一种细菌外膜囊泡包裹的改性玉米醇溶蛋白纳米载药系统及其制备方法和应用

1.本发明涉及一种仿生天然的生物高分子纳米载体，具体涉及一种细菌外膜囊泡包裹的改性玉米醇溶蛋白纳米载药系统及其制备方法和应用。


背景技术：

2.近年来，人们对用于药物递送系统的蛋白质生物聚合物的关注大大增加。蛋白质具有两亲性，能很好的与药物及溶剂相互作用，是制备纳米载药系统的理想材料之一，在生物医学领域具有巨大的应用前景。使天然蛋白质成为潜在高效纳米载体的关键特征是其天然资源的可用性、固有的生物相容性、生物降解性、无毒性及其生物学功能。玉米醇溶蛋白于1985年被fda列为最安全的生物材料辅料之一，由于其安全性和生物相容性较好，目前广泛应用于药物控释和生物医用给药体系中。玉米醇溶蛋白载药纳米粒子在口服给药后可有效改善药物的吸收。玉米醇溶蛋白的疏水特性使其成为封装疏水药物的良好候选材料，疏水药物可通过疏水、静电和氢键相互作用而包封在纳米粒子中。但玉米醇溶蛋白载药纳米粒子稳定性较差，易于聚集，且存在干燥后再次复溶性差的问题。
3.合成类纳米粒子与人体内源性物质区别较大，通常细胞间相互作用效果较差，不能发挥其应有的优势，甚至可能被视为外源性物质而引起免疫反应，针对这种情况基于内源性蛋白、病原体和细胞的三大类仿生药物递送系统应运而生，其中细胞膜仿生纳米粒子已被广泛应用于药物递送载体的研究中。而当游离药物与细胞膜直接结合时，药物的毒性可能对细胞膜产生影响，导致药物的释放不受控制。因此，常将细胞膜包覆在合成类纳米粒子表面。这样既解决了药物毒性的问题，又兼具合成类纳米粒子的理化性质和细胞膜复杂的生物学功能，可有效降低纳米粒子的免疫原性，提高药物的靶向性，增加药物的体内滞留时间。


技术实现要素：

4.本发明的目的之一在于提供一种细菌外膜囊泡包裹的改性玉米醇溶蛋白纳米载药系统，其粒径分布范围窄，稳定性好，可用于包埋能溶于乙醇的疏水性药物，以增强其在水中的溶解度，提升被包埋成分的稳定性和生物利用度。
5.本发明的目的之二是提供一种细菌外膜囊泡包裹的改性玉米醇溶蛋白纳米载药系统的制备方法。
6.本发明采用的技术方案是：一种细菌外膜囊泡包裹的改性玉米醇溶蛋白纳米载药系统的制备方法，包括如下步骤：
7.1)将药物溶于无水乙醇中，超声使其完全溶解，加入去离子水后，再加入玉米醇溶蛋白，超声5-15min；于所得混合溶液中，在搅拌下迅速加入酪蛋白酸钠溶液，搅拌0.5-1.5h，得改性玉米醇溶蛋白载药纳米粒溶液；
8.2)将细菌外膜囊与步骤1)所得改性玉米醇溶蛋白载药纳米粒溶液混合均匀，所得
混合溶液以高压氮气为挤出压力源，过200nm的聚碳酸酯膜经2-8次挤出，所得产物在4℃下，以6000r/min离心20min，收集沉淀，为细菌外膜囊泡包裹的改性玉米醇溶蛋白纳米载药系统。
9.进一步的，上述的制备方法，步骤1)中，按体积比，无水乙醇:去离子水＝4:1。
10.进一步的，上述的制备方法，步骤1)中，在搅拌速度为10-20r/min下迅速加入酪蛋白酸钠溶液。
11.进一步的，上述的制备方法，步骤1)中，所述超声，频率为80hz。
12.进一步的，上述的制备方法，步骤2)中，所述细菌外膜囊是大肠埃希菌dh5a外膜囊。
13.进一步的，上述的制备方法，步骤2)中，按体积比，细菌外膜囊:改性玉米醇溶蛋白载药纳米粒溶液＝4:1。
14.本发明提供的细菌外膜囊泡包裹的改性玉米醇溶蛋白纳米载药系统作为药物载体的应用。
15.进一步的，所述药物为疏水性药物。
16.更进一步的，所述疏水性药物为能溶于乙醇的疏水性药物。
17.更进一步的，所述疏水性药物为紫杉醇。
18.本发明具有以下有益结果：
19.1、本发明制备的细菌外膜囊泡包裹的改性玉米醇溶蛋白纳米载药系统具有良好的稳定性，粒径在175nm左右。
20.2、本发明制备的细菌外膜囊泡包裹的改性玉米醇溶蛋白纳米载药系统为光滑的球形结构，颗粒大小高度集中，粒径分布范围窄。
21.3、本发明制备的细菌外膜囊泡包裹的改性玉米醇溶蛋白纳米载药系统能抵御部分胃酸的破坏，使药物不会过早的泄露。
22.4、本发明制备的细菌外膜囊泡包裹的改性玉米醇溶蛋白纳米载药系统在人工肠液中没有突释现象，具有良好的缓释特性。
23.5、本发明制备的细菌外膜囊泡包裹的改性玉米醇溶蛋白纳米载药系统，酪蛋白酸钠是酪蛋白的钠盐，无臭无味、安全性较高。它是多种蛋白的可溶性混合物，含有各种疏水基团和亲水基团，是天然的稳定剂和乳化剂。酪蛋白酸钠通过表面吸附提高了玉米醇溶蛋白载药纳米粒子在水中的稳定性和分散性。在制备玉米醇溶蛋白载药纳米粒子的过程中加入适量的酪蛋白酸钠作为稳定剂，使玉米醇溶蛋白载药纳米粒子被酪蛋白酸钠包裹，酪蛋白酸钠提供空间位阻和静电作用，有效提高玉米醇溶蛋白载药纳米粒的稳定性和复溶性。
附图说明
24.图1是细菌外膜囊泡包裹的改性玉米醇溶蛋白纳米载药系统的扫描电镜图。
25.图2是细菌外膜囊泡包裹的改性玉米醇溶蛋白纳米载药系统在pbs缓冲液中48h的粒径及pdi的变化图。
26.图3是细菌外膜囊泡包裹的改性玉米醇溶蛋白纳米载药系统包载的药物在人工胃液中的释放率图。
27.图4是细菌外膜囊泡包裹的改性玉米醇溶蛋白纳米载药系统包载的药物在人工肠
液中的释放率图。
具体实施方式
28.实施例1一种细菌外膜囊泡包裹的改性玉米醇溶蛋白纳米载药系统
29.(一)细菌外膜囊泡包裹的改性玉米醇溶蛋白纳米载药系统，制备方法包括如下步骤：
30.1、制备改性玉米醇溶蛋白载药纳米粒溶液
31.用分析天平精密称取12.5mg酪蛋白酸钠，溶于7ml去离子水中，超声使其完全溶解，得酪蛋白酸钠溶液。
32.用分析天平精密称取3mg紫杉醇溶于1.6ml无水乙醇中，超声使其完全溶解，加入0.4ml去离子水，使乙醇浓度为80％(体积)，然后加入10mg玉米醇溶蛋白，以80hz频率超声7min，得混合溶液。将7ml酪蛋白酸钠溶液迅速倒入转速为15r/min的混合溶液中，搅拌1h，待乙醇挥发后，得利用酪蛋白酸钠改性的负载紫杉醇的改性玉米醇溶蛋白载紫杉醇纳米粒溶液，标记为zine-cas-ptx。
33.2、制备细菌外膜囊泡包裹的改性玉米醇溶蛋白纳米载紫杉醇系统
34.将大肠埃希菌dh5a外膜囊泡与改性玉米醇溶蛋白载紫杉醇纳米粒溶液，按体积比，细菌外膜囊:改性玉米醇溶蛋白载紫杉醇纳米粒溶液＝4:1，混合均匀，然后以高压氮气为挤出压力源，将混合液过200nm的聚碳酸酯膜，经6次挤出，所得产物在4℃下，以6000r/min离心20min，收集底部沉淀，即得细菌外膜囊泡包裹的改性玉米醇溶蛋白纳米载紫杉醇系统，标记为omvs-nps。
35.(三)检测
36.1、omvs-nps形貌的表征
37.采用透射电镜观察omvs-nps纳米粒形态。将omvs-nps纳米粒溶液用移液枪吸取10μl，滴加在碳支撑膜上，待其干燥后，用1％醋酸双氧铀溶液染色后，将样品置于空气中，自然晾干，用透射电子显微镜观察。
38.如图1所示，可以看出omvs包裹后的纳米粒子呈球形结构。omv-nps具有明显的壳核结构，证明omvs成功包裹在zein-cas-ptx纳米粒表面。
39.2、omvs-nps稳定性的考察
40.将omvs-nps放置在4℃冰箱中静置，48h之内测定其粒径及pdi的变化。
41.如图2所示，omvs-nps在pbs缓冲液中粒径及pdi的变化不明显，说明omvs-nps稳定性较好。
42.3、omvs-nps体外释放的考察
43.配置人工胃液及人工肠液，然后各取30ml分别置于50ml离心管中，加入1％十二烷基硫酸钠，使其达到漏槽条件。用移液枪分别吸取2ml zein-cas-ptx纳米粒溶液、omv-nps溶液置于已经处理好的透析袋中(分子量3500da)，再将透析袋置于离心管中。利用摇床法测定释药速率，实验条件为37℃、120rpm，人工胃液组在0.5、1、1.5、2h吸取释放液；人工肠液组在1、2、3、6、8、10、12、24、48h吸取释放液。同时每次取完释放液后，补充同样体积的释放介质。测定释放液的紫外吸收值，代入标准曲线计算出不同取样时间点的ptx浓度，再根据累积释药公式，推算累积释药百分数，并绘制体外释放曲线图。
44.如图3所示，zein-cas-ptx纳米粒子在人工胃液中2h的累积释药量为12.58％，累积释药量较低，说明zein-cas-ptx纳米粒子被胃酸环境侵蚀较弱。这是由于zein是一种疏水蛋白，能保护药物不受酸性环境的影响，阻止药物在胃部释放。omvs-nps在人工胃液中2h的累积释放量为8.89％，低于zein-cas-ptx纳米粒子，说明omvs起到保护作用，能抵御部分胃酸的破坏，使药物不会过早的泄露。
45.如图4所示，zein-cas-ptx纳米粒子在人工肠液中2h的累积释药量为15.87％，累积释药量高于在人工胃液中，说明zein在人工胃液中的稳定性高于人工肠液。zein-cas-ptx纳米粒子在人工肠液中经48h的释放，累积释放量可达到68.97％，且没有突释现象，说明zein-cas-ptx纳米粒子具有良好的缓释特性。omvs-nps在人工肠液中前2h的累积释放量为3.14％，相比于人工胃液，omvs-nps具有更好的稳定性，其在人工肠液中48h的累积释药量为35.84％，均低于zein-cas-ptx纳米粒组，说明omvs的包裹更能增加药物的缓释效果。