尿石素和免疫疗法治疗的组合的制作方法

尿石素和免疫疗法治疗的组合
发明领域
1.本发明涉及尿石素和治疗剂组合，特别是尿石素和免疫疗法治疗(如pd-1拮抗剂等免疫检查点阻断疗法)组合。本发明还涉及包含所述组合的药物合成物、所述药物合成物的制备工艺以及使用所述合成物治疗疾病的方法。


背景技术：

2.拟采用尿石素治疗与线粒体活性不足有关的各种病症，包括肥胖症、代谢率降低、代谢综合征、糖尿病、心血管疾病、高脂血症、神经退行性疾病、认知障碍、情绪障碍、应激、焦虑障碍；用于体重管理，或改善肌肉表现或精神表现。参见wo2012/088519(艾美珍第斯股份公司)。在wo2007/127263(加州大学校董会)中，对使用尿石素治疗各种肿瘤性疾病进行了描述。
3.国际专利出版物wo2014/004902(源于申请pct/us2013/48310)公开了一种增加细胞自噬(具体包括线粒体自噬)的方法，包括使细胞接触有效量的尿石素或其可药用盐，从而增加细胞自噬(具体包括线粒体自噬)。可向患有以下疾病或病症的受试者给药：代谢应激、心血管疾病、内皮细胞功能障碍、肌肉减少症、肌肉退行性疾病、杜氏肌营养不良症、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、药物性肝损伤或肌肉损伤、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、缺血/再灌注损伤、炎症、皮肤老化、炎症性肠病、克罗恩病、肥胖症、代谢综合征、ii型糖尿病、高脂血症、骨关节炎、神经退行性疾病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化症、年龄相关性黄斑变性、线粒体疾病(包括发育不良、肌肉协调性丧失、肌无力、视力问题、听力问题、心脏病、肝病、肾病、胃肠疾病、呼吸系统疾病、神经问题、自主神经功能障碍(有时为学习障碍)和痴呆(由线粒体疾病导致)、肌肉疾病；癌症、认知障碍、应激和情绪障碍。
4.由共刺激和共抑制配体和受体网络紧密控制免疫系统。这些分子为t细胞活化提供第二信号，并提供平衡的正负信号网络，从而最大限度增加抗感染免疫应答，同时限制对自身的免疫力(wang等人(epub，2011年3月7日)，《实验医学杂志》，208(3):577-92；lepenies等人(2008年)，《内分泌、代谢和免疫紊乱-药物靶点》，8:279-288)。共刺激信号示例包括抗原呈递细胞(apc)的b7.1(cd80)和b7.2(cd86)配体与cd4 t淋巴细胞的cd28和ctla-4受体之间的结合(sharpe等人(2002年)，《自然综述-免疫学》，2:116-126；lindley等人(2009年)，《免疫学综述》，229:307-321)。b7.1或b7.2与cd28结合会刺激t细胞活化，而b7.1或b7.2与ctla-4结合会抑制此类活化(dong等人(2003年)，《免疫学研究》，28(l):39-48；greenwald等人(2005年)，《免疫学年评》，23:515-548)。cd28在t细胞表面进行结构性表达(gross等人(1992年)，《免疫学杂志》，149:380-388)，而ctla-4表达在t细胞活化后快速上调(linsley等人(1996年)，《免疫》，4:535-543)。
5.cd28受体的其他配体包括一组相关b7分子，也称为“b7超家族”(coyle等人(2001年)，《自然-免疫学》，2(3):203-209；sharpe等人(2002年)，《自然综述-免疫学》，2:116-126；collins等人(2005年)，《基因组生物学》，6:223.1-223.7；korman等人(2007年)，见上文)。已知b7超家族的多个成员，包括b7.1(cd80)、b7.2(cd86)、可诱导共刺激分子配体
(icos-l)、程序性死亡配体1(pd-l1；b7-h1)、程序性死亡配体2(pd-l2；b7-dc)、b7-h3、b7-h4和b7-h6(collins等人(2005年)，见上文)。
6.程序性死亡1(pd-1)蛋白是t细胞调控因子扩展cd28/ctla-4家族的抑制成员(okazaki等人(2002年)，《免疫学当前观点》，14:391779-82；bennett等人(2003年)，《免疫学杂志》，170:711-8)。cd28家族的其他成员包括cd28、ctla-4、icos和btla。建议pd-1为单体，缺少其他cd28家族成员的未配对半胱氨酸残基特性。在活化b细胞、t细胞和单核细胞上表达pd-1。
7.pd-1基因对55kda i型跨膜蛋白进行编码(agata等人(1996年)，《国际免疫学》，8:765-72)。虽然pd-1在结构上与ctla-4类似，但缺少对b7-1和b7-2结合至关重要的myppy基序。已确定pd-1的两个配体pd l1(b7-h1)和pd-l2(b7-dc)，在与pd-1结合后，可下调t细胞活化水平(freeman等人(2000年)，《实验医学杂志》，192:1027-34；carter等人(2002年)，《欧洲免疫学杂志》，32:634-43)。pd-l1和pd-l2为b7同系物，可与pd-1结合，但不与其他cd28家族成员结合。在人类癌症中大量存在pd-l1(dong等人(2002年)，《自然-医学》，8:787-9)。
8.pd-1被称为免疫抑制蛋白，可负向调节tcr信号(ishida,y.等人(1992年)，《embo杂志》，11:3887-3895；blank,c.等人(epub，2006年12月29日)，《免疫学与免疫疗法》56(5):739-745)。pd-1与pd-l1之间的相互作用可作为免疫检查点，会导致肿瘤浸润淋巴细胞减少、t细胞受体介导增殖减少和/或癌细胞免疫逃避(dong等人(2003年)，《分子医学杂志》，81:281-7；blank等人(2005年)，《癌症免疫学与免疫疗法》，54:307-314；konishi等人(2004年)，《临床癌症研究》，10:5094-100)。通过抑制pd-1与pd-l1或pd-l2的局部相互作用，可逆转免疫抑制；当pd-1与pd-l2的相互作用阻断时，会产生加性作用(iwai等人(2002年)，《美国国家科学院院刊》，99:12293-7；brown等人(2003年)，《免疫学杂志》，170:1257-66)。
9.免疫学检查点的抗体抑制剂(包括pd-1和pd-l1)在各种实体瘤患者中具有显著的抗肿瘤活性，毒性比普遍的免疫激活剂(如il-2和ifn-a)小。两个靶向pd-1的单克隆抗体派姆单抗和纳武单抗在黑色素瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、三阴性乳腺癌(tnbc)和其他实体瘤中具有显著的单一药剂活性(topalian等人(2012年)，《新英格兰医学杂志》，366:2443-54；hamid等人(2013年)，《新英格兰医学杂志》，369:134-44；topalian等人(2014年)，《临床肿瘤学杂志》，32:1020-31；seiwert等人(2014年)，《临床肿瘤学杂志》，(会议摘要)，32(15s):6011；powles等人(2014年)，《自然》，515:558-62；garon等人(2015年)，《新英格兰医学杂志》，372:2018-28；moreno和ribas(2015年)，《英国癌症杂志》，112:1421-7；robert等人(2015年)，《新英格兰医学杂志》，372:320-30)。在先前经治疗的不可切除黑色素瘤患者中，对派姆单抗和纳武单抗的反应率分别为34％和31％；无进展生存期分别为50周和9.7个月(ribas等人(2014年)，《临床肿瘤学杂志》，(会议摘要)，32(15s):lba9000；topalian等人(2014年)，见上文)。在先前未经治疗的晚期非小细胞肺癌患者中，对派姆单抗和纳武单抗的反应率分别为26％和30％(rizvi等人(2014年)，《临床肿瘤学杂志》，(会议摘要)，32(15s):8007；gettinger等人(2014年)，《临床肿瘤学杂志》，(会议摘要)，32(15s):8024)。尽管在一些患者中具有显著活性，从以上详述的反应率中可以看出，经单一药剂抗pd-1免疫疗法治疗的大多数患者并未从治疗中获益。
10.人们认为，可增强抗肿瘤免疫反应的治疗方法在与其他药剂联合使用时更有效。
令人惊奇的是，我们发现，尿石素可显著增强免疫疗法治疗(例如，pd-1拮抗剂)的疗效。


技术实现要素：

11.根据本发明的第一个方面，提供了一种尿石素和免疫疗法治疗组合，用于治疗t细胞活化抑制相关的疾病。
12.根据本发明的另一个方面，提供了一种尿石素和免疫检查点阻断疗法组合，用于治疗t细胞活化抑制相关的疾病。
13.根据本发明的另一个方面，提供了一种尿石素和免疫疗法治疗组合，用于生产治疗t细胞活化抑制相关疾病的药物。
14.根据本发明的另一个方面，提供了一种尿石素和免疫检查点阻断疗法组合，用于生产治疗t细胞活化抑制相关疾病的药物。
15.根据本发明的另一个方面，提供了使用尿石素和免疫疗法治疗组合治疗t细胞活化抑制相关疾病的方法。
16.根据本发明的另一个方面，提供了使用尿石素和免疫检查点阻断疗法组合治疗t细胞活化抑制相关疾病的方法。
17.根据本发明的另一个方面，提供了一种尿石素和免疫抑制蛋白(如pd-1或pd-l1)调节用药剂组合，用于治疗t细胞活化抑制相关的疾病。
18.根据本发明的另一个方面，提供了一种尿石素和免疫抑制蛋白(如pd-1或pd-l1)调节用药剂组合，用于生产治疗t细胞活化抑制相关疾病的药物。
19.根据本发明的另一个方面，提供了使用尿石素和免疫抑制蛋白(如pd-1或pd-l1)调节用药剂组合治疗t细胞活化抑制相关疾病的方法。
20.可单独、按顺序或同时施用本发明所述的化合物或化合物和治疗。
21.根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗用尿石素和免疫疗法治疗组合。
22.根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗用尿石素和免疫检查点阻断疗法组合。
23.根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗用尿石素和免疫抑制蛋白调节用药剂组合。
24.根据本发明的另一个方面，提供了一种合成物，例如，一种药物合成物，包含治疗用尿石素和免疫疗法治疗组合。
25.根据本发明的另一个方面，提供了一种合成物，例如，一种药物合成物，包含治疗用尿石素和免疫检查点阻断疗法组合。
26.根据本发明的另一个方面，提供了一种合成物，例如，一种药物合成物，包含治疗用尿石素和免疫抑制蛋白调节用药剂组合。
27.根据本发明的另一个方面，提供了一种尿石素和免疫疗法治疗组合。
28.根据本发明的另一个方面，提供了一种尿石素和免疫检查点阻断疗法组合。
29.根据本发明的另一个方面，提供了一种尿石素和免疫抑制蛋白调节用药剂组合。
30.根据本发明的另一个方面，提供了一种合成物，例如，一种药物合成物，包含尿石素和免疫疗法治疗组合。
31.根据本发明的另一个方面，提供了一种合成物，例如，一种药物合成物，包含尿石
素和免疫检查点阻断疗法组合。
32.根据本发明的另一个方面，提供了一种合成物，例如，一种药物合成物，包含尿石素和免疫抑制蛋白调节用药剂组合。
33.在一个实施例中，所述免疫检查点阻断疗法选自：pd-1拮抗剂、抗ctla4疗法、cd28拮抗剂、b7配体拮抗剂(例如，b7-1(cd80)或b7-2(cd86)的拮抗剂)、cd27拮抗剂、cd40拮抗剂、cd40配体、ox40拮抗剂、gitr拮抗剂、cd137拮抗剂和/或41-bb-1拮抗剂。
34.在一个实施例中，所述免疫检查点阻断疗法选自：pd-1拮抗剂、抗ctla4疗法、cd28拮抗剂和/或b7配体拮抗剂(例如，b7-1(cd80)、b7-2(cd86)的拮抗剂)、cd27拮抗剂、cd40拮抗剂、cd40配体、ox40拮抗剂、gitr拮抗剂、cd137拮抗剂和/或41-bb-i拮抗剂。
35.在另一个实施例中，所述pd-1拮抗剂为抗pd-1抗体或其功能部分。抗pd-1抗体的示例包括派姆单抗、纳武单抗(bms-936558)、西米普利单抗和匹地利珠单抗。
36.在另一个实施例中，所述pd-1拮抗剂为抗pd-l1抗体或其功能部分。抗pd-l1抗体的示例包括阿维鲁单抗、阿特珠单抗(mpdl3280a)和德瓦鲁单抗。
37.在另一个实施例中，所述pd-1拮抗剂为融合蛋白，如amp-224(一种重组b7-dc fc融合蛋白，由pd-1配体程序性细胞死亡配体2(pd-l2，b7-dc)的胞外结构域和人免疫球蛋白(ig)g1的fc区组成)。
38.在另一个实施例中，所述免疫检查点阻断疗法为抗ctla4疗法。抗ctla4疗法示例包括：伊匹单抗和替西木单抗。
39.本发明所述的组合用于治疗各种疾病，其中，在过程中会出现阻断，从而导致t细胞活化。此类疾病的示例包括癌症和传染病。
40.适当的癌症示例包括：实体瘤，包括hiv相关转移性实体瘤。
41.适当的癌症示例包括：膀胱癌、b细胞淋巴瘤(如霍奇金淋巴瘤、t细胞淋巴瘤)、t细胞急性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、红白血病、三阴性乳腺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤(包括小儿黑色素瘤)、肺癌(如鳞状细胞肺癌和非小细胞肺癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、结直肠癌、头颈癌(如头颈鳞状细胞癌)、宫颈癌、前列腺癌、肝癌、口腔鳞状细胞癌、皮肤癌、髓母细胞瘤、肝细胞癌、肝内和肝外胆管癌、硬纤维瘤、软组织肉瘤、腺样囊性癌、尿路上皮癌、肾癌、肝细胞癌、皮肤癌(如默克尔细胞癌)、胃癌和胃食管癌。
42.在一个实施例中，所述癌症为结直肠癌。
43.在一个实施例中，适当的癌症为高度微卫星不稳定型(msi-h)或错配修复缺陷型(dmmr)实体瘤。
44.传染病示例包括：病毒、细菌、真菌和寄生虫感染。
45.病毒感染示例包括：淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)、hiv、乙肝病毒(hbv)或丙肝病毒(hcv)。
46.细菌感染示例包括：幽门螺杆菌、结核杆菌(mtb)、败血症(革兰氏阳性菌，如葡萄球菌)和医院感染(医院获得性感染，如艰难梭菌)。
47.寄生虫感染示例包括：蠕虫寄生虫(包括曼氏血吸虫、日本血吸虫、埃及血吸虫、肝片吸虫和多形螺旋线虫)、利什曼原虫(如杜氏利什曼原虫、恰氏利什曼原虫和墨西哥利什曼原虫)、疟原虫(如伯氏疟原虫和恶性疟原虫)、弓形虫(如刚地弓形虫)。
48.真菌感染示例包括：念珠菌病、曲霉病和隐球菌病。
49.传染病示例包括但不限于hiv、肝炎(甲肝、乙肝、丙肝)、流感、疱疹、贾第鞭毛虫、疟疾、利什曼原虫、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。
50.其他疗法/联合疗法
51.本发明所述的组合可与其他疗法(如放疗)和/或一种或多种治疗剂联合施用。
52.在某些实施例中，所述合成物进一步包含一种或多种治疗剂，包括抗癌剂、抗病毒剂、抗炎剂和/或佐剂。
53.在一个实施例中，所述其他疗法为放疗。
54.在一种模式中，所述放疗为分割放疗。在一个实施例中，所述分割放疗包括2-7次。在另一个实施例中，所述分割放疗包括3-6次。在另一个实施例中，所述分割放疗包括4-5次。在一种模式中，所述分割放疗包括2、3、4、5、6或7次。在一个实施例中，所述分割放疗包括5次。
55.在一种模式中，在连续几天内进行所述放疗分次。在一种模式中，放疗可包括一天多次的剂量和/或连续几天的剂量。在一种模式中，在第1天、第2天、第3天、第4天和第5天进行所述放疗分次。在另一种模式中，所述放疗包括约10gy，分5次进行(即，在5天内，每天2gy)。
56.还可采用其他分割计划，包括加速分割(以更大的日剂量或周剂量进行治疗，缩短治疗周数)、超分割(每天多次进行小剂量放射治疗)或低分割(以每天一次或更低的频率进行大剂量放射治疗，减少治疗次数)。
57.所述放疗可为x射线、伽马射线或带电粒子。所述放疗可为外照射放疗或内照射放疗(也称为近距离放疗)。还可使用放射性物质(如放射性碘)进行全身放疗。
58.外照射放疗包括三维构象放疗、调强放疗、图像引导放疗、断层放疗、立体定向放射外科治疗、质子疗法或其他带电粒子束。
59.在另一个实施例中，所述一种或多种治疗剂包括但不限于小分子、合成药物、肽(包括环状肽)、多肽、蛋白、核酸(例如，dna和rna核苷酸，包括但不限于反义核苷酸序列、三螺旋、rnai以及对生物活性蛋白、多肽或肽进行编码的核苷酸序列)、抗体、合成或天然无机分子、模拟剂以及合成或天然有机分子。
60.此类治疗剂的特定示例包括但不限于免疫调节剂(例如，干扰素)、抗炎剂(例如，肾上腺皮质激素、皮质类固醇(例如，倍氯米松、布地奈德、氟尼缩松、氟替卡松、曲安奈德、甲基强的松龙、强的松龙、强的松、氢化可的松)、糖皮质激素、类固醇和非甾体抗炎药(例如，阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸和cox-2抑制剂)、止痛药、白三烯拮抗剂(例如，孟鲁司特、甲基黄嘌呤、扎鲁司特和齐留通)、β2受体激动剂(例如，沙丁胺醇、biterol、非诺特罗、isoetharie、奥西那林、吡布特罗、沙丁胺醇、特布他林福莫特罗、沙美特罗和沙丁胺醇特布他林)、抗胆碱能剂(例如，异丙托溴铵和氧托溴铵)、柳氮磺胺吡啶、青霉胺、氨苯砜、抗组胺剂、抗疟疾剂(例如，羟氯喹)、抗病毒剂(例如，核苷类似物(例如，瑞德西韦、齐多夫定、阿昔洛韦、更昔洛韦、阿糖腺苷、碘苷、曲氟尿苷和利巴韦林)、可耐、金刚烷胺、金刚烷乙胺、沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦和azt)和抗生素(例如，更生霉素(原名：放线菌素)、博来霉素、红霉素、青霉素、光神霉素和氨茴霉素(amc))。
61.已知有用或已用于或目前正用于治疗t细胞活化抑制相关疾病的任何疗法可与本
发明所述的组合结合使用。有关已用于或正用于治疗t细胞活化抑制相关疾病的各种疗法(例如，预防剂或治疗剂)的信息，参见gilman等人，《古德曼
·
吉尔曼治疗学的药理学基础》，第13版，麦格劳-希尔公司(纽约)，2017年；《默克诊断与治疗手册》，robert s.porter,m.d.等人(编辑)，第20版，默沙东研究实验室(新泽西州拉威)，2018年；《西氏内科学》，第25版，goldman和schafer(编辑)，elsevier，2015年，以及《医生桌上参考手册》(第71版，2016年)。
62.除本发明所述的组合之外，可使用的一种或多种其他疗法的非限制性示例包括免疫调节剂(包括但不限于化疗剂和非化疗免疫调节剂)。化疗剂的非限制性示例包括甲氨蝶呤、环孢素a、来氟米特、顺铂、异环磷酰胺、紫杉醇类(如紫杉醇)、拓扑异构酶i抑制剂(例如，cpt-11、拓扑替康、9-ac和gg-211)、吉西他滨、长春瑞滨、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶(5-fu)、亚叶酸、替莫唑胺、细胞松弛素b、短杆菌肽d、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素d、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素同系物以及环磷酰胺。
63.尿石素
64.尿石素是一种代谢产物，通过哺乳动物(包括人类)肠道菌群对鞣花丹宁和鞣花酸的作用产生。鞣花丹宁和鞣花酸均为化合物，普遍存在于石榴、坚果和浆果等食物中。鞣花丹宁和鞣花酸本身在肠道中的吸收极差。尿石素是一类具有如下所示代表结构(i)的化合物。参照结构(i)，下表1对一些特别常见的尿石素结构进行了说明。
65.[0066][0067]
实际上，对于商业规模的产品，很方便合成尿石素。例如，wo 2014/004902、wo 2015/100213和wo 2019/168972对合成路线进行了说明。
[0068]
具有与结构(i)相符的任何结构的尿石素均可用于本发明所述的组合。
[0069]
在本发明所述组合的一个方面，适当的化合物为采用化学式(i)的化合物，其中，a、c、d和z独立选自：h和oh，b、w、x和y均为h，优选地，a、c、d和z中的至少一个为oh。
[0070]
特别适当的化合物为天然尿石素。因此，z优选为oh，w、x和y均优选为h。当w、x和y均为h，a和b均为h，c、d和z均为oh时，所述化合物为尿石素c。当w、x和y均为h，a、b和c均为h，d和z均为oh时，所述化合物为尿石素a。优选地，用于本发明所述方法的尿石素为尿石素a、尿石素b、尿石素c或尿石素d。更优选地，所用尿石素为尿石素a。
[0071][0072]
根据一个实施例，提供了本发明所述的一种组合，其中，采用化学式(i)的化合物为尿石素a。
[0073]
根据一个实施例，提供了本发明所述的一种组合，其中，采用化学式(i)的化合物为尿石素b。
[0074]
根据一个实施例，提供了本发明所述的一种组合，其中，采用化学式(i)的化合物为尿石素c。
[0075]
根据一个实施例，提供了本发明所述的一种组合，其中，采用化学式(i)的化合物为尿石素d。
[0076]
在一个实施例中，尿石素不包括酰化尿石素或可选取代酰化尿石素(例如，酰化尿
石素a、酰化尿石素b、酰化尿石素c、酰化尿石素d、酰化尿石素e或酰化尿石素m5)；或至少一个羟基被含脂肪酸基团取代的尿石素c。在本发明中，术语“酰基”表示化学式-c(0)-r的化学取代基，式中，r为烷基、烯基、芳基、芳烷基、环烷基、杂环基、杂环烷基、杂芳基或杂芳烷基。可选取代酰基是一种每个基团r发生可选取代(如本发明所述)的酰基。酰基示例包括脂肪酸酰基(例如，短链脂肪酸酰基(例如，乙酰基))和苯甲酰基。
[0077]
本发明还包括使用采用化学式(i)的化合物的适当盐，例如，可药用盐。本发明所述的适当盐包括使用有机或无机碱形成的盐。可药用碱盐包括铵盐、碱金属盐(例如，钾盐和钠盐)、碱土金属盐(例如，钙盐和镁盐)以及有机碱盐(例如，二环己胺、n-甲基-d-葡糖胺、吗啉、硫代吗啉、哌啶、吡咯烷、单、二或三低级烷基胺(例如，乙基、叔丁基、二乙基、二异丙基、三乙基、三丁基或二甲基丙胺)或单、二或三羟基低级烷基胺(例如，单、二或三乙醇胺))。
[0078]
免疫疗法治疗
[0079]
适用于本发明所述组合的免疫疗法治疗包括其作用机制部分或主要通过增强个体免疫应答起作用的任何治疗，例如，免疫检查点阻断疗法(如抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla4抗体或融合蛋白)、新辅助免疫疗法和car-t免疫疗法(嵌合抗原受体t细胞疗法)。
[0080]
抗pd-1抗体
[0081]
pd-1是一种由活化t细胞和b细胞表达的关键免疫检查点受体，可介导免疫抑制。pd-1是cd28受体家族的成员，所述cd28受体家族包括cd28、ctla-4、icos、pd-1和btla。已识别pd-1的两个细胞表面糖蛋白配体，即程序性死亡配体1(pd-l1)和程序性死亡配体2(pd-l2)，它们在抗原呈递细胞上以及许多人类癌症中进行表达，在与pd-1结合后，可下调t细胞活化和细胞因子分泌水平。pd-1/pd-l1相互作用抑制在临床前模型中介导较强的抗肿瘤活性。
[0082]
第8,008,449号和第8,779,105号美国专利公开了以高亲和力与pd-1特异性结合的人单克隆抗体(humab)。第6,808,710号、第7,488,802号、第8,168,757号和第8,354,509号美国专利以及第wo 2012/145493号pct出版物对其他抗pd-1mab进行了说明。第8,008,449号美国专利中所公开的每个抗pd-1humab具有以下一种或多种特性：
[0083]
(a)以小于等于1
×
10-7
m的kd(使用biacore生物传感器系统，通过表面等离子体共振确定)与人pd-1结合；
[0084]
(b)基本上不与人cd28、ctla-4或icos结合；
[0085]
(c)在混合淋巴细胞反应(mlr)检测中促进t细胞增殖；
[0086]
(d)在mlr检测中促进干扰素-γ产生；
[0087]
(e)在mlr检测中促进il-2分泌；
[0088]
(f)与人pd-1和食蟹猕猴pd-1结合；
[0089]
(g)抑制pd-l1和/或pd-l2与pd-1的结合；
[0090]
(h)刺激抗原特异性记忆应答；
[0091]
(i)刺激抗体应答；以及
[0092]
(j)在体内抑制肿瘤细胞生长。
[0093]
适用于本发明所述组合的抗pd-1抗体包括与人pd-1特异性结合并具有上述至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或至少五种特性的mab。在一个实施例中，所述抗pd-1
抗体为纳武单抗。纳武单抗(也称为原名：5c4、bms-936558、mdx-1106或ono-4538)是一种全人igg4(s228p)pd-1免疫检查点抑制剂抗体，可选择性防止与pd-1配体(pd-l1和pd-l2)发生相互作用，从而阻断抗肿瘤t细胞功能下调(第8,008,449号美国专利；wang等人，《癌症免疫学研究》，2(9):846-56(2014年))。在另一个实施例中，所述抗pd-1抗体或其片段与纳武单抗进行交叉竞争。在另一个实施例中，所述抗pd-1抗体或其片段与纳武单抗的结合表位相同。在某些实施例中，所述抗pd-1抗体的cdr与纳武单抗的cdr相同。
[0094]
在另一个实施例中，所述抗pd-1抗体或其片段与派姆单抗进行交叉竞争。在某些实施例中，所述抗pd-1抗体或其片段与派姆单抗的结合表位相同。在某些实施例中，所述抗pd-1抗体的cdr与派姆单抗的cdr相同。在另一个实施例中，所述抗pd-1抗体为派姆单抗。派姆单抗(也称为兰洛利珠单抗和mk-3475)是一种靶向人细胞表面受体pd-1(程序性死亡1或程序性细胞死亡1)的人源化单抗igg4抗体。第8,354,509号和第8,900,587号美国专利对派姆单抗进行了说明；另参见http://www.cancer.gov/drugdictionary？cdrid＝695789(最后一次访问：2019年7月29日)。派姆单抗经fda批准用于治疗复发性或难治性黑色素瘤。在其他实施例中，所述抗pd-1抗体或其片段与medi0608进行交叉竞争。在其他实施例中，所述抗pd-1抗体或其片段与medi0608的结合表位相同。在某些实施例中，所述抗pd-1抗体包含与medi0608相同的cdr。在其他实施例中，所述抗pd-1抗体为medi0608(原名：amp-514)，是一种单克隆抗体。第8,609,089b2号美国专利或https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-drug/def/anti-pd-1-monoclonal-antibody-medi0680(最后一次访问：2019年7月29日)对medi0608进行了说明。
[0095]
在某些实施例中，所述第一抗体为抗pd-1拮抗剂。所述抗pd-1拮抗剂的一个示例为amp-224，是一种b7-dc fc融合蛋白。第2013/0017199号美国出版物或http://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-drug？cdrid＝700595(最后一次访问：2019年7月29日)对amp-224进行了说明。
[0096]
在其他实施例中，所述抗pd-1抗体或其片段与bgb-a317进行交叉竞争。在某些实施例中，所述抗pd-1抗体或其片段与bgb-a317的结合表位相同。在某些实施例中，所述抗pd-1抗体包含与bgb-a317相同的cdr。在某些实施例中，所述抗pd-1抗体为bgb-a317，是一种人源化单克隆抗体。第2015/0079109号美国出版物对bgb-a317进行了说明。
[0097]
在某些实施例中，所述抗体为匹地利珠单抗(ct-011)，据报告，此抗体可与pd-1结合，但与不同靶点结合。第8,686,119b2号美国专利或wo 2013/014668 a1对匹地利珠单抗进行了说明。
[0098]
适用于本发明所述组合的抗pd-1抗体还包括分离抗体，所述分离抗体与人pd-1特异性结合，并与纳武单抗进行交叉竞争，从而与人pd-1结合(参见第8,008,449号和8,779,105号美国专利；wo 2013/173223)。抗体交叉竞争从而与抗原结合的能力表明，这些抗体与抗原的同一表位区结合，并对其他交叉竞争抗体与所述特定表位区的结合产生空间位阻效应。由于均与pd-1的同一表位区结合，预计这些交叉竞争抗体的功能特性与纳武单抗的功能特性非常相似。在biacore分析、elisa检测或流式细胞术等标准pd-1结合检测中中，根据其与纳武单抗的交叉竞争能力，很容易识别交叉竞争抗体(参见wo 2013/173223)。
[0099]
在某些实施例中，与纳武单抗进行交叉竞争从而与人pd-1结合或与纳武单抗结合人pd-1同一表位区的抗体为mab。向人类受试者给药时，这些交叉竞争抗体可为嵌合抗体、
人源化抗体或人抗体。可通过本领域众所周知的方法制备和分离此类嵌合、人源化或人mab。适用于本发明所述合成物的抗pd-1抗体还包括上述抗体的抗原结合部分。结果充分表明，可由全长抗体的片段执行抗体的抗原结合功能。抗体的“抗原结合部分”内所包含的结合片段示例包括：
[0100]
(i)fab片段，一种由v
l
、vh、c
l
和c
h1
结构域组成的单价片段；
[0101]
(ii)f(ab’)2片段，一种包含两个fab片段(在铰链区由二硫键连接)的二价片段；
[0102]
(iii)由vh和c
h1
结构域组成的fd片段；以及
[0103]
(iv)由抗体单臂的v
l
和vh结构域组成的fv片段。
[0104]
适用于所公开合成物的抗pd-1抗体为以高特异性和亲和力与pd-1结合、阻断pd-l1和/或pd-l2的结合并抑制pd-1信号通路免疫抑制作用的抗体。在本发明所公开的任何合成物或方法中，抗pd-1抗体包括与pd-1受体结合并在抑制配体结合和上调免疫系统方面的功能特性与全抗体相似的抗原结合部分或片段。在某些实施例中，所述抗pd-1抗体或其抗原结合部分与纳武单抗进行交叉竞争，从而与人pd-1结合。在某些实施例中，所述抗pd-1抗体或其抗原结合部分为嵌合抗体、人源化抗体或人单克隆抗体或其部分。在某些实施例中，所述抗体为人源化抗体。在其他实施例中，所述抗体为人抗体。可使用igg1、igg2、igg3或igg4同种型抗体。在某些实施例中，所述抗pd-1抗体或其抗原结合部分包含一个重链恒定区，所述重链恒定区为人igg1或igg4同种型。在某些其他实施例中，抗pd-1抗体或其抗原结合部分的igg4重链恒定区序列包含s228p突变，即，用常见于igg1同种型抗体相应位置的脯氨酸残基代替铰链区中的丝氨酸残基。这种突变存在于纳武单抗中，可防止fab臂与内源性igg4抗体交换，同时保留低亲和力，以活化与野生型igg4抗体有关的fc受体(wang等人《癌症免疫学研究》，2(9):846-56(2014年))。在其他实施例中，所述抗体包含一个轻链恒定区，所述轻链恒定区为人κ或λ恒定区。在其他实施例中，所述抗pd-1抗体或其抗原结合部分为mab或其抗原结合部分。在本发明所述任何治疗方法(包括抗pd-1抗体给药)的某些实施例中，所述抗pd-1抗体为纳武单抗。在其他实施例中，所述抗pd-1抗体为派姆单抗。在其他实施例中，所述抗pd-1抗体选自第8,008,449号美国专利所述的人抗体17d8、2d3、4h1、4a11、7d3和5f4。在其他实施例中，所述抗pd-1抗体为medi0608(原名：amp-514)、amp-224或bgb-a317。由于抗pd-1和抗pd-l1靶向相同的信号通路，并且临床试验表明，其在肾细胞癌(rcc)等各种癌症中的疗效水平相似(参见brahmer等人(2012年)，新英格兰医学杂志，366:2455-65；topalian等人(2012a)，新英格兰医学杂志，366:2443-54；wo 2013/173223)，在本发明所公开的任何治疗方法中，可用抗pd-1ab代替抗pd-l1抗体。在某些实施例中，所述抗pd-l1抗体为bms-936559(原名：12a4或mdx-1105)(参见第7,943,743号美国专利；wo 2013/173223)。在其他实施例中，所述抗pd-l1抗体为mpdl3280a(也称为rg7446)(参见herbst等人(2013年)，《临床肿瘤学杂志》，31(增刊):3000，摘要；第8,217,149号美国专利)或medi4736(khieif(2013年)，《2013年欧洲癌症大会会报》；2013年9月27日-10月1日；荷兰阿姆斯特丹，摘要802)。在某些实施例中，与上述pd-l1抗体进行交叉竞争从而与人pd-l1结合或与上述pd-l1抗体结合人pd-l1同一表位区的抗体为mab。向人类受试者给药时，这些交叉竞争抗体可为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。可通过本领域众所周知的方法制备和分离此类嵌合、人源化或人mab。
[0105]
抗pd-l1抗体
[0106]
在某些实施例中，本技术包括用抗pd-l1抗体代替抗pd-1抗体。在一个实施例中，所述抗pd-l1抗体抑制pd-l1受体(即，pd-1)与其配体pd-l1的结合。适用于本发明的抗pd-l1抗体包括从包含一个或多个vh和/或v
l
的抗体开始进行工程化改造的抗体(序列如本发明所述)，所述工程化改造抗体的特性较起始抗体有所改变。可通过旨在对本发明经修饰的抗pd-1抗体进行工程化改造的上述各种修饰，对抗pd-l1抗体进行工程化改造。
[0107]
在某些实施例中，用于本方法的抗pd-l1抗体包括第wo 2016/176503号国际专利申请中所述的mab 28-8。在其他实施例中，适用于本发明所述组合的抗pd-l1抗体包括mab 28-1、28-12、29-8和20-12(如第wo 2016/176503号国际专利申请所述)或其抗原结合部分，例如，包括fab、f(ab')2fd、fv和scfv、di-scfv或bi-scfv和scfv-fc片段、双体、三体、四体以及分离cdr。
[0108]
抗ctla-4抗体
[0109]
本发明所述的抗ctla-4抗体与人ctla-4结合，从而破坏ctla-4与人b7受体的相互作用。由于ctla-4与b7的相互作用可转导信号，导致携带ctla-4受体的t细胞失活，破坏所述相互作用可有效诱导、增强或延长此类t细胞活化，从而诱导、增强或延长免疫应答。
[0110]
第6,984,720号和第7,605,238号美国专利公开了以高亲和力与ctla-4特异性结合的humab。第5,977,318号、第6,051,227号、第6,682,736号和第7,034,121号美国专利对其他抗pd-1mab进行了说明。第6,984,720号和第7,605,238号美国专利中所公开的抗pd-1humab具有以下一种或多种特性：
[0111]
(a)以一定的结合亲和力与人ctla-4特异性结合，所述结合亲和力由至少约107m-1
、约109m-1
、约10
10
m-1-10
11
m-1
或更高的平衡结合常数(ka)表示(通过biacore分析确定)；
[0112]
(b)动力学结合常数(ka)至少为约103、约104或约105m-1
s-1
；
[0113]
(c)动力学解离常数(kd)至少为约103、约104或约105m-1
s-1
；以及
[0114]
(d)抑制ctla-4与b7-1(cd80)和b7-2(cd86)的结合。
[0115]
适用于本发明的抗ctla-4抗体包括与人ctla-4特异性结合并具有上述至少一种、至少两种或至少三种特性的mab。
[0116]
如第6,984,720号美国专利所述，示例性临床抗ctla-4抗体为人mab 10d1(现在称为伊匹单抗，以商品名出售)。伊匹单抗是一种抗ctla-4抗体，适用于本发明所公开的方法。伊匹单抗是一种全人igg1单克隆抗体，可阻断ctla-4与其b7配体的结合，从而刺激t细胞活化，并延长晚期黑色素瘤患者的总生存期(os)。
[0117]
适用于本方法的另一种抗ctla-4抗体为替西木单抗(也称为cp-675,206)。替西木单抗是一种人igg2单克隆抗ctla-4抗体。wo2012/122444、第2012/263677号美国出版物或wo 2007/113648a2对替西木单抗进行了说明。
[0118]
适用于所公开合成物的抗ctla-4抗体还包括分离抗体，所述分离抗体与人ctla-4特异性结合，并与伊匹单抗或替西木单抗进行交叉竞争，从而与人ctla-4结合，或与伊匹单抗或替西木单抗结合人ctla-4的同一表位区。在某些实施例中，与伊匹单抗或替西木单抗进行交叉竞争从而与人ctla-4结合或与伊匹单抗或替西木单抗结合人ctla-4同一表位区的抗体为包含一条人igg1同种型重链的抗体。向人类受试者给药时，这些交叉竞争抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。适用的抗ctla-4抗体还包括上述抗体的抗原结合部分，如fab、f(ab’)2、fd或fv片段。
[0119]
尿石素施用/给药方案
[0120]
本发明所述的组合涉及在接种疫苗前2-16周，按每天1.7-6.0mmol(例如，每天1.7-2.7mmol或每天2.8-6.0mmol)的日剂量，通过口服给药向受试者施用采用化学式(i)的尿石素或其盐。如下所述，与2000mg的较高剂量相比，优选施用250mg-1000mg尿石素a(对应于约1.1-4.4mmol)会获得令人惊奇的良好药代动力学特性。在一个实施例中，剂量为250mg/天，在一个替代实施例中，剂量为500mg/天，在另一个实施例中，剂量为1000mg/天。
[0121]
在另一个实施例中，给药剂量选自：
[0122]-250mg，每天一次或两次；
[0123]-500mg，每天一次或两次；
[0124]-750mg，每天一次或两次；
[0125]-1000mg，每天一次或两次；
[0126]-1250mg，每天一次或两次；或
[0127]-1500mg，每天一次或两次
[0128]
本发明所述的方法涉及每天施用采用化学式(i)的化合物或其盐或包含所述化合物或盐的合成物。在某些实施例中，所述化合物或合成物每天给药一次，即，所述化合物或合成物应每24小时至少给药一次。在其他实施例中，所述化合物或包含所述化合物的合成物每天多次给药，例如，每天两次、每天三次或每天四次。在这种情况下，将日剂量分为多个剂量。在一个实施例中，每天给药一次，在第二个实施例中，每天给药两次，在第三个实施例中，每天给药三次。
[0129]
本发明所述的方法通常需要在几个月的时间内每天施用采用化学式(i)的化合物或其盐或包含所述化合物或盐的合成物。在某些实施例中，所述方法可能涉及在至少2周、3周、4周、5周、6周、8周、12周、4个月、6个月或至少1年的时间内每天施用采用化学式(i)的化合物或其盐。在某些实施例中，所述方法包括在至多3个月、至多6个月、至多1年、至多2年或至多5年的时间内每天施用所述化合物或其盐。在某些实施例中，所述方法包括在21天-5年、21天-2年、21天-1年、21天-6个月、21天-12周、28天-5年、28天-2年、28天-1年、28天-6个月、28天-4个月、28天-12周、6周-2年、6周-1年、8周-1年或8周-6个月的时间内每天施用所述化合物或其盐。
[0130]
本发明所述的方法需要每天施用一定剂量采用化学式(i)的化合物或其盐，即0.7mmol-2.7mmol，每天一次或两次)。在某些实施例中，给药剂量为2.0-2.5mmol。在某些实施例中，给药剂量约为1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6或2.7mmol。在其他实施例中，给药剂量约为2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0mmol。在某些优选实施例中，所述方法涉及每天施用一定量采用化学式(i)的化合物或其盐(例如，尿石素a)，即约2.2mmol，每天一次或两次。所施用化合物的精确重量取决于所用化合物的分子量。例如，尿石素a的分子量为228g/mol(因此，2.20mmol为501.6mg)，尿石素b的分子量为212g/mol(因此，2.20mmol为466.4mg)。
[0131]
在另一个实施例中，本发明所述的方法需要每天施用一定剂量采用化学式(i)的化合物或其盐，即，2.8mmol-6.0mmol，每天一次或两次。在某些实施例中，给药剂量为4.0-4.8mmol。在某些实施例中，给药剂量约为2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、
3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0mmol。在某些优选实施例中，所述方法涉及每天施用一定量采用化学式(i)的化合物或其盐(例如，尿石素a)，即约4.4mmol，每天一次或两次。所施用化合物的精确重量取决于所用化合物的分子量。例如，尿石素a的分子量为228g/mol(因此，4.40mmol为1003.2mg)，尿石素b的分子量为212g/mol(因此，4.40mmol为932.8mg)。
[0132]
在某些实施例中，所述方法涉及每天施用一定量的尿石素a，即400-600mg，每天一次或两次。在一个优选实施例中，所述方法涉及施用450-550mg的尿石素a，更优选约500mg，每天一次或两次。
[0133]
在其他实施例中，所述方法涉及施用一定量的尿石素a，即700-1300mg、750-1250mg、800-1200mg、850-1150mg或900-1100mg，每天一次或两次。在一个优选实施例中，所述方法涉及施用一定量的尿石素a，即950-1150mg，每天一次或两次，更优选约1000mg，每天一次或两次。
[0134]
在某些优选实施例中，所述方法涉及向受试者施用一定量的尿石素a，即4.5-11mg/kg/天，如4.5-8.5mg/kg/天。在另一个实施例中，所述方法涉及向受试者施用一定量的尿石素a，即5-9mg/kg/天。在另一个实施例中，所述方法涉及向受试者施用一定量的尿石素a，即6.0-8mg/kg/天。
[0135]
在其他优选实施例中，所述方法涉及向受试者施用一定量的尿石素a，即9-18mg/kg/天，如9-17mg/kg/天。在另一个实施例中，所述方法涉及向受试者施用一定量的尿石素a，即10-17mg/kg/天。在另一个实施例中，所述方法涉及向受试者施用一定量的尿石素a，即11-16mg/kg/天。
[0136]
结合500mg剂量和1000mg剂量的给药方案可能很有利，例如，结合1000mg第一剂量和500mg第二剂量(几小时后)的每天两次给药方案。所述500mg剂量可在1000mg剂量后6-18小时施用，例如，在1000mg剂量后8-12小时，例如，在1000mg剂量后约12小时。因此，根据本发明的另一个方面，提供了使用采用化学式(i)的化合物治疗疾病的情况，包括采用1000mg第一剂量和500mg第二剂量的每天两次给药方案，其中，两剂间隔6-18小时。
[0137]
可在任何适当时间施用采用化学式(i)的化合物或其盐或包含所述化合物或盐的合成物，例如，可在睡后的早上或晚上施用。在某些实施例中，优选大约在每天的相同时间执行所述方法，例如，在给定时间点的15、30、60或120分钟内。
[0138]
免疫疗法施用/给药方案
[0139]
由治疗医生根据临床指征选择免疫疗法治疗的适当剂量。此类治疗可包括小分子化合物或大分子，如抗体。
[0140]
例如，施用治疗有效量的抗体或其功能部分。一般而言，治疗有效量可因受试者的年龄、身体状况和性别以及受试者病症的严重程度而有所不同。抗体或其功能部分的治疗有效量为约0.001-30mg/kg体重、约0.01-25mg/kg体重、约0.1-20mg/kg体重或约1-10mg/kg体重。为了达到所观察的治疗效果，必要时，可调整剂量。
[0141]
在某些实施例中，施用抗体或其功能部分。单独施用抗体，剂量为至少约0.1、至少约0.3、至少约0.5、至少约1、至少约3、至少约5、至少约10或至少约20mg/kg，例如，至少约1-10mg/kg、至少约1-3mg/kg、至少约3mg/kg、至少约1mg/kg。可按至少约每周一次、至少约每2周一次、至少约每3周一次、至少约每4周一次、至少约每月一次的给药频率施用抗体或其功
能部分，最多给药6-72次，或只要观察到临床获益，或直至出现难处理的毒性或疾病进展。在某些实施例中，以约1mg/kg或约3mg/kg的剂量施用抗体或其功能部分。在某些实施例中，所述序列方案包括按约每周一次、约每2周一次、约每3周一次、约每4周一次或每月一次的给药频率向受试者施用所述抗体或其功能部分，共给药6-72次，或只要观察到临床获益，或直至出现难处理的毒性或疾病进展。在其他实施例中，按约每3周一次的给药频率，以约1mg/kg的剂量施用所述抗体或其功能部分，最多给药48次。
[0142]
在一个实施例中，每天施用采用化学式(i)的化合物，每1-4周(如每2-4周，例如，每2周或3周)施用免疫疗法治疗(例如，抗体)。一般而言，治疗持续时间取决于数月缓解情况。
[0143]
可单次团注施用抗体，在给药后的最长时间内使抗体循环水平最大化。在团注给药后，还可进行连续输注。
[0144]
合成物
[0145]
本发明所述的方法优选涉及口服采用化学式(i)的化合物或其盐。可使用包含采用化学式(i)的化合物或其盐的任何适当口服合成物。因此，设想使用包含采用化学式(i)的化合物并适用于口服给药的各种合成物。因此，在某些实施例中，以口服合成物(包含采用化学式(i)的化合物或其盐以及一种或多种适用于口服给药的赋形剂)的形式施用采用化学式(i)的化合物或其盐。口服合成物可包括丸剂、片剂、胶囊剂、囊片、锭剂、软锭剂、颗粒、混悬粉剂、口服溶液剂、口服混悬剂、口服乳剂、糖浆剂等剂型的合成物。
[0146]
在本发明的另一个实施例中，通过本领域的技术人员已知的任何给药方法(如肌肉内、舌下、皮肤、吸入、眼和耳)施用采用化学式(i)的化合物。
[0147]
合成物(包含采用化学式(i)的化合物)可为任何适用于预期应用的物理剂型，例如，它们可为固体(例如，片剂或胶囊剂)、半固体(例如，软凝胶)或液体(包括乳剂)剂型。在某些情况下，所述合成物可为粘性液体或糊剂。半固体剂型同样可包含本领域的常规赋形剂。例如，所述赋形剂可提供所需硬度、保质期和味道，从而确保所述合成物的味道可接受，外观精美，储存稳定性良好。半固体剂型可为糊剂。如果所述合成物为软凝胶，则可在带壳胶囊中提供所述合成物。所述壳可为常规类型，例如，可为软明胶壳。例如，也可在硬胶囊型外壳中提供所述合成物。液体合成物可为口服药物、膳食补充剂或饮料。液体制剂可为溶液、乳剂、浆液等半液体。例如，液体合成物中赋形剂的保质期、外观、味道和口感可确保所述合成物的味道可接受，外观精美，储存稳定性良好。在某种稀释水平下，受试者可能需要在饮用前将饮品摇匀，使活性成分均匀悬浮。
[0148]
在某些优选实施例中，所述方法包括以微粉化的形式施用采用化学式(i)的化合物或其盐(例如，尿石素a)。微粉化使采用化学式(i)的化合物可迅速分散或溶解。可通过本领域已确立的方法实现微粉化，例如，可采用压力粉碎、锤碎、普通或离心粉碎或气流粉碎(例如，螺旋气流粉碎或流化床气流粉碎)方法。气流粉碎尤其适用。如果使用微粉化化合物，则所述化合物的d
50
粒径优选小于100μm，即，50％的化合物(按质量计)的粒径小于100μm。更优选地，所述化合物的d
50
粒径小于75μm，例如，小于50μm、小于25μm、小于20μm、小于10μm。更优选地，所述化合物的d
50
为0.5-50μm，例如，0.5-20μm、0.5-10μm、1.0-10μm、1.5-7.5μm、2.8-5.5μm。优选地，所述化合物的d
90
粒径小于100μm。更优选地，所述化合物的d
90
粒径小于75μm，例如，小于50μm、小于25μm、小于20μm、小于15μm。所述化合物的d
90
优选为5-100μm，
例如，5-50μm、5-20μm、7.5-15μm、8.2-16.0μm。优选地，所述化合物的d
10
为0.5
–
1.0μm。优选地，采用化学式(i)的化合物或其盐(例如，尿石素a)的d
90
为8.2-16.0μm，d
50
为2.8-5.5μm，d
10
为0.5-1.0μm。
[0149]
在另一个实施例中，采用化学式(i)的化合物或其盐的粒径分布选自以下一项：
[0150]
(i)d
50
粒径为0.5-50μm，d
90
粒径为5-100μm；
[0151]
(ii)所述化合物的d
90
粒径为8.2-16.0μm，d
50
粒径为2.8-5.5μm，d
10
粒径为0.5-1.0μm；
[0152]
(iii)采用化学式(i)的化合物的d
50
粒径为0.5-20μm，d
90
粒径为5-50μm；
[0153]
(iv)采用化学式(i)的化合物的d
50
粒径小于50μm，d
90
粒径小于75μm；
[0154]
(v)采用化学式(i)的化合物的d
50
粒径小于25μm，d
90
粒径小于50μm；
[0155]
(iv)采用化学式(i)的化合物的d
50
粒径小于10μm，d
90
粒径小于20μm；
[0156]
(v)采用化学式(i)的化合物的d
50
粒径小于10μm，d
90
粒径小于15μm；或
[0157]
(vi)采用化学式(i)的化合物的d
50
粒径小于10μm，d
90
粒径小于20μm；
[0158]
包含一种尿石素或其盐以及一种中链甘油三酯的合成物
[0159]
在某些优选实施例中，以包含：a)一种中链甘油三酯；以及b)采用化学式(i)的化合物或其盐的合成物的形式施用采用化学式(i)的化合物或其盐(例如，尿石素a)。在这些实施例中，优选将采用化学式(i)的化合物(例如，尿石素a)微粉化。
[0160]
通过选择适当的中链甘油三酯和赋形剂，可根据相关产品要求调整所述合成物的物理剂型。例如，在某些实施例中，所述合成物可为药物合成物。在某些实施例中，所述合成物可为营养合成物。
[0161]
在许多情况下，合成物(包含一种采用化学式(i)的化合物以及一种中链甘油三酯)也为粘性液体或糊剂，可在受试者的日常饮食中作为一人份补充剂提供(例如，在棒状胶囊、凝胶胶囊、软凝胶胶囊或硬胶囊中，或在饮品中稀释)；或者，可作为一餐的一部分或作为整餐提供。
[0162]
如果本发明所述的方法涉及使用包含一种中链甘油三酯的合成物，则所述合成物中的中链甘油三酯含量通常为至少1％w/w，例如，至少5％w/w、至少10％w/w、至少15％w/w。所述合成物中的中链甘油三酯含量优选为大于等于20％w/w，例如，大于等于25％w/w(按重量计)、大于等于30％w/w(按重量计)。例如，所述合成物中的中链甘油三酯含量可为1-40％w/w、2-40％w/w、5-40％w/w；10-40％w/w；1-99％w/w、5-99％w/w、10-99％w/w、20-99％w/w、5-90％w/w、10-90％w/w，例如，20-90％w/w、20-80％w/w、30-80％w/w、30-70％w/w、30-60％w/w、30-50％w/w、30-40％w/w、30-35％w/w。例如，所述合成物中的中链甘油三酯含量可为40-70％w/w，例如，50-70％w/w、55-65％w/w。
[0163]
在此类合成物中，所述合成物中采用化学式(i)的化合物的含量为0.1-80％w/w，例如，0.1-60％w/w、0.25-50％w/w。例如，所述合成物中采用化学式(i)的化合物的含量可为0.5-50％w/w。如果作为一餐的一部分或作为整餐提供所述合成物，则所述合成物中采用化学式(i)的化合物的含量可为0.25-5％w/w，例如，0.3-3％w/w。如果在受试者的日常饮食中作为一人份补充剂提供所述合成物，则所述合成物中的尿石素含量通常为20-80％w/w，例如，20-40％w/w、25-35％w/w。例如，所述合成物中的尿石素含量可为26-34％w/w，例如，28-33％w/w、29-32％w/w、29-31％w/w。
[0164]
在此类合成物中，所述中链甘油三酯组分与采用化学式(i)的化合物的重量比通常为0.01:1-100:1，例如，0.5:1-100:1、0.5:1-50:1、0.5:1-5:1；或1:1-75:1、1:1-50:1、1:1-20:1、1:1-10:1、1:1-2.5:1、1:1-2:1、1:1-1.5:1。所述重量比可为0.01:1-10:1，例如，0.1:1-10:1、0.01:1-5:1、0.01:1-0.1:1。
[0165]
在某些优选实施例中，本发明所述的方法涉及施用包含一种填料的软凝胶胶囊，其中，所述填料包含采用化学式(i)的化合物或其盐(例如，尿石素)以及一种或多种中链甘油三酯。在这些实施例中，优选将采用化学式(i)的化合物或其盐(例如，尿石素a)微粉化。在使用软凝胶胶囊的实施例中，可使用常规成分生产所述壳组分。
[0166]
中链甘油三酯属于化合物，化学式为ch2(or1)-ch(or2)-ch2(or3)，式中，r1、r2和r3为中链脂肪酸基团，通用化学式为
–
c(＝o)(ch2)nch3，式中，n为4-10，例如，6-8。中链脂肪酸是包含一个由6-12个碳原子组成的脂肪族尾的脂肪酸。所述脂肪族尾主要处于饱和状态。特定中链脂肪酸包括己酸(六碳酸，c6:0)、辛酸(八酸，c8:0)、癸酸(十烷酸，c10:0)和月桂酸(十二烷酸，c12:0)。也可存在少量的肉豆蔻酸(十四烷酸，c14:0)。最常用的中链甘油三酯通常有辛酸和癸酸甘油三酯混合物，包含95％或以上的饱和脂肪酸。本发明所述方法中所用优选合成物中的中链甘油三酯组分可包括均质单中链甘油三酯化合物类型；更常见地，所述中链甘油三酯组分为两种或多种不同中链甘油三酯组分的混合物。
[0167]
《欧洲药典》将中链甘油三酯描述为从可可椰子(椰子)胚乳的干硬部分或从油棕(非洲油棕)的干胚乳中提取的固定油。《欧洲药典》和uspnf均包含中链甘油三酯规范，要求特定脂肪酸的含量如下：己酸(c6)≤2.0％；辛酸(c8)50.0-80.0％；癸酸(c10)20.0-50.0％；月桂酸(c12)≤3.0％；以及肉豆蔻酸(c14)≤1％。
[0168]
用于优选合成物中的中链甘油三酯包括甘油三酯和脂肪酸链的混合物，所含比例如下：c6≤5％；c8 50-70％；c10 30-50％；以及c12≤12％，例如，c6≤0.5％；c8 55-65％；c1035-45％；c12≤1.5％。
[0169]
用于优选合成物中的中链甘油三酯可来自任何已知来源或其他适当的来源。
[0170]
用于本发明所述方法的合成物可有利包含一种或多种磷脂。特别优选的磷脂为磷脂酰胆碱。至少部分由于磷脂酰胆碱具有两亲性，例如，由于作为乳化剂的特性，磷脂酰胆碱带来诸多优势。
[0171]
磷脂(尤其是磷脂酰胆碱)的一个极有用来源为卵磷脂，用于本发明所述方法的合成物有利包含卵磷脂。当合成物中存在卵磷脂时，所述合成物中的卵磷脂含量通常为至少0.5％w/w，优选至少1％w/w。所述所述合成物中的卵磷脂含量优选为大于等于10％w/w，例如，大于等于20％w/w(按重量计)、大于等于30％w/w(按重量计)。例如，所述所述合成物中的卵磷脂含量为0.5-80％w/w，例如，1-80％w/w、20-80％w/w、40-80％w/w，或者，例如，0.5-75％w/w、1-40％w/w、30-40％w/w、30-35％w/w、30-75％w/w。或者，所述所述合成物中的卵磷脂含量可为0.5-5％w/w，例如，1-5％w/w、1-3％w/w、0.5-2％w/w、1-2％w/w。所述卵磷脂(如存在)与尿石素的重量比通常为0.02:1-3:1，例如，0.03:1-1.2:1、1:1-1.2:1、1.1:1-1.2:1。
[0172]
可用于本发明所述合成物中的商用卵磷脂通常包含以下主要组分：33
–
35％大豆油、20-21％肌醇磷脂、19
–
21％磷脂酰胆碱、8-20％磷脂酰乙醇胺、5
–
11％其他磷脂、5％游离碳水化合物、2-5％甾醇和1％水分。
[0173]
例如，可用于本发明所述合成物中的商用卵磷脂可富含磷脂酰胆碱，所述卵磷脂中的磷脂酰胆碱含量至少为5％w/w，例如，所述卵磷脂中的磷脂酰胆碱含量至少为10％w/w、所述卵磷脂中的磷脂酰胆碱含量至少为15％w/w、所述卵磷脂中的磷脂酰胆碱含量至少为20％w/w、所述卵磷脂中的磷脂酰胆碱含量至少为25％w/w、所述卵磷脂中的磷脂酰胆碱含量至少为30％w/w、所述卵磷脂中的磷脂酰胆碱含量至少为32％w/w、所述卵磷脂中的磷脂酰胆碱含量至少为40％w/w。
[0174]
还可通过以下一个或多个工艺对卵磷脂进行修饰，从而调整其特性：对特定磷脂进行醇提，以不同磷脂的修饰比率产生一种卵磷脂；丙酮提取，从而去除油，产生粉状或颗粒状磷脂混合物；作为载体在蛋白上喷雾干燥；使用高熔点单甘油酯和双甘油酯等合成乳化剂进行喷雾冷却，产生片状或粉状产物；通过酶作用(磷脂酶，尤其是磷脂酶a2)进行修饰，尤其是部分水解，产生具有明显乳化行为的卵磷脂；脂肪酸基团被酸和碱水解；乙酰化；以及脂肪酸链和氨基羟基化。
[0175]
在某些实施例中，所述方法包括施用包含一种采用化学式(i)的化合物或其盐、一种中链甘油三酯以及一种乳化剂(例如，卵磷脂)的合成物。
[0176]
例如，药物合成物(包含采用化学式(i)的化合物或其盐)可包括其他药物活性化合物。
[0177]
如上所述，合成物中的其他组分可为化合物，对受试者没有健康益处，但以其他方式(例如，其味道、质地或保质期)改善所述合成物。因此，所述合成物可进一步包含选自以下几项的一种或多种化合物：乳化剂、着色剂、防腐剂、胶、定型剂、增稠剂、甜味剂和调味剂。
[0178]
适当的乳化剂、稳定剂、着色剂、防腐剂、胶、定型剂和增稠剂在乳剂及其他半液体生产领域众所周知。乳化剂可包括一种或多种磷脂酰胆碱、卵磷脂、聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80(吐温60和吐温80))以及单硬脂酸甘油酯(gms)。单硬脂酸甘油酯(glycerol monostearate)也称为单硬脂酸甘油酯(glyceryl monostearate)。
[0179]
稳定剂可用于本发明所述的合成物中。许多合成物均为稳定混悬剂，无需添加稳定剂。稳定混悬剂不会随着时间的推移而进行相分离。对于某些合成物，可添加稳定剂，从而提高稳定性。用于本发明所述合成物中的适当稳定剂包括单硬脂酸甘油酯(gms)、二氧化硅和植物起酥油。示例性稳定剂为gms，本发明所述的优选合成物包含gms。其特性也使gms成为良好的磷脂溶剂(如就像在卵磷脂中发现的那样)。gms以两种多晶型物的形式存在：α型可分散、呈泡沫状，可用作乳化剂或防腐剂。β型适用于蜡模。在50℃温度下加热时，所述α型转化为β型。
[0180]
gms分为两个等级：40-55％单甘油酯和90％单甘油酯。《欧洲药典》所定义的40-55％单甘油酯将gms描述为单酰甘油(主要为单硬脂酰甘油)以及一定量甘油二酯和甘油三酯的混合物。特别是，40-55级包含40-55％的单酰甘油、30-45％的二酰甘油和5-15％的三酰甘油。99％级中的单甘油酯含量不小于90％。商用gms产品中的单甘油酯为单硬脂酸甘油酯和单棕榈酸甘油酯的混合物，以可变比例混合。《欧洲药典》根据混合物中硬脂酸酯的比例进一步将单硬脂酸甘油酯40-55分为三种类型。第1种类型包含40.0-60.0％的硬脂酸，棕榈酸和硬脂酸的总和不大于90％。第2种类型包含60.0-80.0％的硬脂酸，棕榈酸和硬脂酸的总和不大于90％。第3种类型包含90.0-99.0％的硬脂酸，棕榈酸和硬脂酸的总和不大于
96％。可将任何形式的gms用于所述合成物中。
[0181]
在某些实施例中，所述方法包括施用包含一种中链甘油三酯、采用化学式(i)的化合物或其盐(例如，尿石素a)和一种稳定剂(例如，单硬脂酸甘油酯)的合成物。在某些实施例中，所述方法涉及施用包含一种乳化剂和一种稳定剂的合成物。
[0182]
也可使用金属螯合剂或多价螯合剂，如乙二胺四乙酸(edta)的钠钙盐。本发明所述制剂中可包含的其他组分包括聚乙二醇、二氧化硅、植物起酥油和蜂蜡。
[0183]
在用于本发明所述方法的合成物中，调味剂可能有益。在液体或半液体合成物中，例如，加入果酱或果泥，可产生水果味。典型的调味剂包括草莓、覆盆子、蓝莓、杏子、石榴、桃子、菠萝、柠檬、橘子和苹果。一般而言，水果调味剂包括水果提取物、果脯或果泥，甜味剂、淀粉、稳定剂、天然和/或人工香料、着色剂、防腐剂、水和柠檬酸或其他适当酸的任何组合可用于控制ph值。
[0184]
用于本发明所述方法的单位剂量合成物优选包含250mg或500mg采用化学式(i)的化合物，例如，250mg或500mg尿石素a。例如，单位剂量可为片剂或胶囊剂、装在可容纳单剂量(例如，50-500ml、100-300ml，例如，250ml或500ml)的瓶子或袋子等容器中的饮品。在另一个替代示例中，所述单位剂量优选为软凝胶胶囊剂，例如，包含250mg尿石素a。
[0185]
代表性尿石素合成物如下表所示：
[0186]
代表性合成物a
[0187][0188]
免疫疗法治疗合成物
[0189]
本发明提供了包含免疫疗法治疗(例如，用于本发明所述组合的抗体或融合蛋白)的合成物。本发明还提供了包含抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla4抗体或融合蛋白的合成物。所述合成物包括原料药合成物，在药物合成物(例如，不纯或非无菌合成物)以及可用于制备单位剂型的药物合成物(即，适合向受试者或患者给药的合成物)的生产中有用。所述合成物(例如，药物合成物)包含有效量的免疫疗法治疗，如抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla4抗体或融合蛋白以及可药用载体。在特定实施例中，所述合成物(例如，药物合成物)包含有效量的一种或多种抗体或蛋白，如抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla4抗体或融合蛋白。
[0190]
可使用佐剂或赋形剂等一种或多种可药用载体，以任何常规方式配制药物合成物。
[0191]
佐剂包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)或mf59c.1佐剂。
[0192]
适当的药物载体包括无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。在一个实施例中，所述药物合成物静脉内给药时，水为载体。也可将盐水以及葡萄糖和甘油水溶液用作液体载体，尤其适用于注射溶液。
[0193]
适当的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅
胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如需要，所述合成物还可包含少量的润湿剂、乳化剂或ph值缓冲剂。这些合成物可为溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、持续释放制剂等。
[0194]
在一个特定实施例中，根据本发明所述的方法，以药物合成物的形式向受试者施用用于本发明所述组合的免疫疗法治疗。
[0195]
一般而言，单独提供或在单位剂型中混合所述药物合成物(包含免疫疗法治疗，如抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla4抗体或融合蛋白)的各个组分，例如，气封容器(如注明活性剂用量的安瓿瓶或小袋)中的冻干粉剂或无水浓缩物。如果通过输注施用所述免疫疗法治疗，如抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla4抗体或融合蛋白，则可使用装有无菌医药级水或盐水(例如，pbs)的输液瓶进行施配。如果通过注射施用所述免疫疗法治疗，如抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla4抗体或融合蛋白，则可提供一安瓿瓶的无菌注射用水或盐水，在施用前可将成分混合。
[0196]
在某些实施例中，可配制通过本领域的技术人员已知的任何方法(包括但不限于胃肠外(例如，皮下、静脉内、肿瘤内或肌肉内)给药)施用的所述免疫疗法治疗，如抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla4抗体或融合蛋白。在一个实施例中，配制适用于局部或全身胃肠外给药(例如，肿瘤内给药)的所述免疫疗法治疗，如抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla4抗体或融合蛋白。在一个特定实施例中，分别配制适用于皮下或静脉内给药的所述免疫疗法治疗，如抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla4抗体或融合蛋白。在一个实施例中，在药学上相容的溶液中配制所述免疫疗法治疗，如抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla4抗体或融合蛋白。
[0197]
可配制通过注射进行胃肠外给药(例如，通过团注或连续输注)的所述免疫疗法治疗，如抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla4抗体或融合蛋白。注射用制剂可以单位剂型的形式存在，例如，在添加防腐剂的安瓿瓶或多剂量容器中。所述合成物可为存在于油性或水性运载体中的混悬剂、溶液剂或乳剂，或可包含悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，所述活性成分可呈粉末状，使用前，可与无菌无热原水等适当的运载体混合。
[0198]
为免生疑问，可在相同合成物或单独合成物中配制适用于同时、单独或按顺序给药的本发明所述组合。
[0199]
试剂盒也在本发明的范围内，包括药物试剂盒，其中包含用于治疗的本发明所述组合。试剂盒通常包括一个注明试剂盒内容物预期用途的标签以及使用说明书。术语“标签”包括在试剂盒上提供的、试剂盒随附的或以其他方式随附的任何书面或记录材料。药物试剂盒的某些实施例包含一种尿石素(例如，尿石素a)以及一种免疫疗法治疗(如单位剂型的免疫检查点阻断疗法)。
[0200]
在一个实施例中，提供了一种用于治疗t细胞活化抑制相关疾病的试剂盒，包含：
[0201]
(a)一种尿石素；
[0202]
(b)一种免疫疗法治疗，例如，免疫检查点阻断疗法；
[0203]
(c)一个或多个容器，用于盛放所述药剂；以及
[0204]
(d)同时、单独或按顺序给药说明书(可选)。
[0205]
从最广义上使用术语“抗体或其功能部分”。其可为人造抗体，如通过常规杂交瘤技术、重组技术产生的单克隆抗体(mab)和/或其功能片段。其中可包括完整的免疫球蛋白
分子(例如，多克隆抗体、单克隆抗体(mab)、单特异性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、动物抗体(例如，骆驼抗体)、嵌合抗体)及其部分、片段、区域、肽或衍生物(通过任何已知技术提供，包括但不限于酶切、肽合成或重组技术)，例如，缺少轻链的免疫球蛋白、fab、fab'、f(ab')2、fv、scfv、抗体片段、双体、fd、cdr区或抗体中能够结合抗原或表位的任何部分或肽序列。在一个实施例中，所述功能部分为单链抗体、单链可变片段(scfv)、fab片段或f(ab')2片段。
[0206]
抗体或其功能部分据说“能够结合”分子，但前提是其能够与所述分子发生特异性反应，从而使所述分子与抗体结合。抗体片段或部分可能缺少完整抗体的fc片段，从循环中迅速清除，且非特异性组织结合性小于完整抗体。可使用本领域众所周知的方法由完整抗体产生抗体示例，例如，使用木瓜蛋白酶(产生fab片段)或胃蛋白酶(产生f(ab')2片段)等酶进行蛋白酶切。可通过上述任一方法或通过表达重组分子的一部分产生抗体部分。例如，可分离重组抗体的cdr区，并将其亚克隆到适当的表达载体中。
[0207]
在一个实施例中，抗体或功能部分为人抗体。使用人抗体对人类进行治疗，可降低因人类个体对非人类序列的免疫反应而产生副作用的可能性。在另一个实施例中，所述抗体或功能部分为人源化抗体。在另一个实施例中，抗体或功能部分为嵌合抗体。以这种方式，抗体或功能部分可包含目标序列，如目标结合位点。
[0208]
在一个实施例中，所述抗体可具有igg、iga、igm或ige同种型。在一个实施例中，所述抗体为igg。
[0209]
术语“癌症”是指以异常细胞快速、不受控制的生长为特征的一种疾病。癌细胞可局部扩散，或通过血流和淋巴系统扩散到其他身体部位。本发明对各种癌症示例进行了说明，包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。术语“肿瘤”和“癌症”在本发明中可互换使用，例如，这两个术语均包括实体瘤和液体瘤(例如，弥漫性或循环肿瘤)。在本发明中，术语“癌症”或“肿瘤”包括癌前和恶性肿瘤。
[0210]
术语“载体”是指与治疗剂一同给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体。
[0211]
术语“赋形剂”是指与药物的活性成分一起配制的物质，例如，为确保长期稳定，能够使包含少量有效活性成分的固体制剂膨胀(因此通常称为“膨胀剂”、“填料”或“稀释剂”)，或增强最终剂型中活性成分的治疗作用，如促进药物吸收、降低粘度或提高溶解度。
[0212]
缩略语“humab”是指人源化单克隆抗体。
[0213]
术语“卵磷脂”是指动物和植物组织中出现的任何一组脂肪物质，包括磷酸、胆碱、脂肪酸、甘油、糖脂、甘油三酯和磷脂(例如，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇)。从大豆和向日葵中获得的商用卵磷脂包括磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺和磷脂酸。可在己烷、乙醇、丙酮、石油醚或苯等非极性溶剂中通过化学萃取从其来源中获得或通过机械萃取获得卵磷脂。特别是，可通过萃取，从大豆、鸡蛋、牛奶、油菜籽、棉籽和向日葵等来源中获得卵磷脂。很容易买到用于可食用制剂中的商用卵磷脂。
[0214]
术语“免疫检查点阻断疗法”涉及治疗方法，即，消除t细胞活化抑制信号，使反应性t细胞战胜调控机制，并建立有效的免疫应答，例如，使肿瘤反应性t细胞建立有效的抗肿瘤应答。有关检查点阻断疗法综述，参见：wei等人(2018年)，《癌症发现》，8(8)，1-18。免疫检查点示例包括：pd-1、ctla-4、淋巴细胞活化基因3(lag-3)、t细胞免疫球蛋白和itim结构
域(tigit)以及t细胞免疫球蛋白3(tim-3)。
[0215]
术语“免疫疗法治疗”是指其作用机制部分或主要通过增强个体免疫应答起作用的任何治疗。
[0216]
缩略语“mab”是指单克隆抗体。
[0217]
术语“pd-1拮抗剂”是指阻断pd-1对免疫系统的抑制作用的任何药剂。例如，pd-1拮抗剂包括直接阻断pd-1与其受体结合的药剂以及对pd-1活性具有变构效应的药剂。
[0218]
术语“可药用”是指经联邦或国家政府的监管机构批准或列入《美国药典》或其他公认药典中，可用于哺乳动物(尤其是人类)。
[0219]
术语“程序性死亡1(pd-1)”是指属于cd28家族的免疫抑制受体。在体内，pd-1主要在先前活化的t细胞上表达，并与两个配体pd-l1和pd-l2结合。在本发明中，术语“pd-1”包括人pd-1(hpd-1)、hpd-1的变体、异构体和同系物以及与hpd-1至少具有一个共同表位的类似物。可在genbank中找到完整的hpd-1序列，登录号为u64863。
[0220]
术语“程序性死亡配体1(pd-l1)”是pd-1的两个细胞表面糖蛋白配体之一(另一个为pd-l2)，在与pd-1结合后，可下调t细胞活化和细胞因子分泌水平。在本发明中，术语“pd-l1”包括人pd-l1(hpd-l1)、hpd-l1的变体、异构体和同系物以及与hpd-l1至少具有一个共同表位的类似物。可在genbank中找到完整的hpd-l1序列，登录号为q9nzq7。
[0221]
术语“程序性死亡配体2(pd-l2)”是pd-1的两个细胞表面糖蛋白配体之一(另一个为pd-l1)，在与pd-1结合后，可下调t细胞活化和细胞因子分泌水平。在本发明中，术语“pd-l2”包括人pd-l2(hpd-l2)、hpd-l2的变体、异构体和同系物以及与hpd-l2至少具有一个共同表位的类似物。可在genbank中找到完整的hpd-l2序列，登录号为q9bq51。
[0222]
术语“单独”给药是指以非固定剂型同时、基本同时或按任何顺序向患者施用两种或多种化合物中的每一种。可能或可能不按指定的时间间隔施用每种化合物。
[0223]
术语“按顺序”给药是指在单独的操作中以非固定(单独)剂型向患者施用两种或多种化合物中的每一种。给药操作可能或可能不由指定的时间间隔连接，例如，在指定时间内施用化合物，如每14-21天一次。
[0224]
术语“同时”给药是指在一次操作中向患者施用两种或多种化合物中的每一种，如基本同时独立施用或在所述化合物可产生协同治疗作用的时间间隔内单独施用每种化合物。
[0225]
根据以下非限制性示例，对本发明进行了说明。
附图说明
[0226]
图1：源自造血干细胞的血细胞谱系。
[0227]
图2：结直肠癌的aom模型。在经对照品治疗的动物和经ua 200mpk(对应于2.28g ua/kg饮食)治疗的动物中采集的结肠粘膜苏木精-伊红染色的代表性图像。下图显示了经对照品治疗的动物、经尿石素a(ua)50mpk(ua ld)和ua 200mpk(ua hd)治疗的动物中病变数量(左图)及其平均大小(右图)的定量情况。
[0228]
图3：结直肠癌的aom模型。在经对照品治疗的动物和经ua 200mpk(对应于2.28g ua/kg饮食)治疗的动物中采集的结肠粘膜抗cd3免疫染色的代表性图像。下图显示了经对照品治疗的动物和经ua 200mpk(ua hd)治疗的动物中cd3阳性细胞数量(左图)和cd3阳性
细胞百分比(右图)的定量情况。
[0229]
图4：aptk类器官模型。对照饮食动物或ua 200mpk饮食动物中皮下注射aptk类器官异种移植瘤的肿瘤体积。
[0230]
图5：aptk类器官模型。经对照品治疗的动物(上图)和经ua 200mpk(尿石素a)治疗的动物中cd3阳性细胞数量(左图)和cd3阳性细胞百分比(右图)的定量情况。
[0231]
图6：aptk类器官模型。在经对照品治疗的动物和经ua 200mpk治疗的动物中采集的aptk类器官衍生肿瘤抗切割半胱天冬酶3免疫染色的代表性图像。下图显示了经对照品治疗的动物和经ua 200mpk(尿石素a)治疗的动物中切割半胱天冬酶3阳性细胞百分比的定量情况。
[0232]
图7：aptk类器官模型。结合抗cd8注射剂或其同种型q2d的对照饮食动物、ua 200mpk饮食动物中皮下注射aptk类器官异种移植瘤的肿瘤体积。
[0233]
图8：aptk类器官模型。结合抗pd1注射剂或其同种型q3d的对照饮食动物或ua 200mpk饮食动物中皮下注射aptk类器官异种移植瘤的肿瘤体积。*p《0.05；**p《0.01(在实验结束时对肿瘤大小进行曼-惠特尼检验)。
具体实施方式
[0234]
示例
[0235]
根据以下非限制性示例，对本发明进行了说明。
[0236]
示例1：在小鼠结直肠癌模型(aom模型)中，尿石素a(ua)降低病变发生率和大小，并增加肿瘤内的t细胞毒性细胞浸润
[0237]
无需使用硫酸葡聚糖钠，将氧化偶氮甲烷(aom)反复应用于雌性野生型fvb小鼠，即可获得散发性肿瘤发生模型。特别是，在野生型动物中每周腹膜内注射aom(10mg/kg)6次，诱导肿瘤。在18-24周后对小鼠进行分析。以每天50或200mg/kg小鼠(mpk)的剂量在饮食中加入尿石素a，或在开始6次aom注射前一周、在6周aom注射期间以及上述注射后约20周的时间内(共约27-30周)控制实验室饮食。在治疗期结束时，通过颈椎脱位对小鼠实行安乐死，采集肠组织。为了对病变数量进行计数和测量，使用苏木精和伊红对结肠组织进行染色。
[0238]
从图2中可以看出，使用200mpk ua对动物进行治疗，可显著减少结直肠癌aom模型中的病变数量。经ua治疗的小鼠中的病变似乎变小。
[0239]
为了确定是否可通过免疫原性作用至少部分解释此作用，还对结肠粘膜进行了cd3阳性细胞(t细胞谱系的一个标志物)检测。图3显示了抗cd3免疫染色的结果。在经200mpk ua治疗的动物中，结肠粘膜中的cd3阳性细胞往往增加，这便是积极募集t细胞以消除癌细胞的证据。
[0240]
示例2：尿石素a(ua)抑制aptk皮下异种移植瘤的生长，并增加肿瘤内的t细胞浸润
[0241]
将致瘤突变选择性引入基因apc(a)、p53(p)、tgf-beta1(t)和k-ras(k)中，生成结直肠癌类器官(此后也称为aptk类器官)。由于在c57/bl6遗传背景下产生aptk类器官，可将它们移植，在具有完整免疫系统的野生型bl6小鼠中生成肿瘤，从而研究对所产生肿瘤的免疫应答。在皮下移植前一周，向小鼠饲喂含尿石素a的饮食或对照饮食。通过卡尺测量进行肿瘤生长评估。对产生的肿瘤进行组织学分析。
[0242]
如图4所示，经ua 200mpk治疗动物的肿瘤体积明显小于接受对照饮食的动物，这表明，ua可阻止肿瘤生长。
[0243]
为了确定是否可通过免疫原性作用至少部分解释此作用，还对aptk衍生皮下肿瘤进行了cd3阳性细胞(一种t细胞谱系标志物)检测。图5显示了抗cd3免疫染色的结果。在经200mpk ua治疗的动物中，肿瘤浸润边缘的cd3阳性细胞往往减少，但肿瘤核的cd3阳性细胞往往增加，这便是积极募集t细胞以消除癌细胞的证据。
[0244]
图6显示了肿瘤的切割半胱天冬酶3(一种细胞凋亡标志物)染色情况。200mpk ua治疗可显著增加切割casp3染色，这表明，可诱导aptk类器官衍生肿瘤细胞凋零。
[0245]
示例3：尿石素a(ua)需要存在cd8 淋巴细胞才能促进其抗致瘤作用
[0246]
为了证明尿石素a的预期肿瘤抑制炎症作用是由于细胞毒性t细胞应答，在尿石素a治疗的同时，消灭cd8 细胞毒性t细胞。对于此模型，c57/bl6仍饲喂尿石素a 200mpk饮食或对照饮食。如上所述，开始饮食干预后一周，向小鼠皮下移植aptk类器官。从第3天开始，向这些小鼠腹膜内注射(每两天150μg)抗cd8或同种型对照抗体(bioxcell)5次，耗尽cd8 细胞毒性t细胞。如先前实验所示，用卡尺测量肿瘤生长。
[0247]
图7显示，当通过抗cd8治疗消灭cd8 细胞毒性t细胞时，ua失去抗肿瘤作用，这表明，ua的至少部分肿瘤治疗作用由免疫原性作用驱动。
[0248]
示例4：尿石素a(ua)与抗pd1免疫疗法产生协同作用
[0249]
如示例2所述，向c57bl/6小鼠皮下移植aptk类器官，饲喂尿石素a 200mpk饮食或对照饮食(在皮下注射前一周开始)，并腹膜内注射(从第5天开始，每三天200μg)阻断抗pd1或同种型对照抗体(bioxcell)4次。如先前实验所示，用卡尺进行肿瘤生长测量。
[0250]
图8显示，在对肿瘤生长的作用方面，单独的尿石素a(200mpk)(即，与同种型对照抗体)与抗pd1抗体治疗并无差异。但是，当抗pd-1和尿石素a共同给药时，我们观察到对减缓肿瘤生长具有显著的协同作用，这明确表明，与单独的抗pd1疗法相比，尿石素a对抗pd1疗法的生物抗肿瘤应答更强。
[0251]
等同
[0252]
已对本发明进行了广泛、一般地说明。本领域的普通技术人员很容易设想各种其他方法和/或结构，用于执行功能和/或获得本发明所述的结果和/或一个或多个优势，此类所有变更和/或修改均在本发明的范围内。更普遍地，本领域的技术人员很容易理解，本发明所述的所有参数、尺寸、材料和配置均用作示例，实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于使用本发明所述指导的具体应用。本领域的技术人员将认识到或能够仅通过常规实验确定本发明特定实施例的许多等同内容。因此，应理解，上述实施例仅用作示例，在所附权利要求和等同的范围内，可采用与具体说明及权利要求不同的方式实施本发明。本发明涉及本发明所述的各个特征、系统、构件、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果此类特征、系统、构件、材料、试剂盒和/或方法并不相互矛盾，则两个或多个此类特征、系统、构件、材料、试剂盒和/或方法的任何组合均在本发明的范围内。此外，通用发明范围内的各个更狭义物种和亚属分组也构成本发明的一部分。其中包括本发明的通用说明以及附带条件或负面限制，即，从所述属中删除任何标的物，无论是否在本发明中具体列举删除材料。
[0253]
参引合并
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息通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分，就像各个出版物均具体、单独表明通过本发明的引用，成为本发明的一部分。申请人保留实际将任何此类文章、专利、专利申请或其他实际和电子文件的任何及所有材料和信息纳入本技术的权利。