大麻二酚酸合成酶突变体及其构建方法与应用与流程

1.本发明涉及大麻二酚酸合成酶突变体及其构建方法与应用，属于合成生物领域基因工程改造技术领域。


背景技术：

2.cbda化学名称为2,4-dihydroxy-3-[(1r,6r)-3-methyl-6-prop-1-en-2-ylcyclohex-2-en-1-yl]-6-pentylbenzoic acid，分子式为c
22h30
o4，cas号为1244-58-2。
[0003]
大麻二酚(cannabidiol, cbd)是大麻植物的次生代谢物，是由cbda经脱羧获得。研究发现cbd具有抗肿瘤、神经保护、代谢和免疫调节、抗炎抗氧化、保护心血管和护肝等功效，2008年fad批准了首个工业大麻植物来源的cbd处方药epidiolex，用于治疗两种非常严重且罕见的婴儿癫痫病dravet综合征和lennox-gastut综合症。在传统的工业生产中，cbd主要是通过提取大麻植物的前体cbda，然后经过加热脱羧后得到cbd。该方法存在周期长、效率低、成本高、环境不友好和可能含有致幻成分四氢大麻酚（tetrahydrocannabinol，thc）等缺点。因此，采用合成生物学技术实现以廉价原材料在短周期内高效合成cbda十分必要。
[0004]
cbda在大麻（cannabissativa）植物里由cbdas（cannabidiolic acid synthase，大麻二酚酸合成酶）以fad为辅因子，通过对底物大麻萜酚酸 (cannabinol acid，cbga)进行环化而得，同时消耗一份子o2，产生一份子h2o2。cbga作为多种大麻素合成的前体，可被多种酶，包括cbdas和四氢大麻酚酸合成酶（tetrahydrocannabinolic acid synthase，thcas）作为底物，分别合成cbda和四氢大麻酚酸（tetrahydrocannabinolic acid，thca）。据报道，这两个酶最初在大麻被鉴定，且两种酶在大麻里的酶活性相似。后来研究者们尝试把它们表达在不同的物种里，包括pichia pastoris，昆虫细胞spodopterafrugiperda，烟草tobacco和komagataellaphaffii，与thcas不同的是，仅在p. pastoris和k.phaffii可检测到cbdas活性。xiaozhou luo等首次在酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）细胞中从头合成多种大麻素，结果显示，cbda的产量与thca相差500倍以上。综上，尽管在大麻植物里，cbdas和thcas的酶活性相似，但cbdas在其他物种体内表达相对thcas较难，产量也低，这给工业化生物合成cbda带来困难，故需要改造出产量更高的cbdas酶，从而提高生产经济效益。


技术实现要素：

[0005]
[技术问题]本发明要解决的技术问题是野生型的cbdas在酿酒酵母中直接表达时活性低，相应地，cbda产量也低，这给工业化生物合成cbda带来困难。
[0006]
[技术方案]本发明利用定点突变对cbdas进行改造，得到多个活性提高的cbdas突变体。本发明利用酿酒酵母表达得到了这些活性提高的cbdas突变体，这些突变体可在酵母胞内合成
cbda，且cbda的产量得到了提高。
[0007]
本发明披露了大麻二酚酸合成酶突变体（cbdas突变体）是如下（a）或（b）：（a）氨基酸序列是以sed id no：1所示序列的第29位至544位为基础，将第56位天冬酰胺、第213位组氨酸、第256位甲硫氨酸、第116位丝氨酸、第343位谷氨酰胺、第362位天冬氨酸、第365位天冬酰胺、第398位谷氨酰胺、第446位半胱氨酸、第474位赖氨酸中的一个或多个进行取代得到的；（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有大麻二酚酸合成酶活性的由（a）衍生的蛋白质。
[0008]
本发明的某些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列是以sed id no：1所示序列的第29位至544位为基础，将第56位天冬酰胺替换为组氨酸。
[0009]
本发明的某些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列是以sed id no：1所示序列的第29位至544位为基础，将第213位组氨酸替换为天冬氨酸。
[0010]
本发明的某些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列是以sed id no：1所示序列的第29位至544位为基础，将第256位甲硫氨酸替换为异亮氨酸，或，将第256位甲硫氨酸替换为异亮氨酸并将第116位丝氨酸替换为丙氨酸。
[0011]
本发明的某些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列是以sed id no：1所示序列的第29位至544位为基础，将第343位谷氨酰胺替换为谷氨酸，或，将第343位谷氨酰胺替换为谷氨酸并将第116位丝氨酸替换为丙氨酸。
[0012]
本发明的某些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列是以sed id no：1所示序列的第29位至544位为基础，将第365位天冬酰胺替换为赖氨酸，或，将第365位天冬酰胺替换为赖氨酸并将第362位天冬氨酸替换为丙氨酸，或，将第365位天冬酰胺替换为赖氨酸并将第116位丝氨酸替换为丙氨酸，或，将第362位天冬氨酸替换为丙氨酸、第365位天冬酰胺替换为赖氨酸，以及第116位丝氨酸替换为丙氨酸。
[0013]
本发明的某些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列是以sed id no：1所示序列的第29位至544位为基础，将第398位谷氨酰胺替换为赖氨酸，或，将第398位谷氨酰胺替换为赖氨酸并将第116位丝氨酸替换为丙氨酸。
[0014]
本发明的某些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列是以sed id no：1所示序列的第29位至544位为基础，将第446位半胱氨酸替换为丙氨酸。
[0015]
本发明的某些实施方式中，所述突变体的氨基酸序列是以sed id no：1所示序列的第29位至544位为基础，将第474位赖氨酸替换为谷氨酰胺。
[0016]
本发明还披露带有信号肽的cbdas突变体，所述信号肽的氨基酸序列如sed id no：1的第1~28位所示，或者如seq id no:2所示。
[0017]
本发明还披露了携带编码cbdas突变体的基因的核酸构建体，例如，携带编码cbdas突变体的基因的表达载体。所述的重组表达载体可通过本领域常规方法将本发明所述的cbdas点突变体连接到各种市售的空载体上构建而成。所述的市售的空载体可以是常规的质粒载体，只要能满足在相应的表达宿主中正常复制、可通过如抗生素或营养缺陷筛选的、可正常表达cbdas点突变体的载体即可。本领域的技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子、终止子和宿主细胞。对于酿酒酵母，所述的质粒载体优选pcev载体。示例的，可通过pcr扩增把cbdas突变体编码基因和pcev载体骨架扩增出来，扩增得到的cbdas
cbga混合标品hplc图谱。
具体实施方式
[0024]
术语突变体：意指具有cbdas活性的、在一个或多个（例如若干个）位置包含改变（即取代、插入和/或缺失）的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。
[0025]
编码基因，意指多核苷酸，所述多核苷酸直接规定了cbdas的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，所述可读框以起始密码子(例如atg、gtg或ttg)开始并且以终止密码子(例如taa、tag或tga)结束。编码序列可以为基因组dna、cdna、合成dna或其组合。
[0026]
表达：术语“表达”包括涉及cbdas或cbdas突变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
[0027]
宿主细胞：意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
[0028]
下述实施例所用的重组质粒转化方法或检测方法，可根据本领域常识进行组合或更改。
[0029]
下述实施例所用的检测cbda产量的方法是：取发酵96h时菌液200 μl，加入200 μl体积的玻璃珠和0.4 ml乙酸乙酯：甲酸(0.05%)，在高速组织研磨仪中，以60 hz处理30 s，间隔30s，重复12次。瞬时离心后，取上层有机层0.28 ml至1.5 ml离心管中，重复两次，并将收集的上层有机相合并。三次提取的有机层，置于真空浓缩仪里浓缩至无溶剂残留。将干燥后的1.5 ml离心管置于冰上降至低温后，每管加入乙腈/双蒸水/甲酸混合液（体积比：80%/20%/0.05%）重悬，震荡30 s后于13000 rpm，4℃离心5 min，每管取60 μl上清，用0.22 μm有机膜过滤至液相检测瓶内插管中作为检测样品。检测样品使用安捷伦1290 infinity ii uhpl dad检测器检测cbda浓度。流动相为a相：95%水-5%乙腈 0.1% 甲酸，b相：95%乙腈-5%水 0.1% 甲酸，色谱柱为agilent ec-c18 2.7
ꢀµ
m, 4.6
ꢀ×
100 mm。以cbda标样为对照，检测样品中cbda的浓度。
[0030]
下述实施例所用的重组质粒pcev-cbdas，是以酵母表达质粒pcev-g4-km为出发质粒，插入了编码seq id no:1所示cbdas的基因序列。
[0031]
下述实施例所用的宿主菌saccharomycescerevisiae ycan31具有将底物橄榄醇酸（olivetolicacid，oa）转化为cbga的能力，且基因组不含cbdas表达序列。saccharomycescerevisiae ycan31的构建过程参见：luo x, reiter ma, d'espaux l, wong j, denby cm, lechner a, zhang y, grzybowski at, harth s, lin w, lee h, yu c, shin j, deng k, benites vt, wang g, baidoo eek, chen y, dev i, petzold cj, keasling jd. complete biosynthesis of cannabinoids and their unnatural analogues in yeast. nature. 2019 mar;567(7746):123-126. doi: 10.1038/s41586-019-0978-9. epub 2019 feb 27. erratum in: nature. 2020 apr;580(7802):e2. pmid: 30814733。
[0032]
下述实施例所用的e.coli dh5
ɑ
感受态购自北京全式金。gel extraction kit d2500和plasmid mini kit i d6943均购自omega。peg3350、醋酸锂、氨基酸等均购于sigma公司。鲑鱼精dna购于北京索莱宝科技有限公司。pcr扩增试剂盒q5 high-fidelity dna polymerase、kld酶混合液购于new england biolabs（neb）公司。
[0033]
下述实施例所用的引物购于生工。
[0034]
下述实施例所用的引物如表1所示，其中，带下划线的碱基为点突变的碱基。
[0035]
表1 引物表
引物名称引物序列（5`-3`） f-416duptatcgtccaactgcatggagatgaseqidno:3r-416dup-pgal1ggtttttttaggctaagataatgggtccggttaaacggatctcgseqidno:4f-416ddown-tadh1caaatgcctgcaaatcgctccccatttcccgaacatgctccttcactattttaacaseqidno:5r-416ddownatttttcaattgaggaaacttgaaaggtgtseqidno:6f-pgal1-416dupcaatgcgagatccgtttaaccggacccattatcttagcctaaaaaaaccttctctttggaseqidno:7r-tadh1-416ddownaatagtgaaggagcatgttcgggaaatggggagcgatttgcaggseqidno:8f-pgal1-seqccactttaactaatactttcseqidno:9r-tadh1-seqcaacctgacctacaggaaseqidno:10f-416d-seqtggctttttgattgattgtacaggaseqidno:11r-416d-seqtcgcaataatctatatgctcaccaaseqidno:12f-cbdas_n56hatacactcagcacaaccctctatatatgseqidno:13r-cbdas_n56hactaacttaaggttcgtcgseqidno:14f-cbdas_s116agggacacgacgctgaggggatgagttatattagseqidno:15r-cbdas_s116accgctacgggtacgtattseqidno:16f-cbdas_h213dagttaatgttgatggaaaagtgttagseqidno:17r-cbdas_h213daagtgagcatctatgatattgseqidno:18f-cbdas_m256iaaagagtaccattttctcagtaaagaaaataatggseqidno:19r-cbdas_m256iggaacagccacaagcctgseqidno:20f-cbdas_q343eagattgtagagaactttcctggseqidno:21r-cbdas_q343egtcttcttgatacctagttcseqidno:22f-cbdas_d362a n365kttcaaaaaggaaattttattagataggagseqidno:23r-cbdas_d362a n365kgttggcagtgtcataattgacgacseqidno:24f-cbdas_n365kacaacttcaaaaaggaaattttattagseqidno:25r-cbdas_n365kcagtgtcataattgacgacseqidno:26f-fcbdas_q398ktgtttttgttaagattctggagaagseqidno:27r-cbdas_q398kctttcaggaatgggttttttaacseqidno:28f-cbdas_c446agtggtatatcgcctcctgggagaaacseqidno:29r-cbdas_c446aaactcgtacaggataccagseqidno:30f-cbdask474qctacgtttcccagaaccccaggtseqidno:31r-cbdask474qggcgtcatgaaattgtagatattcseqidno:32
下述实施例所用的宿主菌株ycan31的基因信息如下表2所示。
[0036]
表2 ycan31的基因信息
菌株宿主菌基因信息ycan10cen.pk2-1cerg9::kanmx/ctr3p-erg9;leu2-3_112::his3mx6/gal1p-erg19/gal1p-erg8;ura3-52::gal1p-efmvas(a110g)-cyc1t/gal10p-efmvae-adh1t;his3δ1::hphmx4/gal1p-erg12/gal10p-idi1;308a::gal1p-erg20(f96w-n127w)-tdh1tycan14ycan101114a::gal1p-cspt4-t-tdh1t
ycan30ycan14607b::hhf1p-csaae1-adh1tycan31ycan30911b::gal1p-cstks-csoac-eno1t
实施例1 cbdas
c446a
突变体的制备与应用（1）cbdas
c446a
点突变载体的构建采用kld法（neb）构建定点突变质粒pcev-cbdas
c446a
。设计定点突变引物，以pcev-cbdas质粒作为模板，用引物f-cbdas_c446a和r-cbdas_c446a进行pcr扩增，引入突变碱基，扩增的片段长度为8450 bp。所述的pcr扩增采用试剂盒q5 high-fidelity dna polymerase，体系为q5酶0.5 μl，10
×
buffer 5 μl，上下游引物各2 μl，模板50 ng，ddh2o补足50 μl。反应程序：（1）98℃预变性30 s；（2）98℃变性15 s；（3）57℃退火30 s；（4）72℃扩增4.5 min；（5）步骤（2）-（4）共进行25个循环；（6）最后72℃延伸5 min。所扩增的片段经琼脂糖凝胶电泳验证片段大小后，切胶纯化。回收的片段进行kld反应，反应体系为：2
×
kld buffer 5 μl，10
×
kld enzymes 1 μl，片段100 ng，ddh2o补足10 μl，室温反应30 min。所得到的连接产物全部转化到e.coli dh5
ɑ
感受态细胞中，并涂布于含有50 μg/l氨苄青霉素的lb平板中，37℃培养过夜。第二天挑取单克隆进行液体培养和质粒提取。提取后的质粒送至生工生物测序部进行测序验证，测序引物优选f-pgal1-seq和r-tadh1-seq，挑选测序正确的定点突变质粒pcev-cbdas
c446a
进行保存。
[0037]
（2）cbdas
m256i, s116a
点突变载体的构建cbdas
m256i, s116a
点突变载的构建分两部进行。第一步参照实施例1（1）的方法，以pcev-cbdas质粒作为模板，用引物f-cbdas_s116a和r-cbdas_s116a进行pcr扩增，再经kld反应构建点突变载体pcev-cbdas
s116a
。第二步，以质粒pcev-cbdas
s116a
作为模板，用引物f-cbdas_m256i和r-cbdas_m256i进行pcr扩增，再经kld反应构建点突变载体pcev-cbdas
m256i, s116a
。
[0038]
（3）cbdas
c446a
点突变转化体的构建
①
从酿酒酵母基因组上扩增获得插入位点的上游片段和下游片段，扩增上游片段所用引物为f-416d up和r-416d up-pgal1，扩增下游片段所用引物为f-416d down-tadh1和r-416d down。带有点突变的cbdas片段分别从实施实例1所构建的定点突变质粒pcev-cbdas
c446a
上利用引物f-pgal1-416d up和r-tadh1-416d down扩增所得。
[0039]
②
酵母转化采用醋酸锂/peg3350法。简单来说，将宿主菌ycan31接种于10 ml/250 ml液体ypd培养基中，于30℃，200 rpm培养过夜。第二天测定菌液od
600
值，并取适量菌液接种于50 ml ypd中稀释至od
600
值为0.2，继续培养4.5 h。每个构建取5 od菌液，常温3000 rcf，离心5 min，弃上清，并用ddh2o洗涤两次。最后，用50 μl dna mix（带有点突变的cbdas片段、插入位点的上游片段和下游片段共2 μg，pcut 250 ng，加ddh2o至50 μl）悬浮细胞。然后，加入醋酸锂转化mix（50% w/v peg3350 260 μl，1m 醋酸锂 36 μl，变性鱼精dna 10 μl， ddh2o 4 μl），混匀。42℃水浴40 min。25℃，5000 rpm，离心1 min，弃上清，并用500 μl ddh2o，轻轻吹匀。取50 μl菌液涂布于筛选平板（标记为平板a）中，30℃培养2天。
[0040]
③
筛选平板为合成培养基sd ura-。筛选步骤如下：每个平板随机挑取4个克隆子，用马克笔圈出来并标记为#1、2、3、4，并划线于ypd平板中（标记为平板b），30℃培养2天。从平板b里挑取一个单菌落接种于5 ml ypd中，30℃，200 rpm培养过夜。取菌液50倍稀释于5 ml ypd培养基中，继续培养4 h，然后挑取少量菌液划线于ypd平板中（标记为平板c），30℃
培养2天。在平板c中随机挑取4个克隆子，并标记为#a、b、c、d，并把他们分别划线于ypd平板（标记为平板d）和sd ura-平板中，30℃培养2天。挑选2个来自于平板d的阳性克隆子（即能在ypd平板中生长，但不能在sd ura-平板中生长的克隆）。
[0041]
④
菌落pcr验证：用枪头挑取少量细胞分别置于20 μl 20 mm naoh，涡旋混匀，于金属浴95℃孵育20 min。涡旋混匀。取1 μl菌液作为模板进行菌落pcr反应，优选引物为f-416d-seq和r-416d-seq，阳性克隆条带在3054 bp，阴性克隆条带为750 bp。
[0042]
⑤
挑选菌落pcr阳性克隆的菌液送致生工测序部进行测序验证测序引物优选f-416d-seq、f-pgal1-seq、r-tadh1-seq和r-416d-seq，测序正确的菌株进行划线保存和甘油冻存。
[0043]
参照前述
②
~
⑤
构建表达未经突变的cbdas的转化体，主要是将编码seq id no:1所示cbdas的基因片段、插入位点的上游片段和下游片段和pcut 250 ng共同转化入ycan31，经筛选得到wt。
[0044]
（4）应用cbdas
c446a
点突变转化体发酵产cbda将wt、cbdas
c446a
点突变转化体的阳性克隆分别挑取3个单菌落分别接至3 ml ypd培养液（24孔板），30℃，800 rpm培养过夜。第二天测定od，并将菌液稀释于新鲜的发酵培养基3ml ypg(ph 5.5)至od为0.2。间隔24 hr每孔加入333 μm oa，和2%半乳糖。在培养至96h时，经检测，wt、cbdas
c446a
点突变转化体cbda产量分别为61.2，123.1 mg/l（图1）。cbdas
c446a
点突变转化体与野生型重组菌株转化合成cbda的hplc图谱见图2。
[0045]
实施例2 cbdas
n56h
突变体的制备与应用参照实施例1的方法及表1所示引物，构建cbdas
n56h
点突变载体pcev-cbdas
n56h
、转化体，并利用转化体以oa为底物合成cbda。经检测，cbda产量为74.0 mg/l（图1）。
[0046]
实施例3 cbdas
h213d
突变体的制备与应用参照实施例1的方法及表1所示引物，构建cbdas
h213d
点突变载体pcev-cbdas
h213d
、转化体，并利用转化体以oa为底物合成cbda。经检测，cbda产量为73.8 mg/l（图1）。
[0047]
实施例4 cbdas
m256i
突变体的制备与应用参照实施例1的方法及表1所示引物，构建cbdas
m256i
点突变载体pcev-cbdas
m256i
、转化体，并利用转化体以oa为底物合成cbda。经检测，cbda产量为94.6 mg/l（图1）。
[0048]
实施例5 cbdas
m256i,s116a
突变体的制备与应用参照实施例1构建多位点突变体的方法及表1所示引物，构建cbdas
m256i,s116a
点突变载体pcev-cbdas
m256i,s116a
、转化体，并利用转化体以oa为底物合成cbda。经检测，cbda产量为71.1 mg/l（图1）。
[0049]
实施例6 cbdas
q343e
突变体的制备与应用参照实施例1的方法及表1所示引物，构建cbdas
q343e
点突变载体pcev-cbdas
q343e
、转化体，并利用转化体以oa为底物合成cbda。经检测，cbda产量为88.9 mg/l（图1）。
[0050]
实施例7 cbdas
q343e,s116a
突变体的制备与应用参照实施例1构建多位点突变体的方法及表1所示引物，构建cbdas
q343e,s116a
点突变载体pcev-cbdas
q343e,s116a
、转化体，并利用转化体以oa为底物合成cbda。经检测，cbda产量为87.9 mg/l（图1）。
[0051]
实施例8 cbdas
d362a,n365k
突变体的制备与应用
参照实施例1构建多位点突变体的方法及表1所示引物，构建cbdas
d362a,n365k
点突变载体pcev-cbdas
d362a,n365k
、转化体，并利用转化体以oa为底物合成cbda。经检测，cbda产量为111.9 mg/l（图1）。
[0052]
实施例9cbdas
d362a,n365k,s116a
突变体的制备与应用参照实施例1构建多位点突变体的方法及表1所示引物，构建cbdas
d362a,n365k,s116a
点突变载体pcev-cbdas
d362a,n365k,s116a
、转化体，并利用转化体以oa为底物合成cbda。经检测，cbda产量为80.2 mg/l（图1）。
[0053]
实施例10 cbdas
n365k
突变体的制备与应用参照实施例1的方法及表1所示引物，构建cbdas
n365k
点突变载体pcev-cbdas
n365k
、转化体，并利用转化体以oa为底物合成cbda。经检测，cbda产量为106.2 mg/l（图1）。
[0054]
实施例11 cbdas
n365k,s116a
突变体的制备与应用参照实施例1构建多位点突变体的方法及表1所示引物，构建cbdas
n365k,s116a
点突变载体pcev-cbdas
n365k,s116a
、转化体，并利用转化体以oa为底物合成cbda。经检测，cbda产量为79.7 mg/l（图1）。
[0055]
实施例12 cbdas
q398k
突变体的制备与应用参照实施例1的方法及表1所示引物，构建cbdas
q398k
点突变载体pcev-cbdas
q398k
、转化体，并利用转化体以oa为底物合成cbda。经检测，cbda产量为84.3 mg/l（图1）。
[0056]
实施例13cbdas
q398k,s116a
突变体的制备与应用参照实施例1构建多位点突变体的方法及表1所示引物，构建cbdas
q398k,s116a
点突变载体pcev-cbdas
q398k,s116a
、转化体，并利用转化体以oa为底物合成cbda。经检测，cbda产量为90.0 mg/l（图1）。
[0057]
实施例14 cbdas
k474q
突变体的制备与应用参照实施例1的方法及表1所示引物，构建cbdas
k474q
点突变载体pcev-cbdas
k474q
、转化体，并利用转化体以oa为底物合成cbda。经检测，cbda产量为103.7 mg/l（图1）。
[0058]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。