氟化聚乙烯亚胺在制备疫苗或预防/治疗病毒/细菌引起的疾病的制剂中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物制剂领域，尤其涉及一种氟化聚乙烯亚胺在制备疫苗或预防/治疗病毒/细菌引起的疾病的制剂中的应用。


背景技术：

2.进入21世纪，随着肿瘤学、免疫学、细胞生物学、生物化学以及分子物学等学科的不断发展和交叉渗透，肿瘤免疫治疗的理论基础和临床研究都取得了迅猛的发展。迄今为止，肿瘤免疫治疗的方法包括肿瘤疫苗，免疫检查点(icb)单抗和细胞免疫治疗等。其中，以嵌合抗原受体(car)t细胞为代表的细胞免疫治疗实现了90％的完全缓解率。以免疫检查点抗体为代表的免疫治疗在黑色素瘤、淋巴瘤、非小细胞肺癌中取得了良好的效果，并被美国食品和药物管理局(fda)批准用于恶性黑色素瘤、肺癌、头颈癌、膀胱癌、肾癌和霍奇金淋巴瘤等多种肿瘤的临床治疗。尽管如此，肿瘤的免疫治疗领域仍然存在许多尚未解决的问题：如免疫治疗缺乏个体化疗效预测靶点；免疫治疗的主力军t淋巴细胞普遍存在活力下降、免疫耐受、功能耗竭等问题；部分患者在使用免疫治疗后出现“假阳性”和“假阳性”等临床相关现象；另外，car-t在杀灭肿瘤细胞的同时，可产生大量的炎性因子，引发细胞因子风暴等危及患者生命的问题，肿瘤免疫治疗法仍有待进一步改善。
3.肿瘤疫苗既能产生新的针对肿瘤细胞的抗原特异性t细胞反应，又能放大现有的反应，肿瘤疫苗可能是免疫检查点抑制疗法的有效联合伙伴。通过选择合适的抗原靶点，肿瘤疫苗可以诱导有效的肿瘤特异性免疫反应，同时将自身免疫降至最低。最近的研究表明，肿瘤新抗原(neoantigen)是act、icb和治疗性疫苗接种的关键靶点。此外，现有的肿瘤疫苗通常需要添加免疫佐剂增强抗原的免疫应答，但实现佐剂和抗原的同时空递送到同一个靶细胞(抗原呈递细胞)内的效率非常低。
4.激活免疫系统以预防和治疗感染和其他疾病的疫苗对人类医疗保健产生了重大影响。几十年来，人们一直在积极追求和研究癌症疫苗，现在市场上有几个成功的例子。然而，到目前为止，预防性癌症疫苗只对病毒相关的癌症有效，例如人类乳头瘤病毒诱导的宫颈癌。provenge(sipuleucel-t)是迄今为止fda批准的唯一治疗型癌症疫苗，其对前列腺癌只有温和的临床治疗效果。与其他免疫疗法，例如免疫检查点阻断治疗法和过继t细胞疗法相比，大多数癌症疫苗未能显示出显著的临床疗效。
5.纳米技术和生物工程领域近些年的发展极大提高了肿瘤免疫治疗的安全性和疗效。与负载抗肿瘤药物靶向肿瘤部位直接杀伤肿瘤细胞不同，纳米生物载体负载免疫活性药物靶向免疫细胞，通过免疫治疗进而发挥抗肿瘤作用。纳米技术在抗肿瘤免疫治疗尤其在肿瘤疫苗领域具有以下优势：由于纳米载体的自身特性及淋巴器官的结构特点，纳米粒子容易富集于淋巴结、脾脏等淋巴器官中；具有靶向性的纳米载体可以将免疫激活药物例如抗原和佐剂递送给抗原呈递细胞；纳米载体可同时负载多种不同药物，在同一时空发挥作用，在抗原呈递、过程中具有无可替代的优势。因此，纳米技术在基于疫苗的抗肿瘤免疫
治疗中具有广阔的应用前景，开发更多的基于纳米技术的疫苗十分必要。虽然一些纳米载体实现了对抗原和佐剂的装载和递送，但也存在一定缺陷：现有的纳米疫苗中，载体具有佐剂功能的纳米材料载体并不是很多。
6.此前，人们发现聚乙烯亚胺(pei)具有刺激免疫反应的佐剂功能。pei可以很显著刺激骨髓来源树突状细胞(bmdc)表面cd86和mhc-ii的表达并在此过程中释放促炎细胞因子tnf-α和il-6。研究者发现，在tlr4敲除的小鼠体内，pei杀伤肿瘤的免疫反应也有所下降。近些年，基于氟化修饰的阳离子高分子(如氟化聚乙烯亚胺)作为蛋白质胞内的递送载体，被应用于高效蛋白质递送。但是，鉴于肿瘤免疫治疗具有更高的要求，目前并未有关于将氟化聚乙烯亚胺(f-pei)用于疫苗递送和免疫佐剂应用的相关报道。


技术实现要素：

7.为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种氟化聚乙烯亚胺在制备疫苗或预防/治疗病毒/细菌引起的疾病的制剂中的应用，为增强疫苗递送效率、增强抗原特异性免疫反应提供一种胞内递送体系，氟化聚乙烯亚胺可同时作为抗原载体并能发挥免疫佐剂的功能。
8.本发明的技术方法如下：
9.本发明公开了氟化聚乙烯亚胺(f-pei)在制备疫苗或预防/治疗病毒/细菌引起的疾病的制剂中的应用，氟化聚乙烯亚胺包括支化聚乙烯亚胺和与所述支化聚乙烯亚胺共价连接的氟化官能团，所述氟化官能团中包括如下结构式的基团(*标记处代表基团连接位点)：
[0010][0011]
其中，n为2-7中的任一整数；
[0012]
x为1-200中的任一整数；
[0013]
所述支化聚乙烯亚胺的分子量为1000-50000道尔顿。优选地，支化聚乙烯亚胺的分子量为1800-25000道尔顿。
[0014]
优选地，氟化聚乙烯亚胺的结构式如下：
[0015][0016]
其中，r为如下结构式的基团(*标记处代表基团连接位点)：
[0017][0018]
其中，n为2-7中的任一整数；
[0019]
x为1-200中的任一整数；
[0020]
m为2-100中的任一整数。
[0021]
优选地，n为2-5中的任一整数；x为1-200中的任一整数；m为2-100中的任一整数。
[0022]
进一步地，当氟化聚乙烯亚胺在制备疫苗时，氟化聚乙烯亚胺用于制备抗原载体和/或免疫佐剂。
[0023]
进一步地，疫苗为抗肿瘤疫苗。
[0024]
进一步地，抗原包括蛋白质、多肽、肿瘤裂解物、dna和rna中的一种或几种。f-pei可以增强抗原呈递细胞对蛋白、多肽、肿瘤裂解物和核酸的摄取和溶酶体逃逸，进一步诱发抗原的mhc-i类型呈递，并激活抗原特异性cd8免疫反应。
[0025]
进一步地，抗原包括肿瘤特异性蛋白、肿瘤新抗原多肽、肿瘤新抗原mrna和肿瘤裂解物中的一种或几种。
[0026]
进一步地，疫苗用于预防/治疗肿瘤，肿瘤为黑色素瘤和/或mc38结肠癌肿瘤。
[0027]
进一步地，疫苗的制备方法包括以下步骤：
[0028]
将氟化聚乙烯亚胺与抗原在水溶液中混合孵育5到30分钟后，得到疫苗。
[0029]
进一步地，抗原为鸡卵清白蛋白(ova)和/或mc38结肠癌肿瘤新抗原mrna中的一种或几种。
[0030]
进一步地，孵育温度为20-30℃。
[0031]
进一步地，当氟化聚乙烯亚胺在制备预防/治疗病毒/细菌引起的疾病的制剂时，氟化聚乙烯亚胺用于制备病毒抗原载体。
[0032]
进一步地，病毒包括hiv、hpv、covid2019和h1n1中的一种或几种。
[0033]
本发明中，“预防/治疗”、“病毒/细菌”中的“/”用于意指“和/或”。
[0034]
本发明中f-pei一方面可以作为各种类型抗原的载体，将抗体直接递送到抗原呈递细胞(apcs)的细胞质中，有利于抗原的呈递(如交叉呈递)；另一方面，f-pei可以诱导抗原呈递细胞apcs的活化，产生免疫佐剂的功能，并诱导产生抗原特异性细胞免疫反应。这种双重功能是一般的免疫佐剂或者载体所不具备的。
[0035]
本发明中f-pei具有较高的表面活性，使其具有优异的自组装能力，并且其疏油疏水的特性使得其生物相容性好、细胞摄入水平高、细胞毒性小。抗原可以与氟化高分子通过疏水相互作用共组装成纳米颗粒。同时氟化功能基团既疏水又疏油的性质提高复合物细胞摄入及内涵体逃逸水平。其生物相容性好的特点使其不易使抗原变性。同时其不易与细胞膜融合也可以产生较小的细胞毒性。所以，f-pei可以提升抗原摄取并促进交叉呈递。
[0036]
当用肿瘤特异性蛋白、肿瘤新抗原多肽、肿瘤新抗原mrna、或肿瘤裂解物作为抗原时，可以基于f-pei获得肿瘤疫苗。该基于f-pei的肿瘤疫苗不仅可以对肿瘤的有一定预防作用，同时作为一种治疗型疫苗有效抑制肿瘤的生长。最终达到提升患者生活质量和生存
率的目的。除肿瘤之外，f-pei还可以用于病毒(例如：hiv、hpv、covid 2019和h1n1)抗原的递送，用于病毒引起的相关疾病的预防和治疗。
[0037]
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
[0038]
(1)本发明公开了f-pei的新用途，其可以增强蛋白质、多肽、肿瘤裂解物以及核酸的胞质递送，促进了蛋白、多肽以及肿瘤裂解物抗原的交叉呈递和核酸抗原的表达。
[0039]
(2)f-pei显著增强了机体的抗原特异性t细胞免疫反应，作为预防型和治疗型疫苗对肿瘤生长很强的抑制作用并延长了小鼠的寿命，同时对于病毒引起的疾病具有预防和治疗作用。
[0040]
(3)将f
13-pei与切除肿瘤的肿瘤裂解物简单混合，即可制备出个性化的抗肿瘤疫苗。在两个皮下肿瘤模型和自发转移的原位肿瘤模型中证明，f
13-pei/mem个体化纳米疫苗联合免疫检查点可以治疗无法完全切除的转移肿瘤。此外，在原位肿瘤模型中，该联合策略具有强大的免疫记忆效应，可以有效地保护治愈的小鼠免受肿瘤的再次攻击。
[0041]
(4)f-pei也可用于核酸疫苗(如mrna疫苗)、多肽疫苗、蛋白疫苗的递送，并可在体内诱发抗原特异性的t细胞免疫反应，可用于制备治疗癌症或预防病毒/细菌引起疾病的制剂。
[0042]
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
[0043]
图1是纳米疫苗的构建过程示意图；
[0044]
图2是不同的基于f-pei的纳米疫苗的透射电镜图；
[0045]
图3图示了f-pei诱导ova特异性免疫反应的实验结果；
[0046]
图4图示了f-pei/ova纳米疫苗对b16-ova黑色素瘤的预防作用的实验结果；
[0047]
图5图示了f-pei/ova纳米疫苗对b16-ova黑色素瘤的治疗作用的实验结果；
[0048]
图6图示了不同实验组对远端肿瘤的治疗效果；
[0049]
图7是不同自发转移肿瘤实验组的小鼠活体发光显像结果；
[0050]
图8是不同自发转移肿瘤实验组的小鼠存活率测试结果；
[0051]
图9图示了不同实验组对自发转移肿瘤的治疗效果；
[0052]
图10图示了不同实验组诱导dc的活化实验结果；
[0053]
图11图示了不同实验组诱导mc38新抗原的特异性免疫反应情况结果；
[0054]
图12图示了不同实验组对mc38肿瘤的治疗效果。
具体实施方式
[0055]
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0056]
实施例1：基于f-pei的纳米疫苗的构建
[0057]
图1是纳米疫苗的构建过程示意图，具体步骤如下：
[0058]
将f-pei与ova在水溶液中室温混合孵育5到30分钟，得到f-pei/ova纳米疫苗
[0059]
具体地，f-pei为f
7-pei或f
13-pei，其结构式如下：
[0060][0061]
其中，r为如下结构式的基团(*标记处代表基团连接位点)：
[0062][0063]
其中，f
7-pei的n为2，f
13-pei的n为5。f
7-pei和f
13-pei中，x为30和27。f
7-pei和f
13-pei中的m为46，即支化聚乙烯亚胺的分子量为25kda。
[0064]
改变f-pei与ova的质量比，制备不同的纳米疫苗。表1是以上所构建的基于f-pei的纳米疫苗的动态光散射结果，从表格中可看出，纳米疫苗的粒径约为160-260nm之间，且粒径较均匀。
[0065]
表1：基于f-pei的纳米疫苗的动态光散射结果
[0066][0067]
图2是纳米疫苗f
7-pei/ova(图2a)和f
13-pei/ova(图2b)的透射电镜图，其中f
7-pei与f
13-pei与ova蛋白质的质量比均为1:1。
[0068]
实施例2：f-pei可以诱导ova特异性t细胞免疫反应
[0069]
免疫评价方案如下：
[0070]
向小鼠注射实施例1制备的纳米疫苗，于注射后第3天、第5天切除淋巴结并在第7天切除脾脏进行免疫评价。
[0071]
由图3a、b、c所示，f
13-pei/ova纳米疫苗能显著诱导体内dc细胞的成熟。并且接种疫苗后的第5天，接种了f
13-pei/ova纳米疫苗的小鼠体内检测出更多诱发抗原交叉呈递的
pei/mem纳米复合物也按照一一对应得原则皮内注射到第5组和第6组手术切除肿瘤小鼠的尾根部。对于第2、4和6组小鼠，在第15天、18天、22天和25天通过尾静脉注射的方式每只小鼠注射20μganti-pd-1抗体。手术切除后，对远端肿瘤每隔两天测量一次肿瘤体积。肿瘤体积按公式：体积＝长
×
宽
×
宽/2。当小鼠远端肿瘤体积长到1500mm3，对小鼠进行安乐死处理。
[0082]
由图6a、b可看出，f
13-pei/mem anti-pd-1的治疗效果明显优于单独使用抗pd-1或mem anti-pd-1实验组。并且经f
13-pei/mem anti-pd-1治疗的6只小鼠中，有4只肿瘤完全消失并存货存活超过60天。以上数据显示这种基于免疫检查点抑制疗法与肿瘤特异性疫苗治疗的联合治疗显著地增强了b16f10黑色素瘤的治疗效果。由图6c、d、e所示，f
13-pei/mem纳米颗粒联合anti-ctla4对ct26肿瘤有最显著的抑制作用，60天内小鼠存活率为50％，明显优于其他对照组。为了确认cd8 t细胞在对远端肿瘤治疗所起的作用，anti-cd8抗体被用来进行了t细胞封闭实验。ct26荷瘤小鼠用f
13-pei/mem疫苗加抗ctla-4进行治疗。分别于第14和19天静脉注射anti-cd8a抗体或单克隆igg(对照)(20μg/只)。由图6f所示，经流式细胞术分析，anti-cd8a抗体或小鼠单克隆igg处理3天后(第17天)，全血中的cd8

t细胞均被anti-cd8a抗体阻断，而cd8

t细胞的百分率在单克隆igg作用下无明显变化。由图6g所示，通过对远端肿瘤体积的测量，注射小鼠单克隆igg对联合治疗的效果没有影响。相反，用anti-cd8a抗体阻断cd8

t细胞后，f
13-pei/mem纳米疫苗联合anti-ctla-4治疗效果却发生了逆转，这表明cd8

t细胞诱导的免疫反应介导了联合治疗的抑癌作用。
[0083]
此外，将表达荧光素酶的4t1肿瘤细胞(4t1-luc)接种到每只balb/c小鼠的乳垫内，建立了自发转移的原位乳腺肿瘤模型。在注射4t1-luc肿瘤细胞10天后，小鼠应发生自发转移，并通过手术切除每只小鼠的原发肿瘤。在进行个性化疫苗接种后1天和4天后，对某些组小鼠通过静脉注射anti-ctla4抗体(15μg/只)。
[0084]
由图7-8所示，为了追踪肿瘤细胞的转移，在第10天后每隔5天进行活体发光显像，与仅接种mem的小鼠相比，f
13-pei/mem免疫可以部分延缓肿瘤的转移。8只小鼠中有2只无瘤生长，并且存活了120天。另一方面，虽然单独的anti-ctla4治疗在抑制肿瘤转移方面似乎不是那么有效，但f
13-pei/mem疫苗联合anti-ctla-4在抑制肿瘤转移方面显示出非常好的的治疗效果。在120天内，这组小鼠的存活率也显著提高到62.5％(8只小鼠存活5只)。上述数据显示了基于氟化聚合物的个体化疫苗联合治疗的巨大前景。图7中实验组(1)-(6)对应图8中编号为(1)-(6)的实验组。
[0085]
由图9a、b所示小鼠在第一次接种4t1-luc肿瘤细胞后存活到120天的f
13-pei/mem anti-ctla-4组的小鼠接种了4t1-luc细胞。实验结果表明，f
13-pei/mem 抗ctla-4组小鼠的免疫记忆效应明显优于f
13-pei/mem组和f
13-pei/mem anti-ctla-4组。本组5只小鼠中有2只肿瘤没有复发并且相对于所有小鼠存活时间均延长。与之形成鲜明对比的是与之年龄相似的对照组小鼠在第120天接种4t1-luc细胞后的28-34天内全部死亡并延长了生存时间。结果表明，f
13-pei/mem疫苗联合anti-ctla-4治疗对再发肿瘤有较强的免疫记忆保护作用。
[0086]
为进一步验证该联合治疗诱导的免疫记忆反应，在第120天采集外周血单个核细胞(pbmc)，检测免疫记忆性cd8

t细胞。记忆性t细胞包括效应记忆性t细胞(t
em
,cd3

cd8

cd62l-cd44

)和中枢记忆性t细胞(tcm，cd3

cd8

cd62l

cd44

)。在与同一病原体的第二次接触后将通过产生tnf-α和ifn-γ提供保护性免疫应答。如图9c、d、e，从流式细胞仪数据中可
以看出，在第120天f
13-pei/mem anti-ctla-4组存活的小鼠外周血单核细胞的cd8

t细胞中t
em
细胞和t
cm
细胞的比例都比对照组要高。如图9f、g，在接种4t1-luc肿瘤细胞一周后，f
13-pei/mem组小鼠血清中tnf-α和ifn-γ浓度均显著升高。以上数据有力地证明了f
13-pei/mem疫苗联合anti-ctla-4抗体能增强免疫记忆效应并有效地防止肿瘤治疗后的复发。
[0087]
dc细胞成熟是抗原呈递和后续介导t细胞免疫应答的关键步骤dc细胞表面共刺激分子(例如cd86、cd40和mhc-ii)的上调可被认为是dc细胞成熟的指标。将106/ml成熟率为20％左右的(cd86

cd80

/cd11c

(％))bmdc接种于表面未经处理的24孔培养皿中，分别与ova(10mg/ml)、不同f-pei:mrna质量比孵育培养24小时后，f
13-3
pei
1.8k
的f-pei/mova纳米复合物刺激产生cd86

、cd40

和mhc-ii

bmdc的比例最高，并诱发产生更多il-12(图10)。
[0088]
实施例6：
[0089]
构建了基于f-pei的表达mc38结肠癌肿瘤新抗原的mrna疫苗，方法如下：
[0090]
选取mc38新抗原进行研究。将reps1、dpagt1和adpgk的突变基因的mrna序列插入到构建的mrna的基因表达区域，并将于f
13-3
pei
1.8k
进行共混后构建成f-pei/mrna纳米疫苗。其中，f
13-3
pei
1.8k
的结构式如下：
[0091][0092]
其中，r为如下结构式的基团(*标记处代表基团连接位点)：
[0093][0094]
其中，n为6，x为8，m为3，即支化聚乙烯亚胺的分子量为1.8kda。
[0095]
通过elisot实验法检测到，由图11所示，f
13-3
pei
1.8k
/mrna相比于mrna免疫过后的小鼠的脾淋巴细胞诱导产生了最多的分泌ifn-γ的淋巴细胞。由图12所示，图12b、c、d、e分别是空白对照组、anti-pd-1、f
13-3
pei
1.8k
/mrna、f
13-3
pei
1.8k
/mrna anti-pd1的实验结果，结果表明注射了f-pei/mrna纳米疫苗对小鼠接种mc38的肿瘤有显著的抑制作用，同时联用anti-pd1后，抑制效果明显增强。
[0096]
以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。