用于治疗B细胞恶性肿瘤的靶向细胞表面标记物CD72的免疫疗法

用于治疗b细胞恶性肿瘤的靶向细胞表面标记物cd72的免疫疗法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年7月3日提交的第62/870,463号美国临时申请的优先权，出于所有目的，通过引用将其并入本文。
3.关于在联邦政府资助的研究与开发下完成的发明权利的声明
4.这项发明是在国家卫生研究院授予的k08 ca184116和od022552号政府资助下完成的。政府对本发明享有某些权利。
5.发明背景
6.尽管在血液恶性肿瘤的治疗方面取得了巨大的进步，但许多患者的临床结果仍然很差。据估计，仅在2020年，美国就将有近17.8万人被诊断患有血癌，而超过5.6万人将死亡。(cancer facts&figures,2020.美国癌症学会；2020)。尽管cd19或cd22导向的car-t等新免疫疗法的开发已经取得了显著的初始反应率，但这些患者中的很大一部分最终会复发。因此，治疗难治性b细胞恶性肿瘤需要新的策略，尤其是靶向car-t细胞的替代性表面靶标。
7.发明各方面的简要总结
8.利用b-all细胞系的细胞表面蛋白组学和对患者样本的分析，以鉴定b-all上特异性富集的细胞表面标记物，cd72被鉴定为可能的替代性免疫治疗靶点，与当前的cd19和cd22导向疗法正交且互补。cd72是一种丰度很高的细胞表面蛋白，在白血病和淋巴瘤细胞上富集，类似于目前临床上免疫治疗靶向的典型b细胞标记物cd19和cd22。因此，本文提供可用于诊断和治疗目的的抗-cd72纳米抗体，例如用于开发针对表达cd72的恶性肿瘤的car-t疗法。
9.在一个方面，本文提供了一种特异性结合cd72的纳米抗体，其中该纳米抗体包括：
10.(a)包含tifdwys的cdr1序列、包含lvagidtgan的cdr2序列和包含ahddgdpwhv的cdr3序列；
11.(b)包含sisdrya的cdr1序列、包含lvagiaegsn的cdr2序列和包含ahdgwyd的cdr3序列；
12.(c)包含tifqnld的cdr1序列、包含lvagisygss的cdr2序列和包含vyt的cdr3序列；
13.(d)包含nissisd的cdr1序列、包含lvagigggan的cdr2序列和包含ahgywgwthe的cdr3序列；
14.(e)包含tifpvdy的cdr1序列、包含lvaginygsn的cdr2序列和包含awqpegyavdfyhp的cdr3序列；
15.(f)包含sisdwyd的cdr1序列、包含fvatiangsn的cdr2序列和包含alvgpddngwywld的cdr3序列；
16.(g)包含tispidi的cdr1序列、包含fvaaialggn的cdr2序列和包含vgyvdkwddsdyht的cdr3序列；或
17.(h)包含sisrigd的cdr1序列、包含lvaaiaaggt的cdr2序列和包含ashetqptqlv的
cdr3序列。
18.在一些实施方式中，纳米抗体包含：
19.(a)包含sisrigd的cdr1序列、包含lvaaiaaggt的cdr2序列和包含ashetqptqlv的cdr3序列；
20.(b)包含tispidi的cdr1序列，包含fvaaialggn的cdr2序列，和包含vgyvdkwddsdyht的cdr3序列；或
21.(c)包含tifqnld的cdr1序列、包含lvagisygss的cdr2序列和包含vyt的cdr3序列。
22.在一些实施方式中，纳米抗体包括包含tispidi的cdr1序列、包含fvaaialggn的cdr2序列和包含vgyvdkwddsdyht的cdr3序列。在一些实施方式中，框架与人抗体重链框架，例如vh3家族成员具有至少80％的相同性。在一些实施方式中，纳米抗体包含与包括fr1序列qvqlqesggglvqaggslrlscaas、fr2序列mgwyrqapgkere、fr3序列tyyadsvkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyyca和fr4序列ywgqgtqvtvss的框架具有至少80％、或至少85％、至少90％、或至少95％相同性的框架。
23.本文还公开了一种特异性结合cd72的纳米抗体，其中纳米抗体包括：
24.(a)包含tifdwys的cdr1序列、包含lvagidtgan的cdr2序列和包含ahddgdpwhv的cdr3序列；其中cdr1、cdr2或cdr3中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；
25.(b)包含sisdrya的cdr1序列、包含lvagiaegsn的cdr2序列和包含ahdgwyd的cdr3序列；其中cdr1、cdr2或cdr3中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；
26.(c)包含tifqnld的cdr1序列、包含lvagisygss的cdr2序列和包含vyt的cdr3序列；其中cdr1、cdr2或cdr3中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；
27.(d)包含nissisd的cdr1序列、包含lvagigggan的cdr2序列和包含ahgywgwthe的cdr3序列；其中cdr1、cdr2或cdr3中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；
28.(e)包含tifpvdy的cdr1序列、包含lvaginygsn的cdr2序列和包含awqpegyavdfyhp的cdr3序列；其中cdr1、cdr2或cdr3中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；
29.(f)包含sisdwyd的cdr1序列、包含fvatiangsn的cdr2序列和包含alvgpddngwywld的cdr3序列；其中cdr1、cdr2或cdr3中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；
30.(g)包含tispidi的cdr1序列、包含fvaaialggn的cdr2序列和包含vgyvdkwddsdyht的cdr3序列；其中cdr1、cdr2或cdr3中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；或
31.(h)包含sisrigd的cdr1序列、包含lvaaiaaggt的cdr2序列和包含ashetqptqlv的cdr3序列；其中cdr1、cdr2或cdr3中的至少一个具有1或2个氨基酸取代。
32.本文还公开了一种特异性结合cd72的纳米抗体，其中纳米抗体包括：
33.(a)包含tisssad的cdr1序列、包含lvagidrgsn的cdr2序列和包含aeevgtgedddgadsyhg的cdr3序列；或其变体，其中cdr中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；
34.(b)包含tisrdrd的cdr1序列、包含lvatispggt的cdr2序列和包含ayaaveeddskyyiqdfa的cdr3序列；或其变体，其中cdr中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；
35.(c)包含tiftlpd的cdr1序列、包含vagiaggss的cdr2序列和包含vgyvaessdfydysnyhe的cdr3序列；或其变体，其中cdr中的至少一个具有1或2个氨基酸取
代；
36.(d)包含nispqhd的cdr1序列、包含lvatitqgat的cdr2序列和包含allyatdpdyvyhvyhv的cdr3序列；或其变体，其中cdr中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；
37.(e)包含tifdyyd的cdr1序列、包含lvagistgti的cdr2序列和包含aettspvvgvdtlwyg的cdr3序列；或其变体，其中cdr中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；
38.(f)包含sifhyyd的cdr1序列、包含lvatidpggt的cdr2序列和包含aystqrndpetyyld的cdr3序列；或其变体，其中cdr中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；
39.(g)包含yifqdld的cdr1序列、包含lvatitnggn的cdr2序列和包含ahfyyvgygddehd的cdr3序列；或其变体，其中cdr中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；
40.(h)包含nissstd的cdr1序列、包含lvatislggn的cdr2序列和包含vfeklgledplylk的cdr3序列；或其变体，其中cdr中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；
41.(i)包含tifdwwd的cdr1序列、包含lvatisyggn的cdr2序列和包含vfipgqwrdyyalt的cdr3序列；或其变体，其中cdr中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；
42.(j)包含nishpah的cdr1序列、包含fvaaiddgsi的cdr2序列和包含vwqetsvrlgiyfl的cdr3序列；或其变体，其中至少一个cdr中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；
43.(k)包含sisdgdd的cdr1序列、包含fvatidvggn的cdr2序列和包含aaavddrdgyyyll的cdr3序列；或其变体，其中cdr中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；
44.(l)包含nifelyd的cdr1序列、包含lvagitygan的cdr2序列和包含vhavnygyla的cdr3序列；或其变体，其中cdr中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；
45.(m)包含sisapdd的cdr1序列、包含lvagidlggn的cdr2序列和包含ahsteppayg的cdr3序列；或其变体，其中cdr中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；
46.(n)包含tifwqvd的cdr1序列、包含lvagitsgtn的cdr2序列和包含ahwpynqtyt的cdr3序列；或其变体，其中cdr中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；
47.(o)包含nifwyap的cdr1序列、包含lvasiadgts的cdr2序列和包含aysedardls的cdr3序列；或其变体，其中cdr中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；
48.(p)包含nifsdfd的cdr1序列、包含lvagisvgsn的cdr2序列和包含aetvkvdylf的cdr3序列；或其变体，其中cdr中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；
49.(q)包含tifvsgp的cdr1序列、包含fvatitdgas的cdr2序列和包含vadphdyyhh的cdr3序列；或其变体，其中cdr中的至少一个具有1或2个氨基酸取代；或
50.(r)包含nisryv的cdr1序列、包含lvagidvgai的cdr2序列和包含vwhylgyvla的cdr3序列；或其变体，其中cdr中的至少一个具有1或2个氨基酸取代。
51.在一些实施方式中，抗体包括可变区，其包括：
52.(a)包含tisssad的cdr1序列、包含lvagidrgsn的cdr2序列和包含aeevgtgedddgadsyhg的cdr3序列；
53.(b)包含tisrdrd的cdr1序列、包含lvatispggt的cdr2序列和包含ayaaveeddskyyiqdfa的cdr3序列；
54.(c)包含tiftlpd的cdr1序列、包含vagiaggss的cdr2序列和包含vgyvaessdfydysnyhe的cdr3序列；
55.(d)包含nispqhd的cdr1序列、包含lvatitqgat的cdr2序列和包含
allyatdpdyvyhvyhv的cdr3序列；
56.(e)包含tifdyyd的cdr1序列、包含lvagistgti的cdr2序列和包含aettspvvgvdtlwyg的cdr3序列；
57.(f)包含sifhyyd的cdr1序列、包含lvatidpggt的cdr2序列和包含aystqrndpetyyld的cdr3序列；
58.(g)包含yifqdld的cdr1序列、包含lvatitnggn的cdr2序列和包含ahfyyvgygddehd的cdr3序列；
59.(h)包含nissstd的cdr1序列、包含lvatislggn的cdr2序列和包含vfeklgledplylk的cdr3序列；
60.(i)包含tifdwwd的cdr1序列、包含lvatisyggn的cdr2序列和包含vfipgqwrdyyalt的cdr3序列；
61.(j)包含nishpah的cdr1序列、包含fvaaiddgsi的cdr2序列和包含vwqetsvrlgiyfl的cdr3序列；
62.(k)包含sisdgdd的cdr1序列、包含fvatidvggn的cdr2序列和包含aaavddrdgyyyll的cdr3序列；
63.(l)包含nifelyd的cdr1序列、包含lvagitygan的cdr2序列和包含vhavnygyla的cdr3序列；
64.(m)包含sisapdd的cdr1序列、包含lvagidlggn的cdr2序列和包含ahsteppayg的cdr3序列；
65.(n)包含tifwqvd的cdr1序列、包含lvagitsgtn的cdr2序列和包含ahwpynqtyt的cdr3序列；
66.(o)包含nifwyap的cdr1序列、包含lvasiadgts的cdr2序列和包含aysedardls的cdr3序列；
67.(p)包含nifsdfd的cdr1序列、包含lvagisvgsn的cdr2序列和包含aetvkvdylf的cdr3序列；
68.(q)包含tifvsgp的cdr1序列、包含fvatitdgas的cdr2序列和包含vadphdyyhh的cdr3序列；或
69.(r)包含nisryv的cdr1序列、包含lvagidvgai的cdr2序列和包含vwhylgyvla的cdr3序列。
70.在另一个方面中，本文提供了一种嵌合抗原受体(car)，其包含抗原结合域、跨膜域和胞内域，所述胞内域包含共刺激域和/或主要信号转导域，其中所述抗原结合域包含如本文，例如在本节前面的段落中所述的抗cd72纳米抗体。在一些实施方式中，car包含抗原结合域、跨膜域和包含共刺激域和/或主要信号转导域的胞质信号转导域，其中抗原结合域包含纳米抗体，包括：
71.(a)包含sisrigd的cdr1序列、包含lvaaiaaggt的cdr2序列和包含ashetqptqlv的cdr3序列；
72.(b)包含tispidi的cdr1序列，包含fvaaialggn的cdr2序列，和包含vgyvdkwddsdyht的cdr3序列；或
73.(c)包含tifqnld的cdr1序列、包含lvagisygss的cdr2序列和包含vyt的cdr3序列。
74.在一些实施方式中，抗原结合域包含从以下组中选择的两个、三个或四个纳米抗体：
75.(a)含有包含tifdwys的cdr1序列、包含lvagidtgan的cdr2序列和包含ahddgdpwhv的cdr3序列的纳米抗体；
76.(b)含有包含sisdrya的cdr1序列、包含lvagiaegsn的cdr2序列和包含ahdgwyd的cdr3序列的纳米抗体；
77.(c)含有包含tifqnld的cdr1序列、包含lvagisygss的cdr2序列和包含vyt的cdr3序列的纳米抗体；
78.(d)含有包含nissisd的cdr1序列、包含lvagigggan的cdr2序列和包含ahgywgwthe的cdr3序列的纳米抗体；
79.(e)含有包含tifpvdy的cdr1序列、包含lvaginygsn的cdr2序列和包含awqpegyavdfyhp的cdr3序列的纳米抗体；
80.(f)含有包含sisdwyd的cdr1序列、包含fvatiangsn的cdr2序列和包含alvgpddngwywld的cdr3序列的纳米抗体；
81.(g)含有包含tispidi的cdr1序列、包含fvaaialggn的cdr2序列和包含vgyvdkwddsdyht的cdr3序列的纳米抗体；和
82.(h)含有包含sisrigd的cdr1序列、包含lvaaiaaggt的cdr2序列和包含ashetqptqlv的cdr3序列的纳米抗体。
83.在一些实施方式中，抗原结合域包含从以下组中选择的一个、两个或三个纳米抗体：
84.(a)含有包含sisrigd的cdr1序列、包含lvaaiaaggt的cdr2序列和包含ashetqptqlv的cdr3序列的纳米抗体；
85.(b)含有包含tispidi的cdr1序列、包含fvaaialggn的cdr2序列和包含vgyvdkwddsdyht的cdr3序列的纳米抗体；和
86.(c)含有包含tifqnld的cdr1序列、包含lvagisygss的cdr2序列和包含vyt的cdr3序列的纳米抗体。
87.在一些实施方式中，car是标准car、分裂car、闭-开关car、开-开关car、第一代car、第二代car、第三代car或第四代car。
88.在另一方面，本文提供了合成的notch受体，其包括至少一个抗-cd72纳米抗体，其包括：
89.(a)包含sisrigd的cdr1序列、包含lvaaiaaggt的cdr2序列和包含ashetqptqlv的cdr3序列；
90.(b)包含tispidi的cdr1序列，包含fvaaialggn的cdr2序列，和包含vgyvdkwddsdyht的cdr3序列；或
91.(c)包含tifqnld的cdr1序列、包含lvagisygss的cdr2序列和包含vyt的cdr3序列。在一些实施方式中，抗原结合域包含从以下组中选择的两个、三个或四个纳米抗体：
92.(a)含有包含tifdwys的cdr1序列、包含lvagidtgan的cdr2序列和包含ahddgdpwhv的cdr3序列的纳米抗体；
93.(b)含有包含sisdrya的cdr1序列、包含lvagiaegsn的cdr2序列和包含ahdgwyd的
cdr3序列的纳米抗体；
94.(c)含有包含tifqnld的cdr1序列、包含lvagisygss的cdr2序列和包含vyt的cdr3序列的纳米抗体；
95.(d)含有包含nissisd的cdr1序列、包含lvagigggan的cdr2序列和包含ahgywgwthe的cdr3序列的纳米抗体；
96.(e)含有包含tifpvdy的cdr1序列、包含lvaginygsn的cdr2序列和包含awqpegyavdfyhp的cdr3序列的纳米抗体；
97.(f)含有包含sisdwyd的cdr1序列、包含fvatiangsn的cdr2序列和包含alvgpddngwywld的cdr3序列的纳米抗体；
98.(g)含有包含tispidi的cdr1序列、包含fvaaialggn的cdr2序列和包含vgyvdkwddsdyht的cdr3序列的纳米抗体；和
99.(h)含有包含sisrigd的cdr1序列、包含lvaaiaaggt的cdr2序列和包含ashetqptqlv的cdr3序列的纳米抗体。
100.在一些实施方式中，合成notch受体的抗原结合域包括选自下组的一个、两个或三个纳米抗体：
101.(a)含有包含sisrigd的cdr1序列、包含lvaaiaaggt的cdr2序列和包含ashetqptqlv的cdr3序列的纳米抗体；
102.(b)含有包含tispidi的cdr1序列、包含fvaaialggn的cdr2序列和包含vgyvdkwddsdyht的cdr3序列的纳米抗体；和
103.(c)含有包含tifqnld的cdr1序列、包含lvagisygss的cdr2序列和包含vyt的cdr3序列的纳米抗体。
104.在另一个方面中，本文提供了一种免疫效应细胞，其包含car或合成notch受体，其包含如本文所述的一个或多个抗-cd72纳米抗体，例如如前述段落所述。在一些实施方式中，免疫效应细胞是t淋巴细胞或自然杀伤(nk)细胞。在一些实施方式中，免疫效应细胞是来自将用免疫效应细胞治疗的对象的自体细胞。在其他实施方式中，免疫效应细胞是同种异体细胞。
105.在另一方面，本文提供了一种治疗包含表达cd72的恶性b细胞的血液恶性肿瘤或包含表达cd72的恶性髓细胞的恶性肿瘤的方法，该方法包括给予患有血液恶性肿瘤的对象经基因修饰以表达本文所述的一个或多个抗cd72纳米抗体的多个免疫效应细胞。在一些实施方式中，血液恶性肿瘤是b细胞白血病，例如慢性淋巴细胞白血病。在一些实施方式中，血液恶性肿瘤为混合谱系白血病(mll)。在一些实施方式中，血液恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方式中，血液恶性肿瘤为多发性骨髓瘤。
106.此外，本文还提供了编码如本文所述的抗-cd72纳米抗体的多核苷酸。在进一步的实施方式中，本发明提供了编码包含本发明的一个或多个抗-cd72纳米抗体的car的多核苷酸。此外，本发明提供了包含此类多核苷酸的载体和包含这些多核苷酸的哺乳动物宿主细胞，例如免疫效应细胞。在一些实施方式中，载体为逆转录病毒载体，例如自失活慢病毒载体。在一些实施方式中，免疫效应细胞是t淋巴细胞或nk细胞。
107.附图简要说明
108.图1a-d:mllr b-all细胞表面组的多组学分析揭示了独特的细胞表面特征和存活
no:2)和nb.c2(纳米抗体序列seq id no:1)在酵母上的结合，以确定估计的结合亲和力。kd通过非线性最小二乘回归曲线拟合确定。(e)酵母克隆nb.c2与10nm cd72-ecd-fc蛋白(左)或10nm fc蛋白(右)结合的流式细胞计数图。y轴显示抗-生物素-apc信号(对应于酵母与重组蛋白的结合)，x轴显示抗-ha-fitc信号(对应于酵母表面显示的纳米抗体)。
112.图5a-f:基于纳米抗体的cd72-car t对b-all细胞系显示出强大的体外细胞毒性(a)cd72导向的纳米抗体序列被纳入第二代car骨架设计，包括cd8铰链和跨膜结构域(tm)、4-1bb共刺激结构域和活化域。(b)jurkat活化试验测量八种候选纳米抗体car构建物的抗原依赖性和非依赖性的信号转导。jurkat-car与cd72-阴性细胞系amo1(抗原非依赖性)或cd72-阳性细胞系rs411(抗原依赖性)一起孵育过夜(1:1比例)。通过cd69平均荧光强度(mfi)测量的活化相对于同种型对照mfi标准化(左侧y轴)。抗原依赖性mfi与抗原非依赖性mfi的比率用圆圈(右侧y轴)表示。(c)cd72 car-t克隆对sem或rs411细胞系的体外细胞毒性。以1:1的比例共培养24小时后，使用draq7染色测定细胞毒性。facs图显示了单点实验中draq7 细胞的百分数。柱状图显示对cd19car-t细胞毒性标准化的cd72 car-t克隆的细胞毒性百分数。(d-f)18种不同的cd72 car-t与sem细胞系(用萤火虫荧光素酶标记)以不同的效应物对靶标比例共培养8小时的体外细胞毒性。y轴显示特异性裂解百分数，而x轴显示效应物与靶标比。使用生物发光测量的细胞毒性。实验一式三份进行，信号对只含有靶细胞的对照孔标准化。数据表示成平均值 /-sem。效应细胞的等同物被调整为car 细胞的百分比。
113.图6a-d:cd72(nb.d4)car-t对多种b细胞恶性肿瘤的体外细胞毒性cd72(nb.d4)、cd19或空白car-t对白血病和淋巴瘤细胞系在不同效应物：靶标比下的细胞毒性，共培养4小时。(a)对sem细胞系(b-all)的细胞毒性。(b)对jeko-1细胞系(套细胞淋巴瘤)的细胞毒性。(c)对namalwa细胞系(burkitt淋巴瘤)的细胞毒性。(d)对hbl1细胞系(dlbcl)的细胞毒性。所有靶细胞均稳定表达增强的萤火虫荧光素酶，以便通过生物发光成像进行活力测量。实验一式三份进行，信号对只含有靶细胞的对照孔标准化。数据表示成平均值 /-sem。效应细胞的等同物被调整为car 细胞的百分比。
114.图7a-c:cd72(nb.d4)car-t对基因编辑的b-all细胞系的体外细胞毒性cd72(nb.d4)、cd19或空白car-t对亲代或基因编辑的sem细胞系在不同效应物：靶标比下的细胞毒性，共培养48小时。(a)对野生型sem细胞的细胞毒性。(b)对cd19-敲减的crispri编辑的sem细胞的细胞毒性。(c)对cd72-敲减的crispri编辑的sem细胞的细胞毒性。所有靶细胞均稳定表达增强的萤火虫荧光素酶，以便通过生物发光成像进行活力测量。实验一式三份进行，信号对只含有靶细胞的对照孔标准化。数据表示成平均值 /-sem。效应细胞的等同物被调整为car 细胞的百分比。
115.图8a-c:cd72 car t可在b-all细胞系和异种移植物模型中根除肿瘤并延长存活时间。nsg小鼠注射1e6萤火虫-荧光素酶标记的肿瘤细胞，包括mllr b-all患者来源的异种移植物、亲代sem mllr b-all细胞系和cd19-敲减的crispri sem细胞系(cd19-mllr b-all)。在确认植入后，在第10天(mllr b-all pdx)或第3天(亲代和cd19-sem mllr b-all)用单剂5e6的car-t细胞(1:1cd8/cd4混合物)治疗小鼠。通过生物发光成像(bli)每周评估一次肿瘤负荷，持续五周，然后跟踪小鼠的存活情况。接受(a)mllr b-all pdx并在第10天用不同的car t细胞处理(n＝6只/臂)；(b)sem b-all细胞，在第3天用不同的car t细胞处
理(n＝6/臂)；(c)cd19-阴性sem b-all细胞，在第3天用不同的car t细胞处理(n＝6/臂)的小鼠的存活曲线和通过bli的肿瘤负荷。使用对数秩检验计算p值，将不同的car构建物与空白car对照进行比较，但8c除外，其中cd72 car直接与cd19 car进行比较。
具体实施方式
116.术语
117.本文所用术语“一个”、“一种”或“该/所述”不仅包括一个构建的方面，还包括一个以上构建的方面。例如，除非另有明确说明，单数形式的“一个”，“一种”和“该/所述”包括复数指代物。因此，例如，提到“一个细胞”则包括多个/种这样的细胞，且提到“该/所述试剂”则包括本领域技术人员已知的一个/种或多个/种试剂等等。
118.本文使用的术语“约”是指本技术领域技术人员容易知晓的各值的通常误差范围。例如，对于kd和ic
50
值，
±
20％、
±
10％或
±
5％在所述值的预期含义范围内。
[0119]“b细胞分化抗原cd72”或“cd72”(也称为lyb-2)在本文中指由细胞遗传学定位于人类染色体9p13.3(基因组坐标(grch38/hg38组装，2013年12月：9:35,609,978-35,618,426)的cd72基因编码并在b细胞增殖和分化中发挥作用的多肽。由cd72基因编码的人cd72蛋白序列可见uniprot登录号p21854。cd72是一种单次ii型膜蛋白，具有胞外c型凝集素结构域和胞质itim基序。cd72已被证明与b细胞受体复合物相互作用，并在b细胞信号转导的正常功能中发挥作用。它类似于cd22受体，也具有胞质itim基序。cd72和cd22的itim基序都可以与shp-1结合，其是一种可以与bcr信号转导链成员相互作用并抑制bcr信号转导的蛋白质，是形成b细胞免疫耐受的一部分。对小鼠进行cd72基因消融并不致命，但这类小鼠的免疫系统活化增强，为其作为bcr抑制分子的作用提供了证据。因此，cd72被认为是bcr信号转导的抑制性受体。
[0120]
本文中使用的术语“纳米抗体”是指包含单个单体可变抗体结构域的单域抗体，该单体可变抗体结构域可以形成功能性抗原结合位点，而不与另一可变结构域相互作用，例如，没有传统4链单克隆抗体的vh和vl结构域之间所需要的vh/v相互作用)。如下文进一步详述的，在一些实施方式中，本发明的纳米抗体可纳入具有各种形式的抗体中，包括例如包含其他抗体结合域的二价或多价抗体形式，其可具有相同或不同的结合特异性。因此，本发明的纳米抗体可以是较大分子的一部分，例如多价或多特异性免疫球蛋白，其包括一个以上的部分、结构域或单元。纳米抗体也可以是包含另一功能元件如半衰期延长剂(hle)、靶向单元和/或小分子例如聚乙二醇(peg)的较大分子的一部分。术语“纳米抗体”包括本文所述纳米抗体的人源化形式。
[0121]
如本文所用，“v区”是指抗体，例如纳米抗体、可变区结构域，包括框架1、cdr1、框架2、cdr2和框架3的区段，包括cdr3和框架4，这些区段由于b细胞分化期间v区基因重排而添加到v区段。
[0122]
如本文所用的“互补决定区(cdr)”是指中断可变结构域的四个“框架”区域的三个高变区(hvr)。cdr是与抗原表位结合的主要原因。cdr被称为cdr1、cdr2和cdr3，从n端开始顺序编号。术语“cdr”可与“hvr”互换使用。
[0123]
cdr和框架区的氨基酸序列可以使用本领域的各种已知定义来确定，例如kabat、chothia、国际immunogenetics数据库(imgt)，和abm(例如，见johnson等人，见上文；
chothia和lesk，1987，《免疫球蛋白高变区的标准结构》，j.mol.biol.196，901-917；chothia c.等人，1989，《免疫球蛋白高变区的构象》,nature342,877-883；chothia c.等人，1992年，《人vh区段的结构库》j.mol.biol.,227,799-817；al-lazikani等人，j.mol.biol 1997，273(4))。抗原结合位点的定义如下：ruiz等人,imgt,国际immunogenetics数据库，nucleic acids res.,28,219
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221(2000)；和lefranc,m.-p.imgt,国际immunogenetics数据库，nucleic acids res.1月1日；29(1):207-9(2001)；maccallum等人,抗体-抗原相互作用：接触分析和结合位点形貌(antibody-antigen interactions:contact analysis and binding site topography),j.mol.biol.,262(5),732-745(1996)；和martin等人,proc.natl acad.sci.usa,86,9268
–
9272(1989)；martin等人,methods enzymol.,203,121
–
153,(1991)；pedersen等人，immunomethods,1,126,(1992)；和rees等人,in sternberg m.j.e.(编),《蛋白质结构预测》(protein structure prediction).牛津大学出版社,oxford,141
–
172 1996)。例如，根据kabat编号确定的cdr编号基于kabat等人，《免疫感兴趣蛋白质的序列》(sequences of proteins of immunological interest)，第五版，国家卫生研究所公共卫生服务，bethesda，md(1991年))。chothia cdr根据chothia的定义确定(参见例如chothia和lesk j.mol.biol.196:901-917(1987))。
[0124]“表位”或“抗原决定簇”是指抗体与之结合的抗原上的部位。表位既可以由连续氨基酸形成，也可以由蛋白质三级折叠并列的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包含呈现独特空间构象的至少3个、更通常至少5个或约8-10个氨基酸。确定表位空间构型的方法包括，例如，x射线晶体学和二维核磁共振。见例如“分子生物学方法中的表位映射方案”，第66卷，glenn e.morris编(1996)。
[0125]
本文使用的术语“价态”是指抗体对于一种抗原的不同结合位点的数量。单价抗体包含对抗原的一个结合位点。多价抗体包含多个结合位点。
[0126]
短语“特异性(或选择性地)结合”抗原或靶，或“特异性(或选择性地)与
……
免疫反应”，当指蛋白质或肽时，指抗体结合到感兴趣的抗原或靶的结合反应。在本发明中，抗体与cd72结合的kd至少比其对其他抗原亲和力大100倍。
[0127]
术语“相同”或“相同性”百分数，在两个或多个多肽序列的上下文中，指在比较窗口或指定区域上进行比较和比对以获得最大对应时，两个或多个相同的序列或子序列，在指定区域具有相同(例如，至少70％、至少75％、至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)种类的特定氨基酸残基百分比。为了确定氨基酸序列相同性百分数，可以通过各种方法进行比对，包括使用公开的计算机软件，如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件。适用于确定序列相同性和序列相似性百分数的算法例子是blast 2.0算法，如altschul等人nuc.acids res.25:3389-3402(1977)和altschul等人，j.mol.biol。215:403-410(1990)所述。因此，为了本发明的目的，blast 2.0可以默认参数使用，以确定序列相同性百分数。
[0128]
当用于鉴定多肽序列中的给定氨基酸残基时，术语“对应于”、“根据
……
确定”或“参考
……
编号”，指当给定氨基酸序列与参考序列最大程度对齐并进行比较时，指定参考序列残基的位置。因此例如，当与seq id no:1最佳对齐时残基与seq id no:1的氨基酸对
齐时，seq id no:1可变域多肽中的氨基酸残基“对应于”seq id no:1可变域多肽中的氨基酸。与参考序列对齐的多肽不必与参考序列长度相同。
[0129]
本文所用的“保守”取代是指氨基酸的取代，其保持侧基链的电荷、疏水性和/或大小。可相互取代的氨基酸的说明性集合包括(i)带正电的氨基酸lys、arg和his；(ii)带负电的氨基酸glu和asp；(iii)芳族氨基酸phe、tyr和trp；(iv)氮环氨基酸his和trp；(v)大型脂族非极性氨基酸val、leu和ile；(vi)极性较小的氨基酸met和cys；(vii)小侧链氨基酸ser、thr、asp、asn、gly、ala、glu、gln和pro；(viii)脂族氨基酸val、leu、ile、met和cys；(ix)小羟基氨基酸ser和thr。本段中提到的氨基酸电荷是指生理ph下的电荷。
[0130]
术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，如本文所用指rna、cdna、基因组dna的有义和反义链，以及上述的合成形式和混合聚合物。在特定实施方式中，核苷酸指核糖核苷酸、脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式及其组合。术语还包括但不限于dna的单链和双链形式。此外，多核苷酸如cdna或mrna可包括通过天然存在和/或非天然存在的核苷酸键连接在一起的天然存在和修饰的核苷酸之一或两者。如本领域技术人员将容易理解的，核酸分子可经化学或生物化学修饰，或可包含非天然或衍生的核苷酸碱基。这类修饰包括，例如，标记物、甲基化、用类似物取代一个或多个天然产生的核苷酸、核苷酸间修饰，诸如不带电荷连接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)，带电荷连接(例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)，侧基部分(例如，多肽)，嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)，螯合剂，烷基化剂和修饰的连接(例如，α-异头核酸等)。上述术语还旨在包括任何拓扑构型，包括单链、双链、部分双链、三链、发夹、环形和挂锁构型。除非另有明确说明，述及核酸序列包括其互补物。因此，当指具有特定序列的核酸分子时，应理解为包含其互补链及其互补序列。该术语还包括编码相同多肽序列的密码子优化的核酸。
[0131]
本文所用术语“载体”指一种核酸分子，所述核酸分子能够增殖其连接的另一核酸。该术语包括自复制核酸结构形式的载体，以及进入宿主细胞(载体引入其中的细胞)基因组的载体。本文使用的“载体”是指将感兴趣的核酸序列插入载体中的重组构建物。某些载体能够引导与之操作性连接的核酸的表达。这样的载体在本文中称为“表达载体”。
[0132]
术语“对象”、“患者”或“个体”在本文中可互换地用于指代任何哺乳动物，包括但不限于人类。例如，动物对象可以是灵长类动物(例如猴、黑猩猩)、家畜动物(例如马、牛、绵羊、猪或山羊)、伴侣动物(例如狗、猫)、实验室试验动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠)或任何其他哺乳动物。在一些实施方式中，“对象”、“患者”或“个体”是人类。
[0133]
抗cd72纳米抗体
[0134]
本文提供可用于诊断和治疗目的的抗cd72纳米抗体。
[0135]
在一些实施方式中，本发明的抗-cd72纳米抗体的kd小于约10nm。
[0136]
在一些实施方式中，本发明的抗-cd72纳米抗体具有seq id no:1-8中任一种的可变结构域序列的至少一个、至少两个或三个cdr。在一些实施方式中，本发明的抗-cd72纳米抗体包含选自seq id no:1-8中任何一种的可变结构域序列的cdr3序列的cdr3。在一些实施方式中，本发明的抗-cd72纳米抗体包含选自seq id no:4、5或6中任何一种的可变结构域序列的cdr3序列的cdr3。在一些实施方式中，本发明的抗-cd72纳米抗体包含seq id no:6的可变结构域序列的cdr3。在一些实施方式中，本发明的抗-cd72纳米抗体包含选自seq id no:1-8中任何一种的可变结构域序列的cdr1、cdr2和cdr3。在一些实施方式中，本发明
cd72纳米抗体。“跨膜结构域”是连接胞外结合部分和胞内信号转导结构域，并将car锚定到经修饰以表达car的宿主细胞如免疫效应细胞质膜的car部分。胞内区域可包含tcr复合物的信号转导结构域和/或一个或多个共刺激信号转导结构域，例如来自cd28、4-1bb(cd137)和ox-40(cd134)的那些。例如，“第一代car”通常具有cd3ζ信号转导结构域。还可以引入额外的共刺激胞内结构域(例如，第二代和第三代car)，并且包括归巢和自杀结构域在内的其他结构域也可以包括在car构建物中。下文将进一步介绍car组件。
[0151]
胞外结构域(纳米抗体结构域)
[0152]
本发明的嵌合抗原受体包含胞外抗原结合域，其包含如本文所述的具有cdr1、cdr2和cdr3的抗-cd72纳米抗体结构域。在一些实施方式中，抗-cd72纳米抗体结构域包含seq id no:1-8中任一种的人源化形式，例如其中取代框架中的残基以提供框架序列fr1-fr2-fr3-fr4，其具有至少85％或至少90％或至少95％或更高的人vh框架(例如人种系框架fr1-fr2-fr3-fr4)。在一些实施方式中，抗-cd72纳米抗体结构域包含seq id no:9-26中任一种的人源化形式，例如其中取代框架中的残基以提供框架序列fr1-fr2-fr3-fr4，其具有至少85％或至少90％或至少95％或更高的人vh框架(例如人种系框架fr1-fr2-fr3-fr4)。
[0153]
在一些实施方式中，胞外结构域可包含如另外两种本文所述的抗-cd72纳米抗体。例如，胞外结构域可包含本文所述四种不同纳米体中的三种。在一些实施方式中，胞外结构域可包含同一纳米抗体的多个拷贝。在一些实施方式中，胞外结构域可包含如本文所述的纳米抗体和结合到不同cd72表位的抗-cd72纳米抗体或其他抗-cd72抗体。在一些实施方式中，纳米抗体中的至少一个包括包含tispidi的cdr1序列、包含fvaaialggn的cdr2序列和包含vgyvdkwddsdyht的cdr3序列。
[0154]
编码car的car构建物还可包括编码信号肽的序列，以将胞外结构域靶向细胞表面。
[0155]
铰链结构域
[0156]
在一些实施方式中，car可以是连接包含本发明的抗-cd72纳米抗体的抗原结合域和用于定位抗原结合域的跨膜结构域的一个或多个铰链结构域。这样的铰链结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。铰链结构域可包括天然存在的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列，例如，天然存在的人免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区。适用于本文所述的car的示例性铰链结构域包括源自1型膜蛋白如cd8α、cd4、cd28、pd1、cd152和cd7的胞外区域的铰链区，它们可以是来自这些分子的野生型铰链区或可以被改变。
[0157]
跨膜结构域
[0158]
可使用任何适用于car构建物的跨膜区。此类跨膜结构域包括但不限于t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd27、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154的全部或部分跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域可包括至少以下的跨膜区，例如：kirds2、ox40、cd2、cd27、lfa-1(cd 11a、cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd40、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd160、cd19、il2rβ、il2rγ、il7r a、itgal、vlal、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cdl ld、itgae、cd103、itgal、cdl la、lfa-1、itgam、cdl lb、itgax、cdl lc、itgb 1、cd29、itgb2、cd 18、lfa-1、itgb7、tnfr2、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crt am、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100、
(sema4d)、slamf6(ntb-a、lyl08)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame、(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、pag/cbp、nkg2d或nkg2c。
[0159]
整合到car构建物中的跨膜结构域可以来自天然、合成、半合成或重组来源。
[0160]
胞内信号转导结构域
[0161]
本发明的car构建物包括一个或多个胞内信号转导域，在本文中也称为共刺激结构域或胞质结构域，其活化或以其他方式调节免疫细胞(例如t淋巴细胞或nk细胞)。胞内信号转导域通常负责活化已引入car的免疫细胞的至少一种正常效应功能。在一个实施方式中，使用增加car免疫t细胞细胞因子生产的共刺激结构域。在另一实施方式中，使用促进免疫细胞(例如，t细胞)复制的共刺激结构域。在又一实施方式中，使用共刺激结构域来防止car免疫细胞(例如，t细胞)耗竭。在另一实施方式中，使用提高免疫细胞(例如，t细胞)抗肿瘤活性的共刺激结构域。在又一个实施方式中，使用共刺激结构域来增强car免疫细胞(例如，t细胞)的存活(例如，输注到患者体内后)。
[0162]
在car中使用的胞内信号转导域的例子包括t细胞受体(tcr)和共受体的胞质序列，它们协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导，以及这些序列的任何衍生物或变体，以及具有相同功能的任何重组序列。
[0163]
主要信号转导结构域以刺激方式或抑制方式调控tcr复合物的主要活化。以刺激方式作用的主要胞内信号转导结构域可能包含信号转导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或itam。
[0164]
含有主要胞内信号转导结构域的itam例子包括cd3ζ、共有fcrγ、fcγrlla、fcrβ(fcεrib)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd79a、cd79b、dap10和dap12。在一个实施方式中，car包含胞内信号转导结构域，例如cd3ζ的主要信号转导结构域。
[0165]
car的胞内信号转导结构域可以仅包括主要胞内信号转导结构域，或者可包括在本发明car中有用的其它理想的胞内信号转导结构域。例如，car的胞内信号转导结构域可包括cd3ζ链部分和共刺激信号转导结构域。共刺激信号转导结构域是指car的一部分，包括共刺激分子的胞内结构域。共刺激分子是一种细胞表面分子，而不是抗原受体或淋巴细胞对抗原有效反应所必需的它的配体。此类分子的实例包括cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和结合cd83的配体等。例如，cd27共刺激已被证明可在体外增强人cart细胞的扩增、效应功能和存活，并在体内增强人t细胞维持和抗肿瘤活性(song等人，blood.2012；119(3)：696-706)。此类共刺激分子的其它例子包括cds、icam-1、gitr、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd160、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cdl-ld、itgae、cd103、itgal、cdl-la、lfa-1、itgal、itgax、，cdl lc、itgb 1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244，2b4)、cd84、cd96(tacile)、nkg2d、ceacaml、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a，lyl08)、slam(slamfl，cd150，ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、lat、gads、slp-76、pag/cbp和cd19a。
[0166]
在一些实施方式中，car可设计为可诱导car，或者可以包括用于可逆地表达car，或控制car活性以将其大体限制在所需环境中的机制。因此，例如在一些实施方式中，表达
car的细胞使用分裂car。公开出版的wo2014/055442和wo2014/055657详细描述了分裂car方法。简而言之，分裂car系统包括表达具有第一抗原结合域和共刺激结构域(例如41bb)的第一car的细胞，并且该细胞也表达具有第二抗原结合域和胞内信号转导域(例如cd3ζ)的第二car。当细胞遇到第一抗原时，共刺激区被活化，细胞增殖。当细胞遇到第二抗原时，胞内信号转导结构域被活化，细胞杀伤活性开始。因此，表达car的细胞只有在两种抗原同时存在时才能完全活化。
[0167]
在一些实施方式中，宿主细胞(例如t细胞)可以工程化，使得包含靶向一种抗原的胞外结构域的合成notch受体诱导靶向第二抗原的car的表达。此类系统公开于美国专利申请公开第20190134093号；另请参见us20160264665中所述的synnotch多肽，每种多肽均通过引用并入本文。在一些实施方式中，synnotch包含如本文所述的一个或多个抗-cd72纳米抗体。在一些实施方式中，将一个或多个抗-cd72纳米抗体纳入car，其表达由宿主细胞表达的synnotch活化。
[0168]
在一些实施方式中，表达包含如本文所述的一个或多个抗-cd72纳米抗体的car的细胞还表达第二car，例如，包含例如与同一靶点或不同靶点(例如cd72以外的靶点，例如cd22或cd19，在b细胞恶性肿瘤上表达)结合的不同抗原结合域的第二car。
[0169]
免疫效应细胞(如t细胞)的活化和扩增
[0170]
本发明不受基因修饰以表达car或合成notch受体的免疫细胞类型的限制。说明性免疫细胞包括但不限于t细胞，例如α/βt细胞和γ/δt细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、肥大细胞、巨噬细胞和骨髓来源的吞噬细胞。可被修饰以表达car的t细胞包括记忆t细胞、cd4 和cd8 t细胞。在一些实施方式中，免疫细胞(例如t细胞)是来自要接受免疫治疗的患者的自体细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是同种异体的。
[0171]
免疫效应细胞(如t细胞)通常可使用如美国专利6352694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美国专利申请公开第2006/0121005号中所述的方法活化和扩增。免疫效应细胞的例子包括t细胞，例如，α/βt细胞和γ/δt细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、肥大细胞和骨髓来源的吞噬细胞。
[0172]
制备表达car的细胞的方法如us2016/0185861和us2019/0000880所述。
[0173]
编码car的核酸和载体
[0174]
任何方法均可用于遗传修饰效应细胞，例如t细胞或nk细胞，以表达包含本发明抗-cd72纳米抗体的car。基因工程化免疫细胞方法的非限制性例子包括但不限于逆转录病毒或慢病毒介导的转导。其他病毒递送系统包括腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体、α病毒载体、脊髓灰质炎病毒载体，以及其他正链和负链rna病毒、类病毒和拟病毒(virusoid)，或其部分。转导方法包括细胞与生产细胞的直接共培养，例如通过bregni等人，blood，80:1418-1422(1992)的方法，或使用单独的病毒上清液或含有或不含有合适生长因子和聚阳离子的浓缩载体储液培养，例如通过xu等人，exp.hemat.22:223-230(1994)；和hughes等人，j.clin.invest.89:1817(1992)的方法。
[0175]
在一些实施方式中，使用基于转座酶的基因整合系统、crispr/cas介导的基因整合、talen或锌指核酸酶整合技术进行遗传修饰。例如，crispr/cas介导的基因整合可用于
将car或合成的notch受体引入免疫效应细胞，然后可筛选并扩增以给予患者。
[0176]
纳米抗体偶联物
[0177]
在另一方面，本发明的抗-cd72纳米抗体可直接或间接地与治疗性和/或成像/可检测部分偶联或连接。例如在一些实施方式中，纳米抗体或本发明，或包含本发明纳米抗体的抗原结合区可与包括但不限于可检测标志物、细胞毒性剂、成像剂、治疗剂或寡核苷酸的试剂偶联。用于将纳米抗体或包含纳米抗体的抗原结合区域偶联或连接到所需分子部分的方法在本领域是众所周知的。该部分可以共价或通过非共价键连接到纳米抗体。
[0178]
在一些实施方式中，本发明的抗-cd72纳米抗体或包含本发明的抗-cd72纳米抗体的抗原结合域与细胞毒性部分或抑制细胞增殖的其他部分偶联。在一些实施方式中，抗体与包括但不限于例如以下的细胞毒性剂偶联：蓖麻蛋白a链、阿霉素、柔红霉素、美登木素、紫杉醇、溴乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、二羟蒽醌、甲氧蝶呤、放线菌素、白喉毒素、来自假单胞菌的外毒素a、假单胞菌外毒素40、相思豆毒蛋白、相思豆毒蛋白a链、蒴莲根毒素a链、α-帚曲菌素、白树毒素、分裂毒素、局限曲菌素、眼镜蛇毒因子、核糖核酸酶、工程化志贺毒素、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、卡奇霉素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素、奥瑞他汀、金霉素(auromycin)、钇、铋、康普瑞汀、多卡霉素、尾海兔素、cc1065或顺铂。在一些实施方式中，抗体可与诸如酶抑制剂、增殖抑制剂、裂解剂、dna或rna合成抑制剂、膜通透性改性剂、dna代谢物、二氯乙基硫醚衍生物、蛋白生产抑制剂、核糖体抑制剂或凋亡诱导剂等试剂连接。
[0179]
在一些实施方式中，本发明的抗-cd72纳米抗体或包含本发明的抗-cd72纳米抗体的抗原结合域可连接至放射性核素、铁相关化合物、染料、荧光剂或成像剂。在一些实施方式中，抗体可与试剂连接，例如但不限于金属；金属螯合剂；镧系元素；镧系螯合剂；放射性金属；放射性金属螯合剂；正电子发射核；微泡(用于超声)；脂质体；在脂质体或纳米球中微胶囊化的分子；单晶氧化铁纳米化合物；磁共振造影剂；吸光、反射和/或散射试剂；胶体颗粒；荧光团，例如近红外荧光团。
[0180]
癌症疫苗
[0181]
抗-cd72纳米抗体、包含抗-cd72纳米抗体的抗原结合分子、或经包含本发明抗-cd72纳米抗体的car基因修饰的效应细胞(例如t细胞)可与例如以下免疫原性试剂组合：癌细胞，纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)，以及转染了编码免疫刺激细胞因子的基因的细胞(he等人(2004)j.immunol。173:4919-28)。可以使用的癌症疫苗的非限制性例子包括转染以表达细胞因子gm-csf的t细胞、基于dna的疫苗、基于rna的疫苗和基于病毒转导的疫苗。癌症疫苗可能是预防性的，也可能是治疗性的。
[0182]
在一些实施方式中，将抗-cd72纳米抗体、包含抗-cd72纳米抗体的抗原结合分子或经包含本发明抗-cd72纳米抗体的car基因修饰的效应细胞(例如t细胞)与免疫调节剂共同给药。免疫调节剂的例子包括但不限于：细胞因子、生长因子、淋巴毒素、肿瘤坏死因子(tnf)、造血因子、白细胞介素(例如，白细胞介素-1(il-1)、il-2、il-3、il-6、il-10、il-12、il-15、il-15/il-15rα，例如sushi结构域、复合物、il-18和il-21)、集落刺激因子(例如，粒细胞集落刺激因子(g-csf)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、干扰素(例如，干扰素-α、-β或-γ),促红细胞生成素和血小板生成素，或其组合。在一些实施方式中，复合物可与以下佐剂共同给药：例如toll样受体(tlr)激动剂、c型凝集素受体(clr)激动剂、维甲酸
诱导基因i样受体(rlr)激动剂、皂甙、多糖，例如甲壳素、壳聚糖、β-葡聚糖，iscom、qs-21或其他免疫增强剂。
[0183]
b-细胞恶性肿瘤的治疗
[0184]
本发明的抗-cd72纳米抗体，包括抗-cd72纳米抗体作为抗原结合分子(例如二价或多价抗体)的组分提供或作为car分子的组分提供的实施方式，可用于治疗表达cd72的任何恶性肿瘤。在一些实施方式中，恶性肿瘤是b细胞恶性肿瘤。说明性b细胞恶性肿瘤包括但不限于：b细胞急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、单克隆b细胞淋巴细胞增多症、b细胞幼淋巴细胞白血病、脾边缘带淋巴瘤、毛细胞白血病、脾b细胞淋巴瘤/白血病，不可分类的脾脏弥漫性红髓小b细胞淋巴瘤、毛细胞白血病变型、淋巴质浆细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、意义未明的单克隆丙种球蛋白血症(mgus)igm、μ-重链疾病、γ-重链疾病、α-重链疾病、mgus igg/a、浆细胞骨髓瘤、骨孤立性浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、单克隆免疫球蛋白沉积病、粘膜相关淋巴组织结节外边缘区淋巴瘤(malt淋巴瘤)、结节边缘区淋巴瘤、儿童结节边缘区淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原位滤泡瘤、十二指肠型滤泡性淋巴瘤、儿童型滤泡性淋巴瘤、伴有irf4重排的大b细胞淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、原位套细胞瘤、弥散性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)nos，包括生发中心b细胞型，活化的b细胞型；t细胞/组织细胞丰富型大b细胞淋巴瘤、中枢神经系统原发性dlbcl、原发性皮肤dlbcl，腿部型、ebv

dlbcl nos、ebv

粘膜皮肤溃疡、与慢性炎症相关的dlbcl、淋巴瘤样肉芽肿、原发性纵隔(胸腺)大b细胞淋巴瘤、血管内大b细胞淋巴瘤、alk

大b细胞淋巴瘤、浆细胞性淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、hhv8

dlbcl nos、伯基特淋巴瘤、具有11q畸变的伯基特样淋巴瘤、具有myc和bcl2和/或bcl6重排的高级b细胞淋巴瘤、不可分类的高级b细胞淋巴瘤nos和b细胞淋巴瘤，具有介于dlbcl和经典霍奇金淋巴瘤之间的特征。在一些实施方式中，如本文所述用抗-cd72纳米抗体治疗的恶性肿瘤是霍奇金淋巴瘤，例如结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤，或经典霍奇金淋巴瘤，包括结节硬化性经典霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞丰富的经典霍奇金淋巴瘤、混合细胞经典霍奇金淋巴瘤，淋巴细胞耗竭的经典霍奇金淋巴瘤。在一些实施方式中，用本文所述的抗-cd72纳米抗体治疗的恶性肿瘤是移植后淋巴增生性疾病(ptld)，例如浆细胞增生性ptld、感染性单核细胞增多症ptld、花样淋巴滤泡增生ptld、多态性ptld、单态性ptld(b-和t-/nk细胞类型)或经典霍奇金淋巴瘤ptld。
[0185]
抗-cd72纳米抗体的给予
[0186]
在一个方面，使用抗-cd72纳米抗体或包含抗-cd72纳米抗体的抗原结合分子(例如抗体)治疗b细胞恶性肿瘤的方法包括使用适合于治疗b细胞恶性肿瘤的给药方案以治疗有效量对患者给予作为药物组合物的抗-cd72纳米抗体或包含抗-cd72纳米抗体的抗原结合分子。所述组合物可配制成适用于多种药物递送系统。组合物中还可包含一种或多种生理学上可接受的赋形剂或运载体以制成合适的制剂。可用于本发明的合适配方可见例如《雷明顿药物科学和实践》(remington:the science and practice of pharmacy),第21版,philadelphia,pa.lippincott williams&wilkins,2005。
[0187]
纳米抗体(或包含纳米抗体的抗体或抗原结合分子)以适合给予患者的溶液提供，例如用于注射的无菌等渗水溶液。抗体以合适的浓度溶解或悬浮在可接受的运载体中。在一些实施方式中，运载体是水性的，例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水等。组合物可包含近似生
理条件所需的辅助药物物质，例如ph调节剂和缓冲剂、张力调节剂等。
[0188]
以足以治愈或至少部分抑制疾病或疾病症状及其并发症的量向患者给予药物组合物。足以达到这一目的的剂量被定义为“治疗有效剂量”通过监测患者对治疗的反应来确定治疗有效剂量。指示治疗有效剂量的典型基准包括改善患者的疾病症状。该用途的有效量取决于疾病的严重程度和患者的一般健康状况，包括年龄、体重、性别、给药途径等其他因素。可根据患者所需并耐受的剂量和频率进行单次或多次抗体给药。无论如何，这些方法提供足够量的抗-cd72纳米抗体或包含该抗-cd72纳米抗体的抗原结合分子，以有效治疗患者。
[0189]
纳米抗体可通过任何合适的方式给药，包括例如胃肠外、肺内和鼻内给药。腹膜外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给予。在一些实施方式中，可通过吹入来给予纳米抗体。在一个说明性实施方式中，纳米抗体可在4℃以10mg/ml的浓度储存在无菌等渗盐水溶液中以供注射，并在给予患者前在100ml或200ml 0.9％氯化钠中稀释。在一些实施方式中，以0.01至25mg/kg的剂量经1小时通过静脉输注给予纳米抗体。在其他实施方式中，通过静脉输注在15分钟到2小时之间给予纳米抗体。在其他实施方式中，给药过程是通过皮下推注进行的。
[0190]
选择纳米抗体的剂量是为了对患者提供有效的治疗，其范围为小于0.01mg/kg体重至约25mg/kg体重，或在每位患者1mg-2g的范围内。优选剂量在0.1-10mg/kg或约50-1000mg/kg患者范围内。可根据纳米抗体的药代动力学(例如，抗体在循环中的半衰期)和药效学反应(例如，抗体的治疗效果持续时间)，以适当的频率重复该剂量，其范围为每天一次至每三个月一次，或每六个月一次。在一些实施方式中，体内半衰期在约7至约25天之间，抗体给药在每周一次至每3个月一次或每6个月一次之间重复。在其他实施方式中，纳米抗体大约每月给予一次。
[0191]
给予包含抗-cd72纳米抗体的免疫效应细胞
[0192]
在一些实施方式中，本发明的药物组合物包含表达car的免疫效应细胞，例如，多个表达car的免疫效应细胞，其经遗传修饰以表达包含如本文所述的抗-cd72纳米抗体的car。这种细胞可以用一种或多种药学上或生理上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂配制，例如，缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如edta或谷胱甘肽；佐剂(如氢氧化铝)；和防腐剂。在一些实施方式中，经遗传修饰以表达包含抗-cd72纳米抗体的car的免疫效应细胞被配制用于静脉内给药。
[0193]
包含car修饰的免疫效应细胞的药物组合物可以适合要治疗的b细胞恶性肿瘤的方式给予。给药的数量和频率将由患者病况、患者疾病类型和严重程度等因素决定，尽管适当剂量可由临床试验确定。
[0194]
在一些实施方式中，如本文所述的包含car修饰的免疫效应细胞(例如t细胞或nk细胞)的药物组合物以104至109细胞/kg体重的剂量给予，在一些实例中，以105至106细胞/kg体重的剂量给予，包括范围内的所有整数值。在一些实施方式中，可以3x104、lx106、3x106或1x107细胞/kg体重给予如本文所述的经修饰的t细胞或nk细胞等细胞。细胞组合物也可以这些剂量多次给予。可以使用免疫治疗中常见的输注技术给予(例如，见rosenberg等人，new eng.j.of med.319:1676，1988)。在一些实施方式中，静脉内给予经遗传修饰的免疫效
应细胞。在这种情况下，细胞通过皮内或皮下注射给予患者。表达car的细胞也可以直接注射到特定部位，如淋巴结。
[0195]
在一些实施方式中，对象可经历白细胞去除术，其中在离体收集、富集或耗竭白细胞，以选择和/或分离感兴趣的细胞，例如t或nk细胞。这些细胞分离物，例如t细胞或nk细胞分离物，可通过本领域已知的方法进行扩增并进行处理，以引入本发明的一个或多个car构建物，从而建立本发明的表达car的细胞，例如car-t细胞或表达car的nk细胞。有需要的对象随后可接受标准治疗，即高剂量化疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些方面，在移植之后或同时，对象接受扩增的本发明表达car的细胞的输注。在另一方面，在手术之前或之后给予扩增的细胞。
[0196]
在实施方式中，例如，在给予表达包含本发明抗-cd72纳米抗体的car的免疫效应细胞群之前，对对象进行淋巴细胞耗竭，例如使用美法仑、癌得星(cytoxan)、环磷酰胺或氟达拉滨。
[0197]
在一个实施方式中，例如使用体外转录将car引入细胞，如t细胞或nk细胞，并且对象(如人类)接受初始给药的表达car的细胞，例如本发明的car-t细胞或表达car的nk细胞，以及一次或多次后续给药的表达car的细胞，例如本发明的car t细胞或表达car的nk细胞，其中在前一次给药后不到15天(例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天)一次或多次后续给药。在一个实施方式中，每周向对象(例如，人类)给予一次以上的表达car的细胞，例如，本发明的car t细胞或表达car的nk细胞，例如，每周给予2、3或4次表达car的细胞，如本发明的car t细胞或表达car的nk细胞。在一个实施方式中，对象(例如，人对象)接受一次以上的表达car的细胞给药，例如，每周接受一次car t细胞或表达car的nk细胞给药(例如，每周接受2次、3次或4次给药)(在本文中也称为一个周期)，随后一周不接受表达car的细胞，例如car t细胞给药或表达car的nk细胞给药，然后一次或多次额外给予表达car的细胞，例如car t细胞或表达car的nk细胞(例如，每周多次给予表达car的细胞，如car t细胞或表达car的nk细胞)。在另一实施方式中，对象(例如，人对象)接受一个以上周期的表达car的细胞，例如，car t细胞或表达car的nk细胞，并且每个周期之间的时间小于10、9、8、7、6、5、4或3天。在一个实施方式中，每隔一天给予表达car的细胞，例如，car-t细胞或表达car的nk细胞，每周给药3次。在一个实施方式中，给予表达car的细胞，例如本发明的car-t细胞或表达car的nk细胞至少两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周或更长时间。
[0198]
在一些实施方式中，本文公开的表达car的细胞可经由生物聚合物支架(例如，生物聚合物植入物)给予或递送至对象。生物聚合物支架可支持或增强本文所述的表达car的细胞的递送、扩增和/或分散。生物聚合物支架包括生物相容(例如，不会实质性诱导炎症或免疫反应)和/或天然存在或合成的可生物降解聚合物。合适的生物聚合物的例子包括但不限于琼脂、琼脂糖、海藻酸盐、海藻酸盐/磷酸钙水泥(cpc)、β-半乳糖苷酶(β-gal)，(1,2,3,4,6-五乙酰基α-d-半乳糖)、纤维素、几丁质、壳聚糖、胶原、弹性蛋白、明胶、透明质酸胶原、羟基磷灰石、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)(phbhhx)、聚(丙交酯)、聚(己内酯)(pcl)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(plg)、聚环氧乙烷(peo)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)、聚环氧丙烷(ppo)、聚乙烯醇(pva)、蚕丝、大豆蛋白和大豆蛋白分离物，以任何浓度和比例单独或与任何其他聚合物组合物组合。可使用粘附或迁移促进分子(例如，与淋巴细胞的胶原受体结合的胶原模拟肽)和/或刺激分子来增强或修饰生物聚合物，以增强待递送细胞的递
送、扩增或功能，例如抗癌活性。生物聚合物支架可以是可注射的，例如凝胶或半固体，或固体组合物。
[0199]
在一些实施方式中，本文所述的表达car的细胞在递送给对象前接种到生物聚合物支架上。在实施方式中，生物聚合物支架进一步包含本文所述的一种或多种额外治疗剂(例如，另一种表达car的细胞、抗体或小分子)或增强掺入或偶联到支架的生物聚合物上的表达car的细胞活性的剂。在实施方式中，注射(例如瘤内注射)生物聚合物支架，或手术植入肿瘤处或肿瘤附近，足以介导抗肿瘤效应。stephan等人，nature biotechnology,2015年，33:97中描述了生物聚合物组合物及其递送方法的其他例子。
[0200]
组合其它药剂的给药
[0201]
本发明的抗-cd72纳米抗体(或包含该纳米抗体的抗体或抗原结合分子)或经遗传修饰以表达本文所述纳米抗体的免疫效应细胞可与一种或多种额外治疗剂(例如放射疗法，化疗剂和/或免疫治疗剂)一起给予。如本文所用，“组合”给药是指为治疗b细胞恶性肿瘤向对象提供两种(或更多种)不同的治疗，例如，在对象被诊断出患有b细胞恶性肿瘤后给予两种或更多种治疗。在一些实施方式中，在给予两种治疗剂的时间窗口中可能存在重叠。在其他实施方式中，一个治疗方案在第二个开始之前结束。在一些实施方式中，由于组合给药，治疗可能更有效。
[0202]
在一些实施方式中，纳米抗体或表达包含纳米抗体的car的免疫效应细胞与靶向免疫检查点抗原的试剂一起给予。在一个方面中，药剂是生物治疗剂或小分子。在另一方面中，药剂是单克隆抗体，人源化抗体，人抗体，融合蛋白或其组合。在某些实施方式中，药剂例如通过阻断受体配体结合来抑制检查点抗原，所述检查点抗原可以是pd1、pdl1、ctla-4、icos、pdl2、ido1、ido2、b7-h3、b7-h4、btla、hvem、tim3、gal9、gitr、havcr2、lag3、kir、lair1、light、marco、ox-40、slam、2b4、cd2、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd80、cd86、cd137(4-1bb)、cd160、cd39、vista、，tigit、siglec、cgen-15049、2b4、chk 1、chk2、a2ar、b-7家族配体或其组合。在一些实施方式中，该试剂靶向pd-1，例如阻断pd-l1与pd-1结合或以其他方式抑制pd-1的抗体。在一些实施方式中，药剂靶向ctla-4。在一些实施方式中，药剂靶向lag3。在一些实施方式中，药剂靶向tim3。在一些实施方式中，药剂靶向icos。
[0203]
在一些实施方式中，抗-cd72纳米抗体或表达包含纳米抗体的car的免疫效应细胞可与针对b细胞恶性肿瘤上的抗原的额外治疗性抗体一起给予。用于治疗b细胞恶性肿瘤的治疗性抗体的例子包括靶向cd20、cd22和cd19的抗体，包括例如利妥昔单抗、奥贝努妥珠单抗、托西莫单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗(veltuzumab)和奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、依帕妥珠单抗和博纳吐单抗(blinatomomab)。
[0204]
在一些实施方式中，抗-cd72纳米抗体或包含抗体的免疫效应细胞与化疗剂一起给予。癌症化疗剂的例子包括：烷化剂，例如噻替哌和环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米得哌(memredopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙烯三聚氰胺(triethylenemelamine)、三吖啶基氧化磷(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)；氮芥类，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺
(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯乙酸氮芥胆甾醇酯(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfmaide)、尿嘧啶芥(uracil mustard)；亚硝基脲类(nitrosureas)，例如卡莫司汀、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放射菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素c(cactinomycin)、加利车霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素d(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、衣索比星(esorubicin)、伊达比星(idambicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(poffiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药，例如氨甲蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、氨甲蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，例如卡普睾酮(calusterone)、丙酸甲雄烧酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基-γ-酮戊酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；苯塔布希(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地弗法明(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托葸醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；硝氨丙吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴胼(procarbazine)；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；包菌丽酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2
′
,2
″‑
三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甘托欣(gacytosine)；阿糖胞苷；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西紫杉醇；氯胺丁；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶
呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春花碱；多西它赛；铂；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素c；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine)；诺肖林(novantrone)；替尼泊苷；道诺霉素(daunomycin)；氨蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸钠(ibandronate)；cpt-11；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；维甲酸衍生物，例如蓓萨罗丁、阿利维甲酸(alitretinoin)、地尼白介素-毒素连接物(denileukin diftitox)；埃斯培拉霉素(esperamicins)；卡培他滨(capecitabine)；和任何上述药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方式中，抗-cd72纳米抗体或表达包含纳米抗体的car的免疫效应细胞可与调节b细胞受体信号转导复合物或其信号转导通道的其他成员的额外治疗性化合物一起给予。此类化合物包括蛋白激酶c、pi3k、btk、blnk、plc-γ、pten、shp1、shp1、shp2、erk等的激动剂或拮抗剂。靶向b细胞受体信号转导和/或其信号转导通道的其他成员的治疗性化合物的例子包括苔藓抑素1、3ac、rmc-4550和shp099。
[0205]
以下实施例说明了所要求保护的发明的某些方面。应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本技术的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。
[0206]
实施例
[0207]
实施例1.cd72作为b细胞恶性肿瘤治疗靶点的鉴定
[0208]
mllr与其他b-all亚型相比，细胞表面蛋白质组学显示出不同的表面组特征
[0209]
为了确定b-all细胞表面组，我们使用修订版的细胞表面捕获法富集n-糖蛋白(图1a)，然后进行定量质谱分析。由于该方法需要30-200e6细胞的样本输入，因此通常不适用于初级样本分析；因此，我们对细胞系进行了分析。我们分析了八种具有不同驱动易位的b-all细胞系，包括mll-af4(n＝3)、mll-enl(n＝1)、bcr-abl(n＝3)和etv6-runx1(n＝1)，以及作为非恶性对照物的来自正常供体脐带血的eb病毒永生化的b细胞(表1)，所有这些细胞均以生物学一式三份进行。使用maxquant中的无标签定量(lfq)并过滤uniprot标注的膜或膜关联蛋白，我们定量了799种膜蛋白。利用mllr和非mllr细胞系之间的welch t检验得出的2倍截止值和p《0.05，我们确定了25种独特的在mllr表面组中特异性富集的膜蛋白，和39种下调的膜蛋白(图1b)。作为阳性对照，我们的分析确定了mllr的已知标志，包括prom1和flt3上调以及cd10丧失。主成分分析显示，mllr b-all系与bcr-abl b-all和ebv永生化的b细胞明显区分，这意味着一个独特的细胞表面组(图1c)。为了研究表面蛋白调节，我们进行了平行rna-seq。我们发现rna-seq和表面蛋白组学都发现上调的表面标注蛋白质之间存在中等相关性，这与之前的研究一致(图1d)。
[0210]
表1：细胞表面蛋白组学分析的细胞系。蛋白组学总结：各自3个生物学重复；3.5x107个细胞/个重复；对1276种膜蛋白进行了鉴定和定量。
[0211][0212][0213]
细胞表面蛋白分类将cd72鉴定为免疫治疗靶点
[0214]
我们对细胞表面标志物进行生物信息学分类，以确定mllr b-all的潜在免疫治疗候选物。我们依次考虑了mllr相对于其他的上调的细胞表面标志物(63/799蛋白)；相对丰富的蛋白质，以找到具有高抗原密度的标志物(lfq强度》25,27/799)；和单程膜蛋白，以方便开发体外抗体(17/799)(图2a)。为了避免“定靶，脱肿瘤”毒性，我们通过基因型组织表达数据库(gtex)消除了正常组织(不包括脾脏)中tpm中位数(百万个中的转录物)》10，或者通过人类蛋白图谱(human protein atlas)在非造血组织中任何可检测的免疫组化染色的蛋白质编码基因。这在799种蛋白质中剩下了8种。最后，为了避免敏感的造血分部，我们在dmap资源和人类血液图谱(hba)中消除了cd34 干细胞和祖细胞(hspc)或t细胞中具有任何可检测rna表达的蛋白质。完成这一分类后，一个膜蛋白靶点最符合我们的标准：cd72。
[0215]
cd72在鼠生物学中也称为lyb-2，是一种单程ii型膜蛋白，具有胞外c型凝集素结构域和胞质itim基序。cd72上的itim基序类似于cd22，作为抑制性磷酸酶的支架，以对抗b细胞受体(bcr)信号转导。这些蛋白以及cd19根据hba，在不同造血细胞类型之间表现出高度相似的表达模式(图2b)，包括在大多数正常组织中的低表达(图2c)。对恶性细胞系中cd72转录物丰度的调查显示，白血病和淋巴瘤细胞系中有高表达，而在来源于其他组织的恶性肿瘤中几乎没有表达(图2d，n＝1461；ccle，2019年10月14日登录)。对多个细胞系和患者样本转录组数据集的再分析也证实，cd72在大多数b-all亚型以及预后不良亚型弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)中高度表达(图2e-g)。
[0216]
cd72在mllr白血病和其他b细胞恶性肿瘤中丰度很高
[0217]
为了独立验证这些结果，我们检测了proxe生物库的b-all患者源性异种移植物(pdx)和我们研究所冷冻的活原代儿科样本中cd72的表面表达。通过定量流式细胞术，我们发现在mllr pdx样本中，cd72在每个细胞中表达数千个拷贝，与cd19相似，有时甚至大于
cd19(图3a)。原代样本分析表明，mllr细胞中的cd72高于非mllr细胞，但重要的是，即使在非-mllr疾病中也显示了cd72的表达(图3b)。固定的成人b-all骨髓抽吸物上的ihc在mllr b-all母细胞上发现了均一高cd72，而其他基因组亚型中表达可变的，但仍然存在(图3c-d)。还进行ihc以检测活化的b细胞(abc)和生发中心b细胞(gbc)dlbcl中的cd72，发现尽管两种亚型之间没有显著差异，但所检测的绝大多数样本具有高水平的cd72(图3e-f)。为了进一步检测其他淋巴瘤亚型的cd72表面表达，通过使用fitc quantum mesf(等效可溶性荧光色素)珠(bangs laboratories)和fitc标记的抗cd19和抗cd72单克隆抗体(bd)的定量流式细胞术，在人白血病细胞系(sem和rs411)和人淋巴瘤细胞系(jeko-1、hbl1、namalwa、toledo、oci-ly10)上评估cd19和cd72的细胞表面丰度。在所有检测的细胞系中，cd72的丰度都很高(表2)。
[0218]
表2：白血病和淋巴瘤细胞系中cd19和cd72受体的表达
[0219]
使用fitc quantum mesf(等效可溶性荧光色素)珠(bangs laboratories)和fitc-标记的抗cd19和抗cd72单克隆抗体(bd biosciences)，通过定量流式细胞术在人白血病细胞系(sem和rs411)和人淋巴瘤细胞系(jeko-1、hbl1、namalwa、toledo、oci-ly10)上测量cd19和cd72的细胞表面丰度。
[0220]
t对sem和rs411都具有高度细胞毒性，与cd19 car-t的效果相似(图5c)。对car-t形式的其它抗-cd72纳米抗体序列的评估显示，在8小时共培养分析中，多个序列能够在高e:t比率下杀死sem靶细胞(图5d-f)。克隆nb.d4在我们的jurkat分析中具有最佳的活化曲线，与大多数受试纳米抗体相比，显示出更高的活性。在4小时共培养试验中，nb.d4抗-cd72 car-t在不同e:t比率下对细胞系sem(b-all)、jeko-1(套细胞淋巴瘤)、namalwa(伯基特淋巴瘤)和hbl1(dlbcl)与cd19导向的car-t的表现相当(图6a-d)。在48小时的低效应物：靶比率的共培养试验中，cd72(nb.d4)cd8 细胞对于sem表现出强烈的剂量依赖性细胞毒性，与cd19 car-t相似(图7a)。
[0229]
为了支持cd72 car-t作为cd19失败后的一线或二线治疗，我们使用crispri抑制sem细胞中的cd19，以生成cd19抗原逃逸模型。cd72(nb.d4)car-t对cd19阴性的sem细胞与亲代细胞一样有效(图7b)，而cd19 car-t的活性显著降低。此外，我们敲减了cd72，并显示cd72(nb.d4)car-t对这些细胞没有可检测活性，而cd19 car-t保留了强大的杀伤力(图7c)。因此，cd72(nb.d4)car t治疗对携带cd72的b细胞具有高度特异性和效力，且cd72的有效靶向性与cd19表面密度无关。
[0230]
在nod scidγ(nsg)小鼠中，检测了我们的cd72 car t对mllr b-all细胞系(sem)和mllr b-all pdx的体内效果。我们工程改造了这两种细胞以表达荧光素酶，用于无创生物发光成像(bli)。对于sem和pdx分别在第3天或第10天通过尾静脉注射植入1e6细胞，并用bli确认植入。每组小鼠(n＝6/臂)接受用“空白”car骨架、cd72(nb.d4)car或cd19 car工程改造的总共5e6个car-t细胞(cd4:cd8原代t细胞的1:1混合物)。注射mllr pdx的小鼠接受cd72(nb.d4)car-t后，显示出强烈的反应且无法用bli检测到白血病负荷，与cd19 car-t相当，与空白car相比，存活率显著增加(图8a)。cd72(nb.d4)car-t在野生型sem中的表现与cd19 car-t相似，与空白car相比显著延长了存活时间(图8b)。与cd19 car-t相比，cd72(nb.d4)car-t在体内显著延长了crispri cd19敲减的sem细胞的存活时间(图8c)。
[0231]
本说明书中提及的所有出版物、专利申请和登录号通过引用并入本文，其程度与每个单独的出版物或专利申请明确且单独地指示通过引用并入其引用的材料相同。
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抗cd72纳米抗体多肽序列：
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