m/z 1902.9)。
[0169]
叔丁基-n-(4-((二氨基亚甲基)氨基)丁基)-2'-(2-(3-(1-甲基-1h-1,2,3-三唑-4-基)丙酰胺基)乙基)-[2,4'-联噻唑]-4-甲酰胺-boc-neo(8b)。通用程序a用于neo-n3与炔烃7之间的反应，得到呈无色固体的化合物8b：产率129mg(85％)；rf＝0.46(ch2cl2/meoh 92:8)；1h nmr(500mhz,cd3od)δ(ppm):8.19(s,1h),8.17(s,1h),7.92(s,1h),5.42(s,1h),5.11(s,1h),4.94(s,1h),4.84-4.78(m,1h),4.65-4.58(m,1h),4.41-4.10(m,3h),3.96(t,j＝6.3hz,1h),3.95-3.86(m,1h),3.76-3.71(m,2h),3.67-3.34(m,16h),3.30-2.97(m,6h),2.69-2.53(m,2h),2.02-1.89(m,3h),1.76-1.64(m,4h),1.62-1.19(m,75h)；
13
c nmr(125mhz,cd3od)δ(ppm):174.9,170.9,164.6,164.0,163.4,159.3,158.9,158.5,158.3,158.1,158.0,157.6,154.2,151.6,149.4,125.6,125.2,119.0,111.4,100.5,98.8,86.1,84.5,81.0,80.8,80.7,80.6,80.5,80.4,80.3,75.5,74.6,74.5,73.2,72.9,72.8,71.6,69.0,56.7,55.8,53.6,53.3,52.6,51.1,49.9,43.8,42.5,42.1,41.5,40.3,40.1,36.6,35.9,33.9,33.1,28.9,28.8,28.6,28.3,28.0,27.7,22.7,13.3；ms(esi),m/z 1687.8(m 3h-2boc)

(理论m/z 1687.8)。
[0170]
n-(3-((4-氨基丁基)氨基)丙基)-2'-(2-(3-(1-甲基-1h-1,2,3-三唑-4-基)丙酰胺基)乙基)-[2,4'-联噻唑]-4-甲酰胺-新霉素(9a)。将一般程序b应用于化合物8a，得到呈无色固体的所需化合物9a：产率66mg(100％)；保留时间14.5min；1h nmr(500mhz,cd3od)δ(ppm):8.25(s,1h),8.18(s,1h),7.96(s,1h),5.95(d,j＝3.6hz,1h),5.42(d,j＝3.8hz,1h),5.34(d,j＝1.4hz,1h),4.94-4.86(m,1h),4.71(dd,j＝14.9,5.6hz,1h),4.52-4.44(m,2h),4.35-4.31(m,1h),4.17-3.97(m,5h),3.84(t,j＝9.0hz,1h),3.77(t,j＝4.1hz,1h),3.72-3.38(m,13h),3.31-3.20(m,4h),3.15-2.95(m,9h),2.65-2.56(m,2h),2.49-2.40(m,1h),2.10-1.98(m,3h),1.87-1.72(m,4h)。
13
c nmr(125mhz,cd3od)δ(ppm):174.8,162.1,161.9,161.8,161.7,111.3,97.0,96.7,86.7,81.7,77.8,76.7,74.8,74.1,72.8,72.2,71.9,69.4,69.3,69.2,55.1,54.8,53.0,52.1,50.2,48.3,46.6,41.7,40.2,40.0,37.1,36.2,33.9,33.8,29.5,28.0,27.8,25.6,24.4,22.6；hrms(esi),m/z 1102.5138(m h)

(c
44h76n15o14
s2需要1102.5132)。
[0171]
n-(4-((二氨基亚甲基)氨基)丁基)-2'-(2-(3-(1-甲基-1h-1,2,3-三唑-4-基)丙酰胺基)乙基)-[2,4'-联噻唑]-4-甲酰胺-新霉素(9b)。将一般程序b应用于化合物8b，得到呈无色固体的所需产物9b：产率97mg(100％)；保留时间15.9min；1h nmr(500mhz,cd3od)δ(ppm):8.20(s,1h),8.17(s,1h),7.94(s,1h),5.94(d,j＝3.7hz,1h),5.42(d,j＝3.9hz,1h),5.35(d,j＝1.5hz,1h),4.86-4.82(m,1h),4.71(dd,j＝14.9,5.6hz,1h),4.52-4.44(m,2h),4.35-4.31(m,1h),4.17-3.97(m,5h),3.84(t,j＝9.0hz,1h),3.74(t,j＝4.3hz,1h),3.71-3.39(m,13h),3.31-3.20(m,6h),3.02(t,j＝7.2hz,2h),2.61(t,j＝7.2hz,2h),2.49-2.40(m,1h),2.10-1.98(m,1h),1.77-1.64(m,4h)；
13
c nmr(125mhz,cd3od)δ(ppm):174.7,170.9,163.6,158.7,151.6,149.4,148.6,125.2,125.0,118.9,111.3,97.0,96.7,
86.7,81.7,77.8,76.7,74.8,74.1,72.8,72.2,71.9,69.4,69.3,69.2,55.9,55.1,53.0,52.9,51.2,50.2,49.9,43.8,42.2,41.7,40.2,39.8,36.2,33.8,29.5,28.0,27.9,27.3,22.6,18.8,17.3；ms(esi),m/z 1087.4770(m h)

(c
42h70n16o14
s2需要1087.4772)。
[0172]
(3-(2'-(2-(((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙基)-[2,4'-联噻唑]-4-甲酰胺基)丙基)(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(11)。向2'-(2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙基)-[2,4'-联噻唑]-4-甲酸10(1.24g,2.60mmol)于无水ch2cl2(10ml)中的溶液中加入hbtu(1.18g,3.12mmol,1.2eq)和三乙胺(724μl,5.20mmol,2eq)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后加入亚精胺4(0.99g,2.86mmol,11eq)。在室温下搅拌反应混合物过夜后，加入饱和nh4cl溶液并用ch2cl2萃取反应混合物。合并的有机相用水和盐水洗涤，经na2so4干燥，然后减压浓缩。粗残余物通过使用混合物ch2cl2/meoh 90:10作为洗脱剂的快速柱色谱法纯化，得到呈无色油状的纯化合物11：产率1,06g(51％)；rf＝0.39(ch2cl2/meoh 9:1)；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.09(s,1h),7.96(br s,1h),7.74(d,j＝7.5hz,2h),7.58(d,j＝7.5hz,2h),7.38(t,j＝7.4hz,2h),7.27(t,j＝7.4hz,2h),5.56(nh,1h),4.63(nh,1h),4.41(d,j＝6.9hz,2h),4.21(t,j＝6.8hz,1h),3.72
–
3.64(m,2h),3.47(br s,2h),3.33(br s,2h),3.24(t,j＝6.1hz,2h),3.22
–
3.16(m,2h),3.16
–
3.06(m,2h),1.83(br s,2h),1.64
–
1.50(m,2h),1.50
–
1.39(m,20h)；
13
c nmr(50mhz,cdcl3)δ168.94,162.28,161.33,156.48,156.29,156.13,151.07,148.74,143.98,141.44,127.81,127.13,125.15,123.31,120.10,116.56,79.72,66.79,47.37,46.84,44.10,40.30,40.14,36.33,33.24,28.61,28.53,28.28,27.55,25.96；ms(esi)m/z 804.87(m h)

。
[0173]
(3-(2'-(2-氨基乙基)-[2,4'-联噻唑]-4-甲酰胺基)丙基)(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁基)氨基甲酸叔丁酯(12)。向化合物11(1.06g,1.32mmol)于dmf(10ml)中的溶液中加入哌啶(2.5ml)。将反应混合物在室温下搅拌3小时，减压浓缩，并且残余物通过使用混合物ch2cl2/meoh 90:10作为洗脱剂的快速柱色谱法纯化，得到呈无色固体的纯化合物12：产率668mg(87％)；rf＝0.29(ch2cl2/meoh 95:05)；1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.17(s,1h),8.15(s,1h),3.43(t,j＝6.7hz,2h),3.40
–
3.30(m,2h),3.27
–
3.20(m,4h),3.13(t,j＝6.52hz,2h),3.04(t,j＝6.7hz,2h),1.87(br s,2h),1.57(br s,2h),1.51
–
1.38(m,20h)；
13
c nmr(50mhz,cd3od)δ171.38,164.00,163.40,158.51,157.55,151.71,149.54,124.85,118.26,80.97,79.78,51.06,48.06,45.53,42.14,40.97,38.04,36.64,34.80,29.60,28.80,28.73,28.34,26.63；ms(esi)m/z 583.07(m h)

。
[0174]
4-((2-(4-((3-((叔丁氧羰基)(4-((叔丁氧羰基)氨基)丁基)氨基)丙基)氨甲酰基)-[2,4'-联噻唑]-2'-基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸(13)。向化合物12(150mg,0.26mmol)于ch2cl2(1.2ml)中的溶液中加入琥珀酸酐(30.9mg,0.31mmol,1.2eq)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后减压除去溶剂。使粗残余物通过使用混合物ch2cl2/meoh 95:5作为洗脱剂的快速柱色谱法纯化，得到呈无色固体的纯化合物13：148mg(84％)；rf＝0.25(ch2cl2/meoh 95:5)；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.68(br s,oh),8.11(br s,nh),8.01(s,1h),7.85(s,1h),7.08(br s,nh),4.76(br s,nh),3.64(dd,j＝6.1,12.2hz,2h),3.37(br s,2h),3.24(br s,2h),3.17(t,j＝6.4hz,2h),3.11(br s,2h),3.04(br s,2h),2.61(t,j＝6.7hz,2h),2.46(t,j＝6.7hz,2h),1.75(br s,2h),1.55
–
1.42(m,2h),1.38(s,9h),1.35(s,9h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ175.54,172.51,169.00,162.13,161.33,156.11,155.52,150.59,
148.32,123.43,116.71,79.70,79.12,46.75,44.01,40.15,38.79,36.35,32.69,30.91,29.68,28.45,28.39,28.11,27.33,25.83；ms(esi)m/z 682.93(m h)
1
。
[0175]
(2-(4-((3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙基)氨甲酰基)-[2,4'-联噻唑]-2'-基)乙基)氨基甲酸(9h-芴-9-基)甲酯(14)。向化合物10(292.0mg,0.612mmol)于无水ch2cl2(2ml)中的溶液中加入edc(199.3mg,1.04mmol,1.7eq)和hosu(119.7mg,1.04mmol,1.7eq)。将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后加入n-boc-1,3-丙二胺(149.9mg,0.86mmol,1.4eq)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，加入水并用ch2cl2萃取混合物。合并的有机相用水和盐水洗涤，经na2so4干燥，然后减压浓缩。粗残余物通过使用混合物ch2cl2/meoh 98:2作为洗脱剂的快速柱色谱法纯化，得到呈无色固体的纯化合物14：216mg(56％)；rf＝0.69(ch2cl2/meoh95:05)；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.08(s,1h),7.88(s,1h),7.79
–
7.69(m,2h 1nh),7.56(d,j＝7.5hz,2h),7.36(t,j＝7.4hz,2h),7.28
–
7.21(t,j＝7.5hz,2h),5.67(br s,nh),5.20(br s,nh),4.40(d,j＝6.9hz,2h),4.19(t,j＝6.8hz,1h),3.73
–
3.62(m,2h),3.52(dd,j＝12.7,6.4hz,2h),3.30
–
3.15(m,4h),1.76(p,j＝6.3hz,2h),1.44(s,9h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ169.01,162.47,161.67,156.51,150.81,148.50,143.98,141.42,127.81,127.13,125.15,123.63,120.10,116.59,79.26,66.77,47.37,40.19,37.48,36.33,33.27,30.38,28.57；ms(esi)m/z 633.87(m h)

。
[0176]
(3-(2'-(2-氨基乙基)-[2,4'-联噻唑]-4-甲酰胺基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(15)。向化合物14(210.0mg,0.331mmol)于dmf(2.9ml)中的溶液中加入哌啶(0.75ml)。将反应混合物在室温下搅拌4小时并减压除去溶剂。加入水并且混合物用ch2cl2萃取。合并的有机相用水和盐水洗涤，经na2so4干燥，然后减压浓缩。粗残余物通过使用混合物ch2cl2/meoh 85:15作为洗脱剂的快速柱色谱法纯化，得到呈无色固体的纯化合物15：121mg(89％)；rf＝0.27(ch2cl2/meoh 91:09)；1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.18(s,1h),8.14(s,1h),3.49(t,j＝6.8hz,2h),3.27
–
3.10(m,6h),1.82(p,j＝6.5hz,2h),1.47(s,9h)；
13
c nmr(101mhz,cd3od)δ171.40,163.92,163.40,158.49,151.60,149.42,124.82,118.19,79.90,42.24,38.73,37.79,36.91,30.94,28.78；ms(esi)m/z 411.87(m h)

。
[0177]
4-((2-(4-((3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙基)氨甲酰基)-[2,4'-联噻唑]-2'-基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸(16)。向化合物15(100.0mg,0.24mmol)于dcm(1.0ml)中的溶液中加入琥珀酸酐(26.0mg,0.26mmol,1.08eq)。将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后将其减压浓缩。粗残余物通过使用混合物ch2cl2/meoh 95:5作为洗脱剂的快速柱色谱法纯化，得到呈无色固体的纯化合物16：86.9mg(91％)；rf＝0.43(ch2cl2/meoh 91:09)；1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.10(s,1h),8.06(s,1h),3.57(t,j＝6.8hz,2h),3.41(t,j＝6.8hz,2h),3.20(t,j＝6.8hz,2h),3.10(t,j＝6.6hz,2h),2.57
–
2.51(m,2h),2.46
–
2.41(m,2h),1.73(p,j＝6.5hz,2h),1.38(s,9h)；
13
c nmr(101mhz,cd3od)δ176.09,174.68,170.65,163.96,163.47,158.54,151.56,149.46,124.86,118.46,79.96,40.06,38.73,37.79,33.67,31.56,30.92,30.22,28.76；ms(esi)m/z 511.80(m h)

。
[0178]
4-((2-(4-((3-((叔丁氧羰基)(4-((叔丁氧羰基)氨基)丁基)氨基)丙基)氨甲酰基)-[2,4'-联噻唑]-2'-基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸-酰胺基-boc
6-新霉素(17a)。向化合物13(34.1mg,0.040mmol)于无水ch2cl2(1.0ml)中的溶液中加入edc(14.0mg,0.073mmol,1.8eq)和hosu(8.0mg,0.070mmol,1.7eq)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后加入
neo(boc)
6-nh2化合物(63.0mg,0.051,1.3eq)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入水并用ch2cl2萃取混合物。合并的有机相用水和盐水洗涤，经na2so4干燥，然后减压浓缩。粗残余物通过使用混合物ch2cl2/meoh 95:05作为洗脱剂的快速柱色谱法纯化，得到呈无色固体的纯化合物17a：37.6mg(50％)；rf＝0.43(ch2cl2/meoh 93:07)；1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.19(s,1h),8.18(s,1h),5.41(s,1h),5.10(s,1h),4.87(s,1h),4.29(s,1h),4.06(br s,1h),3.99
–
3.87(s,4h),3.76(s,2h),3.64(t,j＝6.7,1h),3.61
–
3.57(m,3h),3.57
–
3.41(m,7h),3.41
–
3.31(m,6h),3.31
–
3.12(m,7h),3.06(t,j＝6.7hz,2h),2.67
–
2.49(m,4h),2.01
–
1.92(s,1h),1.88(br s,2h),1.58(br s,2h),1.53
–
1.34(m,75h)；
13
c nmr(101mhz,cd3od)δ173.50,173.37,169.36,162.69,162.06,157.49,157.14,157.06,156.82,156.48,150.29,148.13,123.52,117.24,110.53,99.31,97.79,86.71,79.81,79.61,79.38,79.28,79.06,78.93,78.91,78.82,78.42,74.64,74.18,73.11,71.96,71.43,71.34,70.30,67.68,55.56,52.20,51.0,50.08,46.47,44.51,42.22,41.22,40.60,39.59,38.80,36.49,34.41,32.34,31.29,31.02,27.63,27.52,27.46,27.42,27.37,26.94；hrms(esi),m/z 1879.9263(m h)

(c
83h141n13o31
s2需要1879.9292)。
[0179]
4-((2-(4-((3-((叔丁氧羰基)氨基)丙基)氨甲酰基)-[2,4'-联噻唑]-2'-基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸-酰胺基-boc
6-新霉素(17b)。向化合物16(33.0mg,0.065mmol,1.8eq)于无水ch2cl2(400μl)中的溶液中加入edc(21.0mg,0.109mmol,3.1eq)和hosu(12.5mg,0.109mmol,3.1eq)。将反应混合物在室温下搅拌6小时，然后加入neo(boc)
6-nh2化合物(42.5mg,0.035mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水并且混合物用ch2cl2萃取。合并的有机相用水和盐水洗涤，经na2so4干燥，然后减压浓缩。粗残余物通过使用混合物ch2cl2/meoh 95:5作为洗脱剂的快速色谱法纯化，得到呈无色固体的纯化合物17b：产率23.2mg(39％)；rf＝0.34(ch2cl2/meoh 95:05)；1h nmr(400mhz,cd3od)δ8.19(s,2h),5.41(s,1h),5.07(s,1h),4.87(s,1h),4.29(br s,1h),4.13
–
4.01(m,1h),4.00
–
3.86(m,4h),3.76(br s,2h),3.70
–
3.42(m,10h),3.42
–
3.10(m,12h),2.67
–
2.47(m,4h),2.02
–
1.90(m,1h),1.80(p,j＝6.4,2h),1.55
–
1.31(m,64h)；
13
c nmr(101mhz,cd3od)δ174.89,174.76,170.76,164.10,163.58,158.89,158.59,158.53,158.46,158.21,157.86,151.64,149.51,124.94,118.69,111.88,100.74,99.15,88.08,81.22,80.79,80.68,80.46,80.30,80.21,80.00,76.03,75.58,74.49,73.37,72.81,72.73,71.69,69.07,56.95,53.59,52.47,51.46,43.62,42.70,42.02,40.19,38.77,37.83,35.78,33.73,32.69,32.43,30.98,29.01,28.91,28.87,28.84,28.79,28.76；hrms(esi),m/z 1707.7983(m h)

(c
74h123n12o29
s2需要1707.7955)。
[0180]
4-((2-(4-((3-((4-氨基丁基)氨基)丙基)氨甲酰基)-[2,4'-联噻唑]-2'-基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸-酰胺基-新霉素(18a)。遵循一般程序b将化合物17a(30.0mg,0.016mmol)脱保护，得到呈无色固体的纯化合物18a：产率14.8mg(86％)。保留时间3.6min；1h nmr(400mhz,d2o)δ8.24(s,1h),8.12(s,1h),5.97(d,j＝3.9hz,1h),5.41(d,j＝3.9hz,1h),5.29(d,j＝1.4hz,1h),4.37(t,j＝5.1hz,1h),4.34
–
4.22(m,4h),4.13(t,j＝9.6hz,1h),4.06
–
3.91(m,3h),3.84(br s,1h),3.79
–
3.70(m,1h),3.67
–
3.58(m,4h),3.58
–
3.31(m,10h),3.29(t,j＝6.5,2h),3.19
–
3.07(m,4h),3.04(t,j＝6.9hz,2h),2.55(s,5h),2.10
–
2.00(m,2h),1.92(q,j＝12.6hz,1h),1.85
–
1.70(m,4h)；
13
c nmr(101mhz,d2o)δ
175.40,174.70,170.87,163.67,163.44,163.09,162.98,162.73,162.38,148.79,146.96,125.02,120.68,118.86,117.78,114.88,111.98,109.41,95.77,94.91,84.91,80.56,77.34,75.21,73.35,72.28,70.34,70.11,69.84,68.08,67.57,67.40,53.16,50.79,49.55,48.47,46.92,45.13,41.35,40.45,39.96,39.01,38.74,36.22,32.06,30.78,30.58,25.74,23.87,22.73；hrms(esi),m/z 1078.5023(m h) (c
43h76n13o15
s2需要1078.5020)。
[0181]
4-((2-(4-((3-氨基丙基)氨甲酰基)-[2,4'-联噻唑]-2'-基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸-酰胺基-新霉素(18b)。遵循一般程序b将化合物17b(22.0mg,0.013mmol)脱保护，得到呈无色固体的纯化合物18b：13.1mg(100％)；保留时间2.4min；1h nmr(400mhz,d2o)δ8.23(s,1h),8.11(s,1h),5.96(d,j＝3.9hz,1h),5.40(d,j＝3.8hz,1h),5.29(br s,1h),4.36(t,j＝5.1hz,1h),4.31(t,j＝4.8hz,1h),4.30
–
4.26(m,1h),4.26
–
4.22(m,2h),4.12(t,j＝9.6hz,1h),4.06
–
3.91(m,3h),3.83(s,1h),3.74(t,j＝9.7hz,1h),3.66
–
3.48(m,9h),3.48
–
3.30(m,6h),3.28(t,j＝6.4hz,2h),3.10(t,j＝7.6hz,2h),2.59
–
2.47(m,5h),2.07
–
1.98(m,2h),1.92(q,j＝12.7hz,1h)；
13
c nmr(101mhz,d2o)δ175.39,174.68,170.86,163.60,163.44,163.09,162.93,162.74,162.39,148.83,146.96,124.95,120.67,118.87,117.77,114.87,111.97,109.40,95.78,94.91,84.90,80.56,77.34,75.21,73.35,72.28,70.33,70.11,69.84,68.08,67.56,67.39,53.15,50.79,49.55,48.46,41.34,40.44,39.96,39.00,37.05,36.22,32.06,30.78,30.57,27.88,26.80；hrms(esi),m/z 1007.4287(m h)

(c
39h67n12o15
s2需要1007.4285)。
[0182]
实施例2：本发明化合物的生物活性
[0183]
a-材料
[0184]
巢蛋白(mab5326)和h3pser10(ab-5176)抗体分别购自millipore(millipore s.a.s.,39route industrielle de la hardt molsheim alsace 67120,法国)和abcam(24rue louis blanc,75010,法国巴黎)。细胞增殖试剂盒xtt测定(参考号：11465015001)购自roche diagnostic(2,avenue du vercors,bp 59,38242meylan cedex,法国)。heparg、hek293、培养基和补充剂购自thermo fisher scientific。tmz由dr chneiweiss,cal提供？
[0185]
b-细胞培养：从尼斯大学医院(university hospital of nice)的神经外科提供的人原发性gbm的手术切除中分离出患者来源的细胞gb5。tg6(来自原发性gbm的患者来源细胞)和hnnsc25(人正常神经干细胞)由巴黎皮埃尔和玛丽居里大学(university of pierre and marie curie,paris)的herv
é
chneiweiss博士提供。所得原代培养物(gb5、tg6、hnnsc25)在含有egf和bfgf(dmem-f12 1/1比率，10mm谷氨酰胺、10mm hepes、0.025％碳酸氢钠、n2、g5和b27)的ns34 培养基中生长。
[0186]
heparg
tm
是源自人类肝祖细胞的终末分化肝细胞，其保留了原代人肝细胞的许多特性。heparg在补充有tox培养基补充剂和glutamax的william's e培养基中生长。
[0187]
hek293(人胚肾细胞)在补充有glutamax和10％胎牛血清的dmem中生长。
[0188]
c-方法：
[0189]
克隆增殖：将tg6和gb5以10个细胞/孔接种在96孔板中的仅ns34 培养基中或含有增加浓度的化合物9a-b和18a-b的ns34 培养基中。接种后立即通过直接计数确定孔中的实
际细胞数。两周和三周后，通过直接计数评价每个孔中的所得球体数目。克隆效率的％是通过将接种在孔中的细胞数目除以所得球体数目来计算的。
[0190]
ii-xtt测定：将tg6和gb5以2000个细胞/孔接种在96孔板中的仅ns34 中或含有10、20、25、50和100um化合物9a-b和18a-b的ns34 中。将培养物温育4天，并按照制造商的指示评价细胞增殖。
[0191]
iii-免疫荧光测定：将tg6和gb5以2000个细胞/孔接种在24孔板中的仅ns34 或中含有5、7.5、10、12.5、15、20和25um化合物9a-b和18a-b的ns34 中。将培养物温育4天，并且细胞在室温下用4％多聚甲醛固定10分钟，然后用pbs洗涤。然后将细胞与20mm氯化铵在室温下温育5分钟并用pbs洗涤5次。在含有10％fcs和0.1％triton x100的pbs中实现封闭和杂交。将抗巢蛋白和抗h3磷酸丝氨酸10抗体在室温下温育2小时，然后用pbs洗涤。荧光偶联二抗和hoechst 33342核复染试剂在室温下杂交一小时。用抗褪色剂固定细胞，然后使用荧光显微镜(tie nikon)和nis软件(nikon)对细胞进行成像、计数和量化。
[0192]
iv-tmz测定：将tg6和gb5以2000个细胞/孔接种在96孔板中的ns34 中或用仅含有400um tmz或与10、25和50um化合物9a-b和18a-b混合的培养基处理。将培养物温育4天，并且通过xtt测定和台盼蓝染色计数活细胞和死细胞来评价细胞活力。
[0193]
v-毒性测试：将nnsc、gb5、tg6、hek293和heparg、huvec以2000个细胞/孔接种在96孔板中的其各自单独的培养基中或含有10至500um的增加浓度的化合物9a-b的培养基中。将培养物温育4天，并通过xtt测定评价细胞毒性。还通过台盼蓝染色计数活细胞和死细胞来评估细胞活力。
[0194]
结果
[0195]
患者来源的胶质瘤干细胞(gsc或gic)的分化伴随着其行为和形态的深切变化。事实上，在确定的培养基中以3d生长时，它们会变得贴壁并采用分化细胞的典型形态，通常以弱核/细胞质比和细胞溶质延伸例示。随着这些表型变化，例如巢蛋白、nanog、oct4、sox2的干性标志物被下调，并且gsc致瘤性以及其克隆扩增效率受到抑制。
[0196]
1)化合物处理对gsc表型的影响：
[0197]
患者来源的gsc(gb5)在三天内用增加浓度的化合物9a-b和18a-b(10至100um)进行处理。10um的化合物9a-b和18a以及25um的化合物18b诱导粘附和gsc形态的变化，这让人联想到培养中的分化gbm细胞(图1)。tg6也获得了类似的结果。
[0198]
2)化合物处理对干性特性和致瘤性的影响：
[0199]
患者来源的gsc(gb5)已经用能够诱导gsc形态变化的增加浓度的化合物处理七天。为了评估对干性维持的影响，我们通过免疫荧光观察了干性和祖细胞如巢蛋白的表达。如表1和图2a所示，结果显示当gsc已经用化合物9a-b和18a处理时巢蛋白表达下降。用化合物9a处理获得了最强的效应(ic50＝10um)。在化合物9a处理后观察到oct4、nanog和sox2表达的类似效应(图2b)。
[0200]
进一步研究了所选化合物对gsc克隆扩增以及其有丝分裂能力的影响(图2b和图2c)。化合物9a-b和18a处理改变了gsc克隆扩增和有丝分裂。化合物9a处理提供了对克隆扩增最有效的抑制(ic50《10um)，而化合物9a-b都对有丝分裂抑制最有效(ic50《10um)(图2c和图2d)。
[0201]
通过发光性患者来源的gsc对裸鼠进行原位异种移植。注射后两周，向小鼠腹膜内
注射10mg/kg(n＝4)、7.5mg/kg(n＝4)或5mg/kg(n＝4)的化合物9a或单独的媒介物作为对照(ctl n＝10)，一周三天(周一、周三、周五，周末暂停)。每周，每只小鼠都进行实时成像(ivis lumina iii)以检测肿瘤的发生和进展。在对照组中，所有对照小鼠都发展了肿瘤。在化合物9a处理的小鼠中，12只小鼠中只有两只小鼠(分别在10mg/kg和5mg/kg处理组中的一只)发展了肿瘤。图3a是对照组(n＝10)和每个化合物9a处理组中肿瘤生长平均值的图示(注意，处理组中已经发展出肿瘤的两只小鼠已被排除在平均值之外)。图3b显示了根据kaplan meier方法(r命令，https://biostatgv.sentiweb.fr/？module＝tests/surv)使用对数秩检验比较的未处理组和处理组的整个小鼠群体的存活率。在该图中，表示了处理组中已经发展出肿瘤的两只小鼠。根据这些结果，因此从已经通过发光性患者来源的gsc原位异种移植的裸鼠观察到，以10mg/kg、7.5mg/kg和5mg/kg腹膜内注射的化合物9a处理阻止了肿瘤的发生和发展(图3a和图3b)。
[0202]
为了进一步确定化合物9a是否也可能改变治疗前已经形成的肿瘤的肿瘤生长，将用于发光性活体成像的50000个表达荧光素酶基因(gb1-luc)的gsc注射到12只裸鼠的脑中。当肿瘤达到包括在每秒2.106和1.107之间的总光子通量的适当大小时，用dmso(n＝6)或化合物9a(n＝6)以7.5mg/kg的剂量治疗小鼠，每周三次，周末暂停。每周通过实时成像控制肿瘤生长。如图3c所示的结果(对照：
‑▲‑
；和化合物9a：
‑■‑
)，表明化合物9a抑制了肿瘤生长。第11周两组间差异显著，***p值＝0,017。总之，这些结果表明，化合物9a不仅抑制了肿瘤的发生和发展，而且抑制了已经形成的肿瘤的生长。
[0203]
3)化合物处理对细胞存活的影响：
[0204]
xtt测定允许通过细胞代谢测量来确定细胞毒性/细胞抑制作用。通过如材料和方法部分中所述的xtt测定测试化合物9a-b和18a的最终毒性。在10至25um的工作浓度下，所述化合物对gsc没有毒性(图4a)。然而，化合物9a-b和18a在50um和更高浓度下显示出相对毒性(图4a)。这些xtt结果通过台盼蓝染色得到证实，其直接揭示了死细胞的百分比。在正常神经干细胞(nnsc)、人肾(nhek)、人肝细胞(heprg)和人内皮细胞(huvec)上进一步测试了化合物9a的毒性。当在10至50um之间使用时，所述化合物对nnsc、nhek、heprg和huvec细胞没有毒性。在100um及以上，化合物9a有毒(图4)。
[0205]
4)化合物9a-b和18b对于gsc对替莫唑胺(tmz)的敏感性的影响：
[0206]
替莫唑胺是gbm治疗的参考化学疗法。为了评估所述化合物是否可能使gsc对tmz敏感，将tmz(400um)预处理的gb5细胞与10、25和50um的化合物9a-b和18b一起温育。三天后，停止实验，并且对细胞进行xtt测定。在10um时，结果显示化合物9a-b和18b的tmz敏感性分别增加了2倍、1.8倍和1.7倍(图5)。在50um时观察到化合物9a-b和18b的最大效应分别为2.9倍、2.8倍和3倍。通过台盼蓝染色确认细胞毒性。