一种利用菌草制作复合菌群饲料的方法

1.本发明属于饲料加工技术领域，具体涉及一种利用菌草制作复合菌群饲料的方法。


背景技术：

2.随着畜牧业的迅猛发展，饲料资源的短缺日渐明显，玉米、豆粕、鱼粉等蛋白质饲料原料紧缺并且价格较高，而廉价的杂粕因无法充分被动物利用而被大量废弃，造成资源浪费；其次无法被有机体吸收的部分养分都通过粪便被排出体外，畜禽粪便的处理不得当，造成了土壤和大气的污染；抗生素的滥用，也增强畜禽机体病原细菌的抗药性，畜产品的抗生素残留直接影响了人类的食品安全，从而严重影响人类的身体健康。健康养殖、粮食短缺、环境污染、畜产品风味改善等都是畜牧饲料行业面临的共性问题。
3.生物发酵饲料是一种新兴产业，为畜牧业发展的转型升级提供技术解决方案。菌草是高大禾本科的多年生草本植物，主要包括禾本科、里白科等共计20多个属46个种的植物。种植面积较广的品种主要有巨菌草、绿洲1号、绿洲2号、绿洲3号、绿洲5号等。菌草的叶片厚大，叶质柔软多汁，其营养丰富、富含糖类、木质素、粗蛋白和粗纤维等营养成分，具有适口性好，容易消化等优点，是家禽畜牧和水产养殖优质青饲料的不二之选。菌草生长速率快，产量高，抗逆性能强，耐高温干旱盐碱耐寒等特点拓展了其使用范围，可弥补北方冬天饲料低贮存的空缺。
4.引入白腐菌菌酶和混合菌群发酵菌草制备成生物发酵饲料，既可以缩短菌草饲料发酵的时间，提高菌草饲料营养价值和适口性；改善饲养动物的肠道菌群，提高机体免疫功能和抗氧化性，促进营养吸收；健康养殖，保障食品安全，发展畜牧产业，提高经济效益。
5.当前，已有一些对菌草饲料的研究，但大多局限于菌草青贮饲料，有一定程度的提高了饲料的采食量及其经济效益。但是，对微生物发酵菌草饲料的研究并不多，也没有明确具有针对性的菌草饲料生物发酵的菌剂和生产工艺。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种利用菌草制作复合菌群饲料的方法。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种利用菌草制作复合菌群饲料的方法，其是以菌草为主料，玉米粉和麦麸为辅料，加入白腐真菌粗酶液以降解纤维素、半纤维素和木质素，同时加入菌草发酵专用复合菌群进行混菌发酵，得到菌草生物发酵饲料。该方法得到的饲料有着明显的酸香、酒香味，质地松软蓬松，颜色金黄，营养丰富；该生产工艺简单，时间短，成本低廉，有利于实现菌草发酵饲料的工业化大规模生产。
8.上述的利用菌草制作复合菌群饲料的方法，具体包括如下步骤：（1）收割生长期为2个月的新鲜菌草；（2）将收割的新鲜巨菌草与麦麸、玉米粉分别于50℃下烘干12 h，粉碎成20目细粉
备用；（3）将80份巨菌草粉、10份麦麸粉、10份玉米粉混合均匀，得到发酵原料；（4）向发酵原料中加入0.05%（w/w）的白腐菌粗酶液和1.5~4.5%（v/w）的菌草发酵复合菌剂，并通过加水控制最终发酵原料的含水量保持在50%~70%，排除空气，压实密封，于25℃~30℃条件下避光厌氧发酵9天，即得到所述复合菌群饲料。
9.上述的新鲜菌草生长期为2个月，此时菌草高2.5m左右，营养成份含量高，含有较高的粗蛋白含量，干物质、粗脂肪和粗纤维都达到了较高水平，较利于动物消化。生长周期过短，菌草干物质、粗纤维含量较低；生长周期过长，菌草粗蛋白含量较低。
10.上述的白腐真菌粗酶液的制备方法如下：将白腐真菌单菌落接种于pda固体培养基中，于28℃条件下静置培养5天后，取4块直径5mm的菌丝块转接到200 ml的pdb液体培养基中，于28℃、160rpm/min条件下培养5天，利用白腐真菌自絮凝特性使其在培养液中形成直径为1-3mm的菌丝球，将含有菌丝球的培养液用4层无菌纱布过滤，所得滤液即为白腐真菌粗酶液。其中，白腐菌产酶酶液的添加量为每千克发酵底物0.5克。
11.上述的菌草发酵复合菌制备方法如下：将90g红糖、1kg无菌水混合均匀，熬煮，冷却至30℃时向其中加入2.5g植物乳杆菌菌种、2g短乳杆菌菌种、1.2g美洲虎乳杆菌菌种、1g副柠檬酸乳杆菌菌种、1g异常威克汉姆酵母菌种、0.8g布氏乳杆菌菌种、0.25g枯草芽孢杆菌菌种和0.25g普氏栖粪杆菌菌种，搅拌均匀后装入密闭发酵容器中，保持发酵温度为30℃，持续发酵1-5 d，得到发酵菌液；向20kg发酵底物培养基中加入2.64%（w/w）的发酵菌液，并通过加水控制最终发酵原料的含水量保持在60%，排除空气，压实密封，于28℃条件下避光厌氧发酵，以4天为一个发酵周期，连续传代四次，即得到所述菌草发酵复合菌剂。
12.上述的发酵底物培养基由16kg巨菌草粉，2kg麦麸粉，2kg玉米粉混合配制而成。
13.上述的发酵菌液中的总活菌浓度为1
×
108cfu/g，其中的植物乳杆菌∶短乳杆菌∶美洲虎乳杆菌∶副柠檬酸乳杆菌∶异常威克汉姆酵母∶布氏乳杆菌∶枯草芽孢杆菌∶普氏栖粪杆菌的数量比例为43∶35∶14∶6∶5∶4∶1∶1。
14.上述的菌草发酵复合菌剂中的总活菌浓度为2
×
109cfu/g，其中主要含有如下相对丰度的有益菌群：泛菌属（pantoea，51.57%）、乳酸菌属（lactobacillus，21.76%）、片球菌属（pediococcus，0.01%）、肠球菌属（enterococcus，0.02%）、阿德利长西氏酵母（naganishia，1.68%）、毕赤酵母（meyerozyma，5.31%）。
15.本发明的显著优点在于：一、白腐真菌是腐生在树木或木材上、引起木质白色腐烂的一类丝状真菌的总称，作为已知的最有效、最主要的木质素降解微生物，白腐真菌不仅可将木质素彻底降解为co2和h2o，还会大量降解半纤维素和纤维素，在自然界的碳素循环中起着关键的作用；除具有降解复杂有机物的能力外，部分白腐真菌还能够产生富有营养，甚至有药用、保健价值的子实体，因此白腐真菌在工业、农牧业、食品、医药、环境修复等与人类生活密切相关的重要领域都具有极高的应用价值。巨菌草和绿洲一号中含有大量木质纤维素，本发明使用白腐真菌粗酶液，可在发酵过程中有效降解发酵原料中的木质纤维素。
16.二、本发明所采用的菌草发酵复合菌剂，含有植物乳酸杆菌、短乳杆菌、美洲虎乳杆菌、副柠檬酸乳杆菌、酵母菌、布氏乳杆菌、枯草芽孢杆菌、普氏栖粪杆菌多种有益菌，各菌种协同发酵，不仅能有效降解原料中大分子蛋白或多糖，提高蛋白含量，适口性好，同时，
发酵复合菌群还可延长饲料的贮存时间，菌群进入动物消化肠道后，能迅速生长繁殖并发挥其功能，具有拮抗病原微生物的作用，能够产生抗菌类物质，抑制有害菌的繁殖，促进动物的生长发育、维持动物的肠道菌群平衡，使动物的免疫力增强从而可以预防一些肠道疾病。
17.三、本发明利用白腐真菌粗酶液和菌草发酵专用复合菌剂对菌草发酵底物进行降解发酵，得到菌草发酵饲料，所得菌草发酵饲料有着明显的酸香、酒香味，质地松软蓬松，颜色金黄，营养丰富，其适口性好，利于消化吸收，酸甜醇厚，风味独特；并且，该菌草发酵饲料的工艺生产简单、缩短发酵时间、成本低廉，有利于实现新型菌草发酵饲料的工业化大规模生产。
18.四、国内外关于利用菌草发酵饲料的研究较少，大多局限于菌草青贮，发酵时间长且不易贮存，本发明筛选出合适菌草发酵的菌群，得到最优发酵工艺，赋予菌草饲料独特的风味，且有效提高饲料营养，具有广阔的市场前景。
具体实施方式
19.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
20.下述实施例中所用白腐真菌、植物乳杆菌、短乳杆菌、美洲虎乳杆菌、副柠檬酸乳杆菌、异常威克汉姆酵母、布氏乳杆菌、枯草芽孢杆菌、普氏栖粪杆菌均为市售可购买到的常规现有菌种或通过常规筛选获得的菌种，不涉及新菌种的开发，只涉及这几种菌株的应用。例如，下述实施例中所用的植物乳杆菌具体可为中国普通微生物保藏管理中心保藏编号为cgmcc no：1.12974的菌株；短乳杆菌具体可为中国普通微生物保藏管理中心保藏编号为cgmcc no：1.2028的菌株；美洲虎乳杆菌具体可为中国普通微生物保藏管理中心保藏编号为cgmcc no：1.2826的菌株；副柠檬酸乳杆菌具体可为宁波明舟生物科技有限公司商品货号为jcm1597的菌株；异常威克汉姆酵母具体可为中国普通微生物保藏管理中心保藏编号为cgmcc no：2.1031的菌株；布氏乳杆菌具体可为中国普通微生物保藏管理中心保藏编号为cgmcc no：1.15607的菌株；枯草芽孢杆菌具体可为中国普通微生物保藏管理中心保藏编号为cgmcc no：1.821的菌株；普氏栖粪杆菌具体可为北京百欧博伟生物技术有限公司商品货号为bio-103890的菌株。
21.实施例1将白腐真菌单菌落接种于pda固体培养基中，于28℃条件下静置培养5天后，取4块直径 5mm的菌丝块转接到200 ml的pdb液体培养基中，于28℃、160rpm/min条件下培养5天，利用白腐真菌自凝絮特性使其在培养液中形成直径为1-3mm的菌丝球，得到的含有菌丝球的培养液为白腐真菌粗酶液1；将白腐真菌粗酶液1用4层无菌纱布过滤，所得滤液为白腐真菌粗酶液2。
22.实施例2 制备菌草发酵复合菌剂菌株：植物乳杆菌，短乳杆菌，美洲虎乳杆菌，副柠檬酸乳杆菌，异常威克汉姆酵母，布氏乳杆菌，枯草芽孢杆菌，普氏栖粪杆菌。
23.发酵底物培养基：16kg巨菌草粉，2kg麦麸粉，2kg玉米粉。其中，巨菌草粉的制备方法为：收割生长期为2个月的新鲜巨菌草，将收割的新鲜巨菌草于50℃下烘干12 h，粉碎成
20目细粉备用。
24.将红糖、无菌水按90g：1kg的比例混合均匀，熬煮，冷却至30℃时向其中加入2.5g植物乳杆菌菌种、2g短乳杆菌菌种、1.2g美洲虎乳杆菌菌种、1g副柠檬酸乳杆菌菌种、1g异常威克汉姆酵母菌种、0.8g布氏乳杆菌菌种、0.25g枯草芽孢杆菌菌种和0.25g普氏栖粪杆菌菌种，搅拌均匀后装入密闭发酵容器中，保持发酵温度为30℃，持续发酵1-5 d，保持发酵好的菌液ph在3.5-4之间，得到发酵菌液1；向20kg发酵底物培养基中加入2.64%（w/w）的发酵菌液1，并通过加水控制最终发酵原料的含水量保持在60%，排除空气，压实密封，于28℃条件下避光厌氧发酵4天，得到菌草发酵复合菌剂1；将菌草发酵复合菌剂1总质量的20%接种至20kg新的发酵底物培养基中，排除空气，压实密封，于28℃条件下避光厌氧发酵4天，得到菌草发酵复合菌剂2；将菌草发酵复合菌剂2总质量的20%接种至20kg新的发酵底物培养基中，排除空气，压实密封，于28℃条件下避光厌氧发酵4天，得到菌草发酵复合菌剂3；将菌草发酵复合菌剂3总质量的20%接种至20kg新的发酵底物培养基中，排除空气，压实密封，于28℃条件下避光厌氧发酵4天，得到菌草发酵复合菌剂4。
25.其中，所述发酵菌液1中的总活菌浓度为1
×
108cfu/g，其中的植物乳杆菌∶短乳杆菌∶美洲虎乳杆菌∶副柠檬酸乳杆菌∶异常威克汉姆酵母∶布氏乳杆菌∶枯草芽孢杆菌∶普氏栖粪杆菌的数量比例为43∶35∶14∶6∶5∶4∶1∶1。
26.其中，所述菌草发酵复合菌剂4中的总活菌浓度为2
×
109cfu/g。使用试剂盒提取菌草发酵复合菌剂4中的微生物dna，对提取的dna进行高通量测序，并计算微生物菌群丰度。微生物菌群丰度的计算方法如下：在高通量测序后，将所获得的测序序列进行拼接，经过质控后得到干净高质量序列，然后对所有样品进行抽平，某种属的微生物丰度为该种属的序列数占样品微生物总序列数的比例。结果发现，菌草发酵复合菌剂4中主要含有如下相对丰度的有益菌属：泛菌属（pantoea，51.57%）、乳酸菌属（lactobacillus，21.76%）、片球菌属（pediococcus，0.01%）、肠球菌属（enterococcus，0.02%）、阿德利长西氏酵母（naganishia，1.68%）、毕赤酵母（meyerozyma，5.31%）。
27.实施例3收割生长期为2个月的新鲜巨菌草，将收割的新鲜巨菌草与麦麸、玉米粉分别于50℃下烘干12 h，粉碎成20目细粉备用；将80份巨菌草粉、10份麦麸粉、10份玉米粉混合均匀，得到发酵原料；向发酵原料中加入2.5%（w/w）的菌草发酵复合菌剂4，并通过加水控制最终发酵原料的含水量保持在50%，排除空气，压实密封，于30℃条件下避光厌氧发酵9天，得到巨菌草发酵饲料。
28.收割生长期为2个月的新鲜绿洲一号牧草，将收割的新鲜绿洲一号牧草与麦麸、玉米粉分别于50℃下烘干12 h，粉碎成20目细粉备用；将80份绿洲一号牧草粉、10份麦麸粉、10份玉米粉混合均匀，得到发酵原料；向发酵原料中加入2.5%（w/w）的菌草发酵复合菌剂4，并通过加水控制最终发酵原料的含水量保持在50%，排除空气，压实密封，于30℃条件下避光厌氧发酵9天得到绿洲一号牧草发酵饲料。
29.实施例4收割生长期为2个月的新鲜巨菌草，将收割的新鲜巨菌草与麦麸、玉米粉分别于50℃下烘干12 h，粉碎成20目细粉备用；将80份巨菌草粉、10份麦麸粉、10份玉米粉混合均匀，得到发酵原料；向发酵原料中加入1.5%（w/w）的菌草发酵复合菌剂4，并通过加水控制最终
发酵原料的含水量保持在60%，排除空气，压实密封，于35℃条件下避光厌氧发酵9天，得到巨菌草发酵饲料。
30.收割生长期为2个月的新鲜绿洲一号牧草，将收割的新鲜绿洲一号牧草与麦麸、玉米粉分别于50℃下烘干12 h，粉碎成20目细粉备用；将80份绿洲一号牧草粉、10份麦麸粉、10份玉米粉混合均匀，得到发酵原料；向发酵原料中加入4.5%（w/w）的菌草发酵复合菌剂4，并通过加水控制最终发酵原料的含水量保持在60%，排除空气，压实密封，于35℃条件下避光厌氧发酵9天，得到绿洲一号牧草发酵饲料。
31.实施例5收割生长期为2个月的新鲜巨菌草，将收割的新鲜巨菌草与麦麸、玉米粉分别于50℃下烘干12 h，粉碎成20目细粉备用；将80份巨菌草粉、10份麦麸粉、10份玉米粉混合均匀，得到发酵原料；向发酵原料中加入3.5%（w/w）的菌草发酵复合菌剂4，并通过加水控制最终发酵原料的含水量保持在70%，排除空气，压实密封，于30℃条件下避光厌氧发酵9天，即得到巨菌草发酵饲料。
32.收割生长期为2个月的新鲜绿洲一号牧草，将收割的新鲜绿洲一号牧草与麦麸、玉米粉分别于50℃下烘干12 h，粉碎成20目细粉备用；将80份绿洲一号牧草粉、10份麦麸粉、10份玉米粉混合均匀，得到发酵原料；向发酵原料中加入3.5%（w/w）的菌草发酵复合菌剂4，并通过加水控制最终发酵原料的含水量保持在70%，排除空气，压实密封，于30℃条件下避光厌氧发酵9天，即得到绿洲一号牧草发酵饲料。
33.实施例6收割生长期为2个月的新鲜巨菌草，将收割的新鲜巨菌草与麦麸、玉米粉分别于50℃下烘干12 h，粉碎成20目细粉备用；将80份巨菌草粉、10份麦麸粉、10份玉米粉混合均匀，得到发酵原料；向发酵原料中加入2.5%（w/w）的白腐真菌粗酶液2和2.5%（w/w）的菌草发酵复合菌剂4，并通过加水控制最终发酵原料的含水量保持在50%，排除空气，压实密封，于30℃条件下避光厌氧发酵9天，即得到巨菌草发酵饲料。
34.收割生长期为2个月的新鲜绿洲一号牧草，将收割的新鲜绿洲一号牧草与麦麸、玉米粉分别于50℃下烘干12 h，粉碎成20目细粉备用；将80份绿洲一号牧草粉、10份麦麸粉、10份玉米粉混合均匀，得到发酵原料；向发酵原料中加入2.5%（w/w）的白腐真菌粗酶液2和2.5%（w/w）的菌草发酵复合菌剂4，并通过加水控制最终发酵原料的含水量保持在50%，排除空气，压实密封，于30℃条件下避光厌氧发酵9天，即得到绿洲一号牧草发酵饲料。
35.实施例7收割生长期为2个月的新鲜巨菌草，将收割的新鲜巨菌草与麦麸、玉米粉分别于50℃下烘干12 h，粉碎成20目细粉备用；将80份巨菌草粉、10份麦麸粉、10份玉米粉混合均匀，得到发酵原料；向发酵原料中加入2.5%（w/w）的白腐真菌粗酶液1和2.5%（w/w）的菌草发酵复合菌剂4，并通过加水控制最终发酵原料的含水量保持在50%，排除空气，压实密封，于30℃条件下避光厌氧发酵9天，即得到巨菌草发酵饲料。
36.收割生长期为2个月的新鲜绿洲一号牧草，将收割的新鲜绿洲一号牧草与麦麸、玉米粉分别于50℃下烘干12 h，粉碎成20目细粉备用；将80份绿洲一号牧草粉、10份麦麸粉、10份玉米粉混合均匀，得到发酵原料；向发酵原料中加入2.5%（w/w）的白腐真菌粗酶液1和2.5%（w/w）的菌草发酵复合菌剂4，并通过加水控制最终发酵原料的含水量保持在50%，排除
空气，压实密封，于30℃条件下避光厌氧发酵9天，即得到绿洲一号牧草发酵饲料。
37.对比例1收割生长期为2个月的新鲜巨菌草，将收割的新鲜巨菌草与麦麸、玉米粉分别于50℃下烘干12 h，粉碎成20目细粉备用；将80份巨菌草粉、10份麦麸粉、10份玉米粉混合均匀，得到发酵原料；通过加水控制最终发酵原料的含水量保持在50%，排除空气，压实密封，于30℃条件下避光厌氧发酵9天，即得到巨菌草发酵饲料。
38.收割生长期为2个月的新鲜绿洲一号牧草，将收割的新鲜绿洲一号牧草与麦麸、玉米粉分别于50℃下烘干12 h，粉碎成20目细粉备用；将80份绿洲一号牧草粉、10份麦麸粉、10份玉米粉混合均匀，得到发酵原料；通过加水控制最终发酵原料的含水量保持在50%，排除空气，压实密封，于30℃条件下避光厌氧发酵9天，即得到绿洲一号牧草发酵饲料。
39.现场感官评定参照农业部《青贮饲料质量评定标准》上的方法，对上述实施例及对比例所得发酵饲料的质量进行评定，色泽15分，气味15分，质地10分。其中优等为40分~30分，良好为30分~20分，一般为20分~10分，差为10分以下。从表1和表2的结果可知，各实施例所得发酵饲料的感官评定结果均为良好及以上，相对于对比例1，实施例3~7所得发酵饲料的感官评价总分更高，其中，实施例3、实施例6及实施例7所得巨菌草发酵饲料以及绿洲一号牧草发酵饲料的感官评价总评分均达30以上，皆为优等，色泽呈淡黄绿色或淡黄绿色，具有酒酸香、青草甜香，质地呈微湿润，松软手握成团不易散开。
40.表1 巨菌草发酵饲料的感官评价结果表2 绿洲一号牧草发酵饲料的感官评价结果对上述实施例所得发酵饲料的化学成分进行测定。干物质（dm）、粗蛋白（cp）分别按照gb/t 6435-2014、gb/t 6432-2018测定。中性洗涤纤维（ndf）、酸性洗涤纤维（adf）、酸
性洗涤木质素（adl）和酸不溶灰分（aia）的测定，以及纤维素和半纤维素含量计算参考【宋书红.刈割对紫花苜蓿和红豆草产量及营养价值的影响[d].硕士学位论文.杨凌:西北农林科技大学,2016】的方法，相对饲用价值（rfq）计算参考【rohweder d a,barnes r f,jorgensen n. proposed hay grading standards based on laboratory analyses for evaluating quality. journal of animal science,1978,47:747-759.】，挥发酸的测定参考【张英,周汉林,刘国道,等.利用hplc法测定王草青贮饲料中的有机酸[j].热带作物学报,2013,34(02):377-381.】进行改良。氨态氮（nh
3-n）含量的测定采用苯酚－次氯酸钠比色法进行，具体参照【broderick g a,kang j h. automated simultaneous determination of ammonia and total amino acids in ruminal fluid and in vitro media[j].journal of dairy science,1980,63(1).volume 63:64-75.】。通过表3和表4可知，在各类指标检测结果中，实施例3~7相对照于对比例1，ph、ndf、adf、纤维素、半纤维素的含量均降低，可以更好的改变发酵饲料的纤维结构，提高发酵饲料的消化率和适口性，给乳酸菌提供更多的营养底物。饲料在发酵过程中，蛋白质和氨基酸降解产生氨态氮，因此从氨态氮的含量高低可以看出青贮质量的好坏，氨态氮值越低，氨态氮/总氮的比值越大，说明蛋白质和氨基酸的分解越多；从表中看出对比例未加菌组氨态氮值偏低，可能是由于青贮还未开始进入到发酵期，未分解营养化物也就未产生大量氨态氮，进而该值比较低，而其他组的该值也在可控范围之类。综上，巨菌草发酵饲料以实施例7综合结果最佳，绿洲一号发酵饲料以实施例6效果最佳。
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表3巨菌草发酵饲料的化学成分指标检测结果表4 绿洲一号牧草发酵饲料的化学成分指标检测结果
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，本发明的专利保护范围以权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书内容所作的等同于结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。