一种母乳中寡糖含量的定量检测方法

1.本发明涉及一种母乳中游离寡糖的绝对含量测定的方法，适用于母乳 样品快速、高通量分析。
技术背景
2.在婴儿的生长发育过程中，来源于母乳的寡糖起着至关重要的作用， 如抗炎、抗感染、免疫调控和维持肠道菌群平衡。其中酸性寡糖在体内起 着不可替代的作用，如预防癌症发生、促进婴儿脑的正常发育等功能。
3.准确快速的对母乳中寡糖进行定量分析，是进一步进行母乳寡糖研究 的必要手段。高通量的定量检测能够全面分析母乳中寡糖含量，完成大量 人群样本中寡糖含量的分析以及跟踪寡糖含量随哺乳期的变换，获得队列 样本信息，这都为进一步开展寡糖的生物功能研究和更好的利用人乳寡糖 提供有利信息。然而，由于母乳成分复杂，寡糖种类和结构复杂多样，异 构体分离和鉴定困难，高通量的完成多种异构体的准确定量存在很大挑战。
4.串联质谱能够提供更多的化合物信息，为异构体的鉴定和定量提供帮 助，液相色谱与质谱串联，能够为质谱提供有效的前一级分离，合理的减 少共流出，使得质谱定量稳定性准确性提升。因此，本发明设计一种新的 母乳寡糖含量的快速定量检测方法，利用液相色谱与质谱串联，调整优化 液相分离条件和质谱参数信息，实现24中寡糖的高通量绝对定量。


技术实现要素：

5.本发明涉及一种母乳中游离寡糖的快速定量检查方法。其特征是，样 品经过低温离心除脂，加入有机溶剂除蛋白后，使用由24种寡糖标准品建 立的色谱质谱联用的定量分析方法，实现母乳中寡糖的全面快速定量。
6.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
7.一种母乳中寡糖含量的快速定量方法：使用24种寡糖标准品,选取合适 的色谱分离填料，在适当的液相条件下进行分离，同时以标准品建立的质 谱多通道定量方法绘制标准曲线，对前处理后的母乳中游离寡糖进行定量 监测，得到母乳中游离寡糖的绝对含量信息。
8.所述24种寡糖标准品如图1所示。
[0009][0010]
24种寡糖标准品结构信息
[0011]
1.使用的色谱分离填料包括但不仅限于:硅胶或硅胶表面键合极性基团 的填料，其结构式如下
[0012][0013]
其中sio2为硅胶，r为极性基团，有氨基酸、酰胺、氨基、羧基、糖 基和两性离子等中的一种或几种
[0014]
2.洗脱液中的有机溶剂为甲醇、乙腈、乙醇和丙酮中的一种或几种。
[0015]
3.缓冲盐类型及其于流动相中的浓度及ph如下：
[0016]
a)甲酸铵缓冲盐，浓度0-200mm，ph 2.0-7.0；
[0017]
b)乙酸铵缓冲盐，浓度0-200mm，ph 2.0-7.0；
[0018]
c)碳酸氢铵缓冲盐，浓度0-200mm，ph 6.0-9.0；
[0019]
4.优化流动相梯度如下：
[0020]
流动相水或者缓冲盐水溶液和有机溶剂作为洗脱液，混合比例为 5/95～95/5。
[0021]
5.母乳均质步骤为：冷冻母乳样品于2-20℃解冻；超声不少于1分钟， 涡旋震荡不少于5秒，上述步骤重复不少于1次后，取出样品中间层完成 母乳的均质取样；
[0022]
6.母乳的低温除脂质步骤为：取均质母乳样品，于500-50000g离心 5-500分钟，重复不少于1次后，取出下层透明/半透明溶液即完成母乳样品 的低温除质；
[0023]
7.母乳样品沉淀除蛋白步骤为：取低温除质后的母乳样品，加入不少 于1倍体积量的有机溶剂混匀，于0-10℃静置2-48小时后，0-10℃， 500-50000g离心不少于5分钟，取出上层清液，完成母乳样品的沉淀除蛋 白处理
[0024]
本发明具有如下优点
[0025]
1.定量寡糖种类多，准确度高。方法能够定量的寡糖涵盖了母乳中 95％以上质量浓度的寡糖分子，能够全面反应母乳中寡糖的含量情况。
[0026]
2.高通量，前处理过程快速简单，分析定量时间短，适用于大量样 本分析。
[0027]
3.定量精度高，重复性好，方法经过了精密度和回收率等方法学验 证，具有很好的稳定性和可重复性。
[0028]
4.适用范围广，可用于不同种哺乳动物乳和人乳的绝对定量分析
附图说明
[0029]
图1为24种寡糖标准品结构信息；
[0030]
图2为24种标准品经液相分离tic图；
具体实施方式
[0031]
实施例1：
[0032]
母乳的均质过程：
[0033]
取一定量的母乳于4℃自然解冻，超声均质10分钟，涡旋震荡1分钟， 而后取出中间层完成母乳的均质取样；
[0034]
母乳的低温除脂质过程：
[0035]
取均质母乳样品于10000g，4℃,离心10分钟，离心结束后取出下层 透明或半透明溶液，重复离心两次后，完成母乳低温除脂过程；
[0036]
母乳样品沉淀除蛋白过程：
[0037]
取低温除质后的母乳样品，加入3倍体积的甲醇混匀，于10℃静置2 小时后，4℃，10000g离心10分钟，取出上层清液完成母乳样品的沉淀除 蛋白；
[0038]
至此完成母乳的前处理即母乳寡糖的除杂提取过程。
[0039]
实施例2：
[0040]
24种寡糖标准品的液相分离过程
[0041]
实验选用waters beh xamide色谱柱(2.1*150mm，1.7μm)
[0042]
使用乙腈/水乙酸胺作为流动相，乙酸胺浓度50mm
[0043]
梯度条件如下：
[0044][0045]
其中a:体积比71/19/10的acn/h2o/50mm乙酸铵,b：体积比
ꢀ‑
20/70/10的acn/h2o/50mm乙酸铵
[0046]
色谱柱柱温40℃,流速0.3ml/min
[0047]
图2为24种标准品经液相分离tic图；
[0048]
实施例3：
[0049]
24种寡糖标准品定量曲线的绘制
[0050]
标准品按照需求配置混标，分为高含量组和低含量组，具体信息如下
[0051]
[0052][0053]
分别配置1mg/ml的高含量和低含量组混标，以乙腈水(体积浓度70％) 梯度稀释为6个浓度(见表格)，液相分离过程如实施例2所示；
[0054]
标准品定量曲线、定量限跟检出限见下表
[0055]
[0056][0057]
定量和定性检测离子对为：
[0058]
[0059]


技术特征：
1.一种母乳中寡糖含量的定量检测方法，采用色谱质谱联用，使用24种寡糖标准品，进行液相色谱分离，质谱检测，以保留时间为横坐标，提取离子对的响应数值为纵坐标，建立标准品的标准曲线，对前处理后的母乳中游离寡糖进行色谱质谱联用分析，代入标准曲线，得到母乳中24种游离寡糖的绝对含量信息；所述24种寡糖标准品包括：3’sl(3
’‑
sialyllactose)、6’sl(6
’‑
sialyllatose)、lst-b(lacto-sialyl-tetraose b)、lst-c((lacto-sialyl-tetraose)、dslnt(disialyl-lnt)、3’slnfp-ii(3
’‑
sialyl-lacto-n-fucopentaose ii)、6’slnfp-vi(6
’‑
sialyl-lacto-n-fucopentaose ii)、2’fl(2
’‑
fucosyllactose)、3-fl(3-fucosyllactose)、lnt(lacto-n-tetraose)、lnnt(lacto-n-neotetraose)、dfl(difucosyl-lacto)、lnfp-i(lacto-n-fucopentaose i)、lnfp-iii(lacto-n-fucopentaose iii)、lnfp-ii(lacto-n-fucopentaose ii)、lnndfh-ii(lacto-n-neo-difucohexaose ii)、lndfh-ii(lacto-n-difucohexaose ii)、lndfh-i(lacto-n-difucohexaose i)、lnndfh-i(lacto-n-neo-difucohexaose i)、mflnnh(monofucosyl-lacto-n-neo-hexaose)、mflnh-iii(monofucosyl-lacto-n-hexaose iii)、mflnh-i(monofucosyl-lacto-n-hexaose i)、dfplnnh(difucosyl-para-lacto-n-neo-hexaose)、dflnh[a](difucosyl-lacto-n-hexaose)。2.根据权利要求1所述的方法，其使用的色谱分离填料包括但不仅限于:硅胶或硅胶表面键合极性基团的填料中的一种或二种以上，所键合的极性基团有氨基酸、酰胺、氨基、羧基、糖基合两性离子中的一种或几种。3.根据权利要求1所述的方法，使用的液相分离条件包括：a)流动相包括但不仅限于水；以及有机溶剂中的乙腈，甲醇，乙醇，丙酮，异丙醇中的一种或几种；b)添加剂包括甲酸铵缓冲盐，乙酸铵缓冲盐，甲酸，乙酸，三氟乙酸中的一种或几种，缓冲盐于流动相中浓度为0-200mm；c)色谱柱内径为2.1-10mm；d)流动相为水和/或缓冲盐溶液、以及有机溶剂；水和/或缓冲盐溶液与有机溶剂作为洗脱液的比例为5/95～95/5；e)流速为0.1-2bv/min；f)柱温为15-60℃。4.根据权利要求1所述的方法，，以标准品建立过程，其定量和定性检测离子对为：2’fl:487.13>325.02,523.13>178.943-fl:487.1>322.9,523.13>178.943’sl:632.18>289.986’sl:632.1>289.95dfl:632.9>325.1lnt:706.3>202lnnt:706.3>263dslnt:643.64>290.1lnfp-i:852.3>325
lnfp-iii:852.3>364.1lnfp-ii:852.3>348.1lstb:997.25>290lstc:997.25>289.93’slnfpii:1143.25>290.1,1143.25>348.16’slnfpvi:1143.2>290.1lnndfh-ii:998.30>364.02lndfh-ii:998.3>348lndfh-i:998.3>348.01,998.3>325.10lnndfh-i:998.3>325.1mflnnh:1217.4>364,1217.4>526.2mflnh-iii:1217.4>672,1217.4>364.1mflnh-i:1217.4>526.1dfplnnh:1363.45>364.1,1363.45>875.2dflnh[a]:1363.5>202,1363.5>325。5.按照权利要求1所述的方法，母乳前处理前处理过程包括均质、低温除脂质、沉淀除蛋白，1)母乳均质步骤为：冷冻母乳样品于2-20℃解冻；超声不少于1分钟，涡旋震荡不少于5秒，上述超声涡旋步骤重复不少于0次后，取出样品中间层完成母乳的均质取样；2)母乳的低温除脂质步骤为：取均质母乳样品，-4～10℃，于500-50000g离心5-500分钟，重复不少于1次后，取出下层透明或半透明溶液即完成母乳样品的低温除质；3)母乳样品沉淀除蛋白步骤为：取低温除质后的母乳样品，加入不少于1倍体积量的有机溶剂混匀，于0-10℃静置2-48小时后，0-10℃，500-50000g离心不少于5分钟，取出上层清液，完成母乳样品的沉淀除蛋白处理；有机溶剂为：乙腈，乙醇，甲醇，丙酮，异丙酮，异丙醇中的一种或几种。

技术总结
本发明涉及一种母乳中游离寡糖的快速定量检查方法。其特征是，样品经过低温离心除脂，加入有机溶剂除蛋白后，使用由24种寡糖标准品建立的色谱质谱联用的定量分析方法，实现母乳中寡糖的全面快速定量。该方法具有高通量，定量全面，灵敏度高，精确性好，稳定性佳的特点。适用于哺乳动物母乳寡糖的全面、快速定量检测。测。测。


技术研发人员：梁鑫淼 李佳齐 闫竞宇 郑义 郭志谋
受保护的技术使用者：中国科学院大连化学物理研究所
技术研发日：2020.12.03
技术公布日：2022/6/7